专利名称：在疾病的诊断与治疗中的PTHrP,其亚型及其拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)，其亚型及其拮抗剂在疾病特别是癌 症的诊断与治疗方面的应用。
背景技术：
众所周知，肿瘤是正常细胞通过一系列的逐步转化的结果。信号分子的激活尤其 是生长因子相关通路可能导致正常细胞的恶性转化。癌症死亡率与肿瘤转移扩散的能力有 关。肿瘤从原始点的扩散及其在特定组织插根的能力可能涉及多个步骤，同时肿瘤由非侵 入性向侵入性进展。由于PTHrP氨基或N端与甲状旁腺激素(PTH)氨基终端有很强的序列同源性， PTHrP最初被认为是恶性肿瘤高钙血症的一个介质。大部分晚期癌症和高钙血症患者有高 水平的血循环PTHrP，有或没有相关的溶骨骨转移。PTHrP与绝大多数可引起高钙血症的恶性肿瘤有关，其中包括乳腺、结肠、皮肤、肾 和肺等癌症，以及如淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤等恶性血液病。更重要的是，即便没有高 钙血症和升高的循环PTHrP水平，这些肿瘤组织中的PTHrP的表达仍然是升高的。此外，多 项研究表明，PTHrP可能是癌症患者的预后指标，并且与几种类型的癌症包括乳腺癌、前列 腺和结肠肿瘤的转移过程有关。还有研究建议，PTHrP刺激体外侵袭和体内骨转移。PTHrP 刺激骨转移的基本机制被认为是间接的，通过激活破骨细胞性骨吸收及在骨微环境内局部 生长因子的释放，反过来刺激骨内的肿瘤细胞生长。目前治疗病人骨转移癌主要目标是使 用如称为二膦酸盐类的药物，以便减少破骨细胞活性。因此，通过减少骨内肿瘤细胞PTHrP 产生，PTHrP抑制被确认为抑制骨内破骨细胞活性的潜在目标。针对PTHrP的N端的单克 隆抗体(mAb)已被成功地用于减少移植了人细胞株MDA-MB-231的裸鼠的溶骨性骨转移癌。 针对PTHrP的N末端的人化的单克隆抗体已产生，并且在裸鼠高钙血症和骨转移模型中证 明是有效的。用人化的针对PTHrP的N端的单克隆抗体治疗溶骨性骨转移的临床试验目前 正在进行。除了对骨转移过程的间接影响，多项研究建议PTHrP可能直接影响肿瘤细胞的生 长和侵袭能力。这些研究大部分是在体外进行，而且往往显示PTHrP刺激不同细胞株包括 乳腺、前列腺和黑素瘤的侵袭和迁移。除了骨转移研究外，体内研究数据是非常有限的。 一项研究表明PTHrP可能与肾肿瘤生长有关，并且向移植了人肾癌细胞的裸鼠施用针对 PTHrP的N末端的抗体能降低肿瘤生长和转移。因为PTHrP甲状旁腺激素样作用似乎位于其分子的氨基端部分，研究使用N末端 片段做体外及体内实验，特别是对于可以被甲状旁腺素(PTH)和PTHrPl-34激活的PTH/ PTHrP的1型受体的研究。这种受体有连接到G蛋白的7个跨膜区且属于G蛋白偶联受体(GPCRs)。配体结合导致腺苷酸环化酶(cAMP通路)和磷脂酶C(PLC)的激活。另一个PTH 受体(2型)已被克隆，由一个称为TIP的不同配体激活并且主要分布在中枢神经系统，而 PTHrP的1型受体在大多组织中广泛表达。此外，大多数乳腺癌同时表达PTHrP的1型受体 和PTHrP，并且此共表达预测不良存活。人类PTHrP基因结构比PTH要复杂得多。它有跨越超过二十(20)千碱基对(kb) 的基因组DNA，其选择性mRNA剪接会产生一百和三十九个氨基酸(139)，一百和四十一个氨 基酸(141)和一百和七十三个氨基酸(173)三种亚型。物种之间有强烈的序列同源性，但 低等动物中除犬基因外选择剪接尚未见报道。小鼠、大鼠、兔、牛和鸡的基因只会产生一百 和三十九(139)氨基酸组成的亚型。在PTHrP的C末端第111氨基酸氨以外，物种之间相 当分歧。长形式PTHrPl-173可能是人类特有的，但虽然有人建议在环状软骨生长发育中发 挥作用，它的功能目前未知。针对PTHrP的N端的抗体识别PTHrP所有亚型。尽管在这方面的研究已有多年，PTHrP尤其是其亚型在诊断和治疗疾病，特别是癌 症、肿瘤转移、溶骨性骨转移和高钙血症方面的作用还有待探索。
发明摘要本发明的一个实施方式是用PTHrP或其亚型作为疾病(包括几种类型癌症)的诊 断剂和治疗手段。本发明的进一步实施方式是抑制一个或多个PTHrP亚型，PTHrPl-173亚型更宜， 以治疗多种类型癌症的肿瘤生长和转移扩散。本发明的另一个实施方式是针对抗体，此抗体针对一个或多个PTHrP亚型的N端 部分，最好是氨基酸残基1-33，以及PTHrP的羧基端部分，最好是PTHrPl-173氨基酸残基 140到173或氨基酸残基151到169。本发明的另一个方面是针对PTHrP的C端部分(最好 是氨基酸残基140到173)的抗体，与针对PTHrP的N端部分的(最好是氨基酸残基1_33) 的抗体结合使用，去开发检测PTHrP的一个或多个亚型、具体亚型或片段的特异性免疫检 测方法。此检测方法包括(但不限于)三明治检测方法如IRMA、酶联免疫吸附试验和化学 发光检测方法。免疫测定法可用于特异地检测治疗前后PTHrP的一个或多个亚型或特定亚 型(最好是1-173)或其碎片。免疫测定法也可作多种癌症的预后指标，这些癌症表达PTHrP 的一个或多个亚型、具体亚型，最好是PTHrPl-173亚型或其碎片。本发明的另一个实施方式是确定哪些肿瘤表达一个或多个亚型、具体亚型，最好 是PTHrPl-173形或其片段以便提高治疗效果。本发明的另一个实施方式涉及到永生细胞向致瘤细胞的转变，使用一个或多个 PTHrP亚型(最好是亚型1-173)来研究；在封锁/中断一个或多个PTHrP亚型(最好是亚 型1-173)的产生后，一个或多个PTHrP亚型(最好是亚型1_173)对细胞生长和转移、削减 肿瘤生长和转移的影响；单克隆抗体的影响，这些抗体是针对所有PTHrP的亚型的N端部分 (最好是直接针对氨基酸残基1至33)和PTHrPl-173亚型的C末端，(最好针对氨基酸残 基 140-173)。本发明的另一个实施方式涉及方法和成像技术，以检测一个或多个PTHrP亚型或 具体亚型，最好是PTHrPl-173，或其碎片。本发明的另一实施方式是抑制肿瘤细胞生长、转移和入侵的一种方法。这种方
5法是给病人有效治疗量(如，消除或减少病人肿瘤负荷的剂量)的本发明的抗体，最好 是人化的或完全人的单克隆抗体，并且能与一个或多个PTHrP亚型或具体亚型(最好是 PTHrPl-173)，或其碎片结合。本发明的单克隆抗体，最好是人化的或完全人单克隆抗体，在 合适的载体中可以用作肠外用药，可以皮下、肌肉、静脉或肿瘤内注射。本发明的另一个实施方式是针对SiRNA和SiRNA构建，用来调节细胞内一个或多 个PTHrP亚型或特定的亚型(最好是PTHrPl-173)的活动水平。另一个实施方式是针对 siRNA和siRNA构建来调节、敲除或降低(例如敲低)一个或多个PTHrP亚型或特定的亚型 (最好是PTHrPl-173)的表达。本发明的进一步实施方式是针对对抗一个或多个PTHrP亚型(最好是PTHrPl-173 亚型)的方法，包括使用抗体(最好是单克隆抗体)、基因疗法(最好使用敲除或敲低技术 或siRNA (最好是siRNA))、以及针对PTHrP的亚型(最好是PTHrPl-173亚型)或其受体和 /或其信号分子、PTHrP肽片段(最好是起源于PTHrPl-173的C端的多肽片段)的特异性 拮抗剂。本发明的进一步实施方式是针对本发明的mAb的免疫化学衍生物，包括(但不限 于)(a)标记(如放射性标记、酶标记或荧光标记)的本发明的单克隆抗体(最好是人化 的或完全人单克隆抗体)，为了利用已知成像技术来诊断或检测肿瘤及肿瘤扩散(例如转 移)；及(b)本发明的mAb(最好是人化的或完全人的mAb)的免疫毒素复合物用于消融治 疗，其中本发明的抗体共轭到已知的细胞毒性、放射性或放射性标记部分(例如放射免疫 疗法)。本发明的进一步实施方式是针对分离的抗体，这种抗体能结合一个或多个亚型 (最好是一个或多个亚型)，或与PTHrPl-173亚型的C端部分特异性地结合，其中抗体可以 被连接到一个诊断剂或治疗剂。本发明的进一步实施方式是针对产生抗体的方法，包括a)给予宿主动物(最 好是小鼠)多肽抗原，以便诱导宿主动物产生抗该多肽抗原的抗体，此多肽选自一个或多 个PTHrP亚型，包括PTHrP的N端部分(最好是氨基酸残基1到33)和C端部分(最好是 PTHrPl-173氨基酸残基140到173或氨基酸残基151到169) ；b)监测宿主动物由施用多 肽抗原产生的抗体滴度；c)提取宿主动物产生的抗血清；及d)从该抗血清中分离并选择至 少一种抗体。本发明的进一步实施方式是针对治疗癌细胞生长、转移或入侵的方法，此方法包 括给予治疗对象有效量的上述分离的抗体。这种抗体能够特异性地与一个或多个PTHrP亚 型的N端部分(最好是氨基酸残基1到33)或最好是C端部分(最好是PTHrPl-173氨基 酸残基140到173或氨基酸残基151到169)结合。本发明的进一步方面是针对诊断疾病活动或癌细胞转移扩散的方法(最好是在 高钙症发生之前)。这种方法包括给予治疗对象有效量的分离的抗体，此抗体能够特异性地 与一个或多个PTHrP亚型的N端部分(最好是氨基酸残基1到33)或最好是C端部分(最 好是PTHrPl-173氨基酸残基140到173或氨基酸残基151到169)结合。在一个优选实施 方式中，癌症细胞可以选自表达一个或多个PTHrP亚型的任何一组，但最好是上皮癌组，如 乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌，胰腺癌、卵巢及鳞癌细胞以及黑色素瘤。本发明的进一步方面是针对调节一个或多个PTHrP亚型(最好是PTHrPl-173)表达的方法，通过施用siRNA，它与编码一个或多个PTHrP亚型(最好是PTHrPl_173)的核酸 分子杂交。本发明的进一步方面是针对包括siRNA分子的siRNA的组成，它与编码所有人的 PTHrP亚型(优选的是PTHrPl-173，更优选的是PTHrP的C端部分氨基酸残基140-146)的 核酸分子杂交。本发明的进一步方面是针对抑制患者的PTHrP表达的方法，包括给病人施用能够 与编码人PTHrP的核酸分子杂交的siRNA分子从而进行抑制。本发明的进一步方面是针对存放于国际保存加拿大管理局登录号IDAC 150807-02的一个杂交瘤。本发明的进一步方面是针对存放于国际保存加拿大管理局登录号IDAC 150807-01的一个杂交瘤。本发明的进一步方面是针对存放于国际保存加拿大管理局登录号IDAC 15080703 的一个杂交瘤。本发明的进一步方面是针对存放于国际保存加拿大管理局登录号IDAC 060808-01的一个杂交瘤。本发明的进一步方面是针对存放于国际保存加拿大管理局登录号IDAC 06080802 的一个杂交瘤。附图的简短说明从以下说明中当采取联同附图时，上述及本发明的其它对象、特点及优势应该变 得明显。本专利或本专利申请文件包含至少一个彩色图形。本专利或含彩色图形的专利申 请副本可向专利办公室索取并缴付所需费用。表一显示本发明的不同细胞株在转染表达特定PTHrP亚型的表达载体前后PTHrP
的产量。
图1 (A)到(C)显示HPKlA细胞PTHrP亚型过度表达对细胞形态(B)、细胞生长(A) 及在软琼脂内的生长的影响(C)。星号O意味着ΗΡΚ1Α/ρ173细胞株与任一 ΗΡΚ1Α/ρ141、 HPKlA/载体或野生型HPKlA间有统计学上显着性差异(ρ ( 0. 01)。图2 (A)及(B)显示移植了过度表达PTHrP的细胞ΗΡΚ1Α/ρ173及ΗΡΚ1Α/ρ141的 裸鼠的摘除的皮下肿瘤(A)以及移植了 ΗΡΚ1Α/ρ173和ΗΡΚ1Α/ρ141细胞株的裸鼠肿瘤生长 速度⑶。图3(A)到(C)显示PTHrP的基因结构(A) ；RT-PCR检测的三型(PTHrP 1-139, PTHrPl-141 和 PTHrPl-173)在 HPKlAras、A375 和 MDA-MB-435 人肿瘤细胞中的表达(B)及 PTH/PTHrP受体的存在(C)。图4(A)至(D)是一张照片，显示在不同细胞株中不同亚型PTHrP的过度表达对细 胞形态学的影响(A)R_67永生人肾近端小管细胞；(B)C0S-7细胞；(C)PC_3人前列腺肿瘤 细胞株和(D)A375人黑色素瘤细胞。图5是一个表，显示本发明针对不同PTHrP亚型的抗体亚类的特征。图6是一个图，显示用酶联免疫吸附试验(ELISA)测量本发明的抗体的抗原结合 活性。图7是免疫印迹，显示本发明的单克隆抗体对抗原的特异性识别。
图8(A)及(B)显示PC-3前列腺癌细胞体外组织培养的免疫组织化学结果(A) 及A375黑色素瘤细胞体内淋巴结转移的组织切片(B)。用本发明的单克隆抗体(针对 PTHrPl-33或PTHrP140-173)所染的细胞或组织。图9是个表，显示与移植了野生型细胞(WT+++)的动物相比，移植了消融PTHrP 的A375细胞(DK0-/-)的裸鼠体内不同部位的转移瘤受到抑制。图9还显示野生型WT A375(+/+)和PTHrP敲除(DK0-/-)的黑色素瘤细胞移植到裸鼠体内后向不同器官的转移。 细胞(IX IO5)被接种到左心室。裸鼠被杀后，每个器官都被宏观和显微镜下检查，看是否 涉及转移。图9还显示有不同器官转移的动物数比动物总数。每组共有14只小鼠。图10 (A)和(B)显示通过双敲除(DK0-/-)人黑色素瘤细胞A375中的同源重组对 PTHrP的所有三个亚型抑制对体外细胞生长及侵袭的结果。星号O表示A375DK0(-/_)和 A375WT(+/+)细胞间有统计学上显著性差异(P ( 0. 01)。图11 (A)到(I)显示人黑色素瘤细胞A375所有的PTHrP三种亚型的抑制在下以方 面的影响动物健康((A，WT+/+)和(C，DK0-/-))、淋巴结浸润((B,WT+/+)和(D，DK0-/-))、 荧光成像骨转移((E)及(F))、按Kaplan-Meier生存率_法统计的动物存活率(G)、动物 体重(H)和循环钙浓度(I)。星号O表示A375DK0(-/_)和A375WT(+/+)两组动物在转移 扩散、存活、体重和循环钙水平方面有统计学上显著性差异(P ( 0. 01)。图12(A)到(C)显示单克隆抗体中和活性对A375细胞的生长及侵袭的影响。星 号O表示载体(WT对照，IgG)处理的和各种单克隆抗体处理的A375野生型细胞间有统计 学上显著性差异(ρ <0.01)。图13 (A)和(B)显示针对所有PTHrP亚型的siRNA的中和活性对A375细胞生长 及侵袭的的影响。星号O表示对照SiRNA (载体)处理的和siRNAl-22处理的A375细胞 间有统计学上显著性差异(P ( 0. 01)。图14㈧到⑶显示本发明的单克隆抗体对皮下移植了 A375细胞的裸鼠体内肿 瘤生长的影响(A)肿瘤生长、(B)摘除肿瘤的照片、(C)杀裸鼠时肿瘤重量及(D)摘除肿瘤 的苏木精一伊红染色。星号O表示载体对照处理的和各种mAb处理的动物间有统计学上 显著性差异(P <0.01)。图15㈧及⑶显示本发明的单克隆抗体体内的影响(A)对通过心内路径移植 A375细胞4个月后裸鼠宏观可见的转移(B)对按Kaplan-Meier生存率曲线法统计的动物
存活率。图16是个表，显示左心室注射了 A375细胞的动物在中止单克隆抗体后转移扩散 的复发。图17 (A)及(B)显示本发明的单克隆抗体的中和活性对人乳腺癌细胞MDA-MB-435 生长和侵袭方面的影响。星号Γ)表示载体对照处理的和各种mAb处理的MDA-MB-435细 胞间在细胞生长和侵袭方面有统计学上显著性差异(P ( 0. 01)。图18㈧到⑶显示在移植了人乳腺癌细胞株MDA-MB-435的裸鼠体内本发明的 单克隆抗体的影响对肿瘤生长(A)和肺转移((C)及(D))。(B)摘除肿瘤的苏木精一伊红 染色。星号O表示载体对照处理的和mAb(M45或M18)处理的动物间在肿瘤生长和转移 方面有统计学上显著性差异(P ( 0. 01)。图19㈧到⑶显示本发明的单克隆抗体的中和活性和siRNA对过度表达各种
8PTHrP亚型的前列腺癌PC-3细胞的的影响细胞生长(A)及侵袭((B)、(C)、(D))。星号O 表示载体对照(WT对照)处理的和所示mAb或siRNAl-22处理的PC-3细胞间在细胞生长 和侵袭方面有统计学上显著性差异(P ( 0. 01)。图20㈧及⑶显示本发明的单克隆抗体的中和活性㈧和本发明的针对每个 PTHrP亚型的特异性siRNA(B)对HPKlAras细胞、对照HPKlA永生的角质形成细胞和正常角 质形成细胞(NHK)的细胞生长的影响。星号O表示载体对照(WT对照)处理的HPKlAras细 胞与单克隆抗体处理的HPKlAras细胞间或对照siRNA处理的HPKlAras细胞与特异siRNA 处理的HPKlAras细胞间有统计学上显著性差异(ρ ( 0. 01)。图21(A)和⑶显示PyVMT乳腺肿瘤进展模型的乳腺上皮细胞PTHrP敲除 的结果野生型对照(PyVMT-PTHrPf lox/f Iox-Cre-和 PyVMT-PTHrP+/+-Cre+)、杂合 (PyVMT-PTHrP+/fIox-Cre+)和纯合(PyVMT-PTHrPflox/fΙοχ-Cre+)动物。(A)实验过程中 肿瘤生长和杀动物时肿瘤重量。(B)按Kaplan-Meier—法统计的肿瘤发病率。星号O表 示PyVMT对照组动物和实验组动物(纯合和杂合)间有统计学上显著性差异并且P <0.01 表示纯合和杂合动物间有统计学上显著性差异(P ( 0. 01)。本发明的详细说明在此披露，使用大量的术语和缩写。下面提供这些术语和缩写的定义。此处使用，所属领域的技术人员可以理解术语"甲状旁腺激素相关蛋白"或其 缩写"PTHrP"是指蛋白质PTHrP或其亚型之一，单独或集体，或被用在谈到核酸时，是 指编码PTHrP的核酸.根据本发明，在谈到不同亚型的其中之一时，亚型可以是指缩写 PTHrP，其次是那个亚型的氨基酸残基数目。例如，包括173个氨基酸残基的亚型可被称为 PTHrPl-173。此处使用，所属领域的技术人员可能理解术语"包括"通常指如权利要求中提到 的所述的特点、整数、步骤、或组成部分的存在，但它并不排除一个或多个其他特点、整数、 步骤、组成部分或其团体的存在或添加。此处使用，所属领域的技术人员一般可能理解术语"治疗"通常指获取有利的或 预期的结果的方法。有利或期望的结果可以包括但并不限于预防、减轻或改善一个或多个 症状或状况、减轻一种疾病的严重程度、稳定(即不让恶化)疾病状态、预防疾病扩散、延迟 或减缓病情发展、改善或缓和疾病状态、缓解(不论是部分或全部)，是否可检测或者检测 不到。与不接受治疗的预期存活相比，“治疗"也意味着延长存活。此处使用，所属领域的技术人员一般可理解术语"有效治疗量"是指施用于需要 治疗对象的足以影响治疗的量。在本发明的实施方式例案中，有效治疗量可以包括(但并 不限于)可以消除或减轻治疗对象疾病(例如肿瘤负荷)的影响的量。此处使用，所属领域的技术人员通常可以理解术语"氨基酸序列"来指一个自然 或非自然出现的蛋白分子的氨基酸序列，“氨基酸序列"以及类似术语，如"多肽"或" 蛋白质"，并不意味着将氨基酸序列限制到与所述的蛋白分子有关的完整的、原生的氨基 酸序列。氨基酸序列可以被称为有一个氨基(N)端和一个羧基(C)端。肽或多肽中的个别 氨基酸可以被称为"残基"，这种残基从N端开始逐渐到C端按顺序编号。一般位于N端 近端的的氨基酸通常被称为N末端氨基酸而那些一般位于C端近端的被称为C末端氨基 酸。所属领域的技术人员可以理解，氨基酸残基被称为N末端或C末端氨基酸残基可能因蛋白质而异。所属领域的技术人员通常应了解，PTHrP的N末端一般从1到36氨基酸残基 延伸，中间部分通常从37到106氨基酸残基延伸和C末端部分一般从107氨基酸残基开始 到氨基酸链终端。此处使用，所属领域的技术人员可能普遍理解，术语"核酸分子编码"、“DNA序 列编码"、“RNA序列编码"、“mRNA序列编码"、“一个含有编码一种基因的核苷序列 的寡核苷酸"、“含有编码一种基因的核苷酸序列的多核苷酸"、“DNA编码"、“RNA 编码"和类似术语，通常指沿着组成一个基因编码区的一个单链或双链核苷酸核顺序或序 列，或换句话说，编码基因产物的核酸序列。这些核苷酸的顺序决定沿肽链的氨基酸的顺 序。编码区域可能以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。寡核苷酸或多核苷酸可能是单链 (例如正义链)或双链(如反义和正义链)。必要时，合适的控制元素如增强子/启动子、 剪接点、多腺苷酸信号等可以放在紧靠该基因编码区以便允许适当转录的启动和/或初级 RNA转录过程的正确进行。另外，表达载体中所用的编码区域可能包含内源性增强子/启动 子、剪接点、干预序列、聚腺苷酸信号等或这两种内源性及外源性控制元素的组合。所属领域的技术人员会理解核酸分子据说有"5'端"与"3'端"，因为单核 苷酸是通过磷酸二酯键连接起来组合寡核苷酸或聚核苷酸。一个单核苷酸戊糖环的5' 磷酸连接到邻近单核苷酸相同方向的3'氧上。因此，寡核苷酸或聚核苷酸的一端可称 为"5'端"如果其5'磷酸未连接到前面单核苷酸戊糖环的3'氧上和可称为"3'端" 如果其3'氧未连接到后续单核苷酸戊糖环的5'磷酸上。此处使用，即使是一个更大的寡 核苷酸或聚核苷酸的一部分，一个核酸序列也可以说有5'和3'端。在任何一个线性或圆 形的核酸分子中离散元素称为"上游"或5'和"下游"或3'元素。既然一个DNA分子 通常是一个双螺旋结构，DNA分子据说有一个"正义"链和一个"反义"链。正义链和反 义链据说是反向互补，即正义链的3'端可能会退火到反义链的5'端，而反义链的5'端 可退火到正义链的3'端。在转录过程中DNA分子的"正义"链通常被复制到一个信使核 糖核酸(mRNA)。通过反义转录，在转录过程中产生的mRNA与正义链具有相同序列以便最终 蛋白可能基于DNA分子的正义链。术语"反义链"是指一个能与正义链互补的核酸链。称 号㈠(即"负")有时是指反义链，称号⑴(即"正")有时是指正义链。此处使用，所属领域的技术人员通常可能理解术语"反义"也可能是指与特定的 RNA序列(例如mRNA)互补的RNA序列。反义RNA可用任何方法生产，包括合成法，从反方 向把靶基因拼接到病毒启动子，允许是反义链的副本的RNA分子的合成(例如基于正义链 或编码链的转录)。一旦引入，转录的链与自然产生的mRNA结合形成RNA/RNA双链分子。 这些RNA/RNA双链分子然后可以干扰mRNA的进一步转录或翻译。此处使用，所属领域的技术人员通常可能理解术语"互补"或"互补性" 用于指按碱基配对规则连接起来的聚核苷酸(即一个核苷酸序列)。例如，序列 5' A-G-T“ -3'，是与序列3' T-C-A“ -5'互补的。互补性可能是〃部分的"， 即只有核酸的某些碱基根据众所周知的碱基配对规则匹配，或者核酸之间可能存在"完整 的"或"总的"互补。核酸链之间的互补性在核酸链之间杂交的强度及效率方面有重大影 响。这种影响在扩增反应以及取决于核酸间结合的检测方法方面尤其重要。此处使用，术语"同源"指互补程度。互补可以是部分同源或完整同源(即一致 性)。同源的核酸序列还包括(但不限于)自然存在的等位基因变异及这里所说的核酸序
10列的突变。用于多肽时，此处所用术语"大量同源"意味着两个肽序列最佳对齐时，如用 GAP或BESTFIT程序及其预设差距重量，共享至少80 %的序列相同，优选是至少90 %的序列 相同，更优选是至少95%或更多序列相同(例如99%序列相同)。氨基酸序列可因保守氨 基酸替换而不同。所属领域的技术人员会理解术语"保守氨基酸替换"是指有化学类似侧 链的残基的一般互换。例如，有脂肪族侧链的氨基酸组可能包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮 氨酸和异亮氨酸；有脂肪羟基侧链的氨基酸组可能包括丝氨酸和苏氨酸；有含酰胺侧链的 氨基酸组可能包括天冬酰胺及谷氨酰胺；有芳香侧链的氨基酸组可能包括苯丙氨酸、酪氨 酸和色氨酸；有碱基侧链的氨基酸组可能包括赖氨酸、精氨酸，和组氨酸；和有含硫侧链的 氨基酸组可能包括半胱氨酸和蛋氨酸。所属领域的技术人员一般能理解，一个基因可以通过初级RNA转录本的区别剪 接或选择性剪接而产生多种RNA。当这些多种RNA转录成多肽时，转录的多肽被称为"亚 型"。相同基因剪接变异体cDNA可能包含序列同源区域(代表这两个cDNA相同外显子或 相同的外显子的一部分的存在)和/或可能包含非同源区域。如果两个cDNA包含序列同 源区域，这些cDNA可能杂交到探针上，此探针来自包含有在这两个cDNA上找到的序列的整 个基因或基因部分。例如，作为RNA选择性剪接的结果，亚型可在同一机体的不同组织中表 达。或者，亚型可以由不同的基因编码。此处使用，术语"杂交"或"使杂交"是用于指互补核酸的配对。杂交和杂交强 度(即核酸之间的组合强度)受到核酸互补程度、反应条件的严格性、所形成的杂交体的 Tm、以及核酸内的G C比率等因素的影响。所属领域的技术人员能理解，严格反应条件可 以改变以影响杂交(请参阅，例如，安德森和杨，定量过滤杂交，核酸杂交杂志(1985)和桑 布鲁克等人，分子克隆实验室手册，冷春港出版社，纽约(1989)，皆以引用的方式并入本 文中)。术语“片段”此处使用在谈到单链氨基酸序列时是指一个多肽，与天然蛋白质相比 此多肽的氨基(N)端和/或羧基(C)端被删除，但此片段剩余的氨基酸序列与天然蛋白质 的氨基酸序列等同。所属领域的技术人员能理解，术语"片段"一词可能是指多链蛋白分 子的一部分(例如抗体片段)。术语"自然发生的"或"天生的"此处使用在用于一个对象时，是指此对象可以 在自然中找到。例如，存在于一个有机体(包括病毒)的多肽的多核苷酸序列(可以从自 然源分离出来并没有被修改)是自然发生的。此处使用，术语"引物"是指一个寡核苷酸。当被放在与核酸链补互的引物延伸 产物的合成被诱导的条件下(即核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在和适当的温度和pH 值)无论是纯化的限制消化中自然发生的或人工生产的寡核苷酸，都能充当合成起动点。 在扩增反应中引物最好是单链的以达最高效率，但也可以是双链的。如果是双链的话，在用 来准备延伸产物前引物首先被处理以分开其链。引物最好是一个寡核苷酸。引物必须有足 够长度以便在诱导剂存在时引起延伸产物的合成。引物的确切长度可能取决于很多因素， 包括温度、引物来源和使用方法。在扩增反应中，与核酸序列5'端结合的引物被称为正向 引物，与核酸序列3'端结合的引物通常称为反向引物。此处使用，术语"探针"可以指一个寡核苷酸(即一个核酸序列)，无论是纯化的 限制消化中自然发生的或人工生产的，重组的或由聚合酶链反应扩增的，都能杂交到感兴趣的另一个寡核苷酸上。探针可以是单链或双链的。探针在检测、鉴定与分离特定基因序 列方面有用。所属领域的技术人员也可能会理解，用于本发明的"探针"也可以是一种蛋 白分子(例如抗体)。也可进一步理解探针可能被标有任何报告分子以便可在任何检测系 统中检测到。这些检测系统包括(但不限于)酶(例如酶联免疫吸附测定，以及以酶为基 础的组织化学检测法)、荧光、放射性和发光系统。本发明不应被限制于任何特定检测系统 或标记。术语"标签"此处使用(例如，一个分子已被加上"标签")，也可能被所属领域 的技术人员理解为被连接到一个报告分子上。此处使用，术语“目标”指的是一个结构，例如，一个核酸或蛋白分子，有待于被识 别、检测、鉴定或放大。因此，“目标"是从其它结构挑选出来的。此处使用，术语"聚合酶链反应"(PCR)指的是美国专利号第4，683，195、 4，683，202及4，965，188首次描述的方法，以引用的方式并入本文中，描述提高基因组DNA 混合物中一段目标序列浓度的一种方法，不需克隆或纯化。这种扩增目标序列的过程包括 向包含期望目标序列的DNA混合物中引入两种过量的寡核苷酸引物，之后是在DNA聚合酶 的存在下精确的热循环程序。两个引物是与双链目标序列上他们各自的链互补的。为了 实施扩增，首先是这种混合物变性，然后引物退火到目标分子内它们的互补序列上。退火 后，聚合酶把引物延伸以形成一对新的互补链。变性、引物退火，以及聚合酶延伸的步骤可 以多次重复(即，变性、退火和延伸构成一个"循环"；可以有很多"循环")以获得高浓 度扩增的期望目标序列。期望的目标序列扩增段的长度取决于引物彼此之间的相对位置， 所以，此长度是可控参数。由于此过程的重复方面，该方法被称为聚合酶链反应(以下简 称"PCR")。因为期望扩增部分的目标序列段成为混合中主要的序列(浓度方面)，它们 被说是"PCR扩增的"。此处使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，指在经历PCR反应之前 使用反转录酶扩增的核糖核酸(RNA)的确定的一块作为其互补DNA(例如，特别是在PCR过 程产生的扩增的片段自己本身又是后续的PCR扩增的有效模板)。此处使用，术语〃 PCR产物〃、“PCR片段〃、“PCR扩增的〃和〃扩增产物" 是指两个或多个循环的变性、退火和延伸的PCR步骤已经完成后产生的化合物。这些术语 包括在已扩增的一个或多个目标序列的一个或多个片段的情况。此处使用，术语"扩增试剂"是指扩增反应所需的那些试剂(脱氧核苷三磷酸， 缓冲液等)，引物、核酸模板和扩增酶除外。通常，扩增试剂与其他反应成分一起被放在反应 容器(试管、微孔等)中。此处使用，术语"限制性内切酶"和"限制酶"是指细菌酶，每个在或近特定核 苷酸序列切双链DNA。此处使用，术语〃重组DNA分子〃是指一种DNA分子，由分子生物学技术连结起来 的DNA片段组成。此处使用，所属领域的技术人员会明白术语"小干扰RNA"或"SiRNA是RNA分子 的一类，参与RNA干扰(RNAi)途径，其中siRNA干扰一种特定的基因产物的表达。合成的 双链寡核苷酸可用此项技术中已知的方式克隆到siRNA载体中。然后siRNA载体转染到宿 主以表达siRNA产物。当术语"分离的"用于关于一个核酸或肽时，如在"一个分离的寡核苷酸"，“ 分离的多核苷酸"或"分离的多肽"，是指一个核酸或氨基酸序列，从至少一个污染物中
12鉴定和分离出，此污染物与它通常在其天然来源相关联。分离的化合物的存在形式或环境 与它被发现时的形式或环境不同。与此相反，非分离化合物，如核酸或氨基酸序列，是以自 然状态存在。例如，一个给定的DNA序列(例如，一个基因)可在宿主细胞染色体上接近邻 近基因处找到；RNA序列，例如编码一种特定蛋白的特定mRNA序列，在细胞内与众多其他编 码多种蛋白质的mRNA混合在一起。此处使用，术语"部分"当用于有关核酸序列或氨基酸序列时是指该序列片段。此处使用，术语"编码区"当用于有关基因序列时是指编码氨基酸的核酸序列， 此氨基酸可以在作为一种RNA分子翻译结果的新生肽中发现。在真核细胞中，该编码区的 范围是在5'端以编码起始者蛋氨酸的核苷酸三联体"ATG"为界并且在3'端以指定三 个终止密码子(即TAA、TAG、TGA)之一的核苷酸三联体为界。此处使用，术语"纯化的"或"使纯化"是指去除抽取样本中的污染物。例如，抗 PTHrP抗体可通过去除污染的非免疫球蛋白来纯化；也可通过去除不与PTHrP结合的免疫 球蛋白来纯化。去除非免疫球蛋白和/或不与PTHrP结合的免疫球蛋白，导致样本中PTHrP 反应免疫球蛋白的百分比增高。术语"重组蛋白"或"重组多肽"此处使用是指从重组DNA分子表达的一个蛋 白分子。此项技术中已熟知的众多方法可用于检测有关本发明的抗体结合能力。这些方法 包括(但不限于)RIA(放射性免疫测定法)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、"三明治"免 疫测定法、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定法、原位免疫测定法(例如 使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、免疫印迹、沉淀反应、凝集检测法(例如凝胶凝集 测定法、血凝测定法等)，补体结合测定法、免疫荧光测定法、蛋白A测定法和兔^^检测 方法等。此处使用，术语"免疫印迹"是指固定到如硝化纤维素的支持膜上的蛋白质(或 多肽)的分析。蛋白质首先由聚丙烯酰胺凝胶分开，然后从凝胶中转到支持物上，例如硝化 纤维素或尼龙膜。固定化的蛋白质然后与具有对兴趣抗原有反应性的抗体接触。抗体结合 可用不同方法检测，包括放射性标记的抗体、酶连抗体等的使用。此处使用，丨‘同源重组〃 一词是指利用DNA物理重排过程的技术。DNA物理重排 涉及对齐的DNA链之间同源序列DNA的对齐或交叉，以便产生链之间的物质交换。同源重 组用来敲除基因功能或创建删除突变体。同源重组方法是众所周知的，例如，美国专利号 5，614，396中所述，以引用的方式并入本文中。术语"抗原决定簇"此处使用是指与抗体接触的抗原部分(即抗原决定部位)。 当一个蛋白或一种蛋白片段用来免疫接种宿主动物时，蛋白的许多区域可能诱导抗体的产 生。此抗体能与蛋白的三维结构或给定区域特异性地结合，这些区域或结构被称为抗原决 定簇。一个抗原决定簇可能与完整抗原(即，用来引起免疫应答的"免疫原")竞争，以便 与抗体结合。术语"转基因"此处使用是指引入一个细胞、细胞株或有机体的外来的、异源的 或自体的基因。术语"外源基因"是指由实验操纵引入任何核酸(例如基因序列)并可能 包括自体基因。术语"自体基因"可能包括自然发生的基因的变种(例如多态性或突变 体)。
此处使用，术语"载体"是用来指把DNA片段从一个细胞到转移到另一个细胞的 核酸分子。术语"表达载体"此处使用是指一个重组核酸分子，含有期望的核酸目标序列和 在宿主中表达核酸或氨基酸序列所需的适当核酸序列。在原核生物中，表达所必需的核酸 序列通常包括一个启动子、操纵子(可选)和核糖体结合点，常常与其他序列一起。众所周 知，真核细胞利用启动子、增强子、以及终止和多聚腺苷酸信号。此处使用，术语"宿主"或"宿主细胞"是指任何真核或原核细胞(如，细菌细 胞如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆 虫细胞)，无论位于体内或体外。例如，宿主细胞可能位于一个转基因动物。术语"转染"此处使用是指把外来的DNA引入真核细胞中。转染可用多种此项 技术中已知的方法来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导转染、聚凝胺介导转 染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪 法。术语"样本"此处使用是在最广泛的意义上使用。怀疑含有核酸或氨基酸序列 的样本可包括一个细胞、从细胞分离的染色体(例如细胞分裂中期染色体的扩散)，基因组 DNA (在溶解状态中或结合到固体支持物上)、RNA (在溶解状态中或结合到固体支持物上)、 cDNA(在溶解状态中或结合到固体支持物上)等。怀疑含有蛋白质的样本可包括一个细胞、 一个组织的一部分、含一个或多个蛋白质的提取物等。此处使用，术语"反应"当用于关于一个测定或其他结果(例如报告分子的积 累、离子浓度增加、可测化学产物的积累(例如抗体))时是指可测信号的产生。此处使用，术语"拮抗剂"和"对抗性的"，是指或描述一个分子，它能直接或间 接地、大大地对抗、减少或抑制PTHrP或其亚型的生物活性或激活。除了单克隆抗体之外， 拮抗剂可包括肽类，此肽类是PTHrP的或其亚型之一(最好是PTHrPl-173)的部分序列，特 别是PTHrPl-173及其受体的竞争拮抗剂。另外，PTHrP拮抗剂可以是降低PTHrP活性的非 肽化合物。PTHrP拮抗剂也可以是一个抑制PTHrP信号或其亚型之一信号的化合物。PTHrP 拮抗剂也可以是一个抑制PTHrPl-173特异性受体的化合物。PTHrP拮抗剂，也可以是一种 降低PTHrPl-173或其受体的表达的化合物。所属领域的技术人员可能理解，这样一种化合 物可能包括，例如一个能结合到目标PTHrP mRNA或PTHrP基因或受体上的分子。例如，这 种化合物可以包括siRNA或一个反义寡核苷酸或特异性化合物或抑制PTHrPl-173mRNA的 因子。例如，众所周知，PTH7-34或PTHrP7-34已用作小肽拮抗剂，以便阻止PTH或PTHrP 的作用。来自PTHrPl-173的肽可用作PTHrPl_173和/或其受体的拮抗剂。术语PTHrP拮 抗可以被广义理解并且包括任何降低PTHrP或其亚型之一的生物效应的化合物。除本发明 的单克隆抗体之外，拮抗剂可包括PTHrP部分序列的肽类，特别是PTHrPl-173的竞争性拮 抗剂。另外，PTHrP拮抗剂可以是降低PTHrP活性的非肽化合物。这种化合物可以是一个 siRNA或一个反义寡核苷酸或抑制PTHrPl-173mRNA或其受体的特异性因子。此处使用，术语"抗体"或"Ab"是在最广泛的意义上使用，特别包括单个抗 PTHrP单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂以及中和或阻断抗体)和具有多抗原决定部位特异 性的抗PTHrP抗体成分。“抗体"此处使用包括完整的免疫球蛋白或抗体分子、多克隆抗 体、多特异性抗体(即从由至少两个完整抗体形成的双特异性抗体)和免疫球蛋白或抗体片段(例如，Fab、F(ab' ) 2或Fv)，只要他们表现出任何此处描述期望的激动剂的或拮抗 属性。此项技术中已知的各种程序可用于产生多克隆或单克隆抗体，针对一个特定的抗原 或针对其衍生物、片段、类似物、同源或直系同源。虽然本发明已用小鼠单克隆抗体作为优 选实施方式证实，本发明并非如此有限。这样的单克隆抗体属于本发明的范围。所属领域 的技术人会明白本发明的抗体还包括嵌合的、混合的、“人化的"或完全人的抗体，只要他 们表现出期望的生物活性或属性。使用人杂交瘤细胞株或"二聚抗体"或其它适当方法产 生的人化的单克隆抗体或完全人的抗体可以是人类治疗用途的优选方法。所属领域的技术 人员理解，不同的已知技术可创建嵌合的、人化的或完全人抗体。由于多数可用单克隆抗体 是非人类起源，它们是人类的自然抗原并且可以引起不良免疫反应。所属领域的技术人员 理解，降低任何不良免疫反应的技术一般称为"人化"。抗体一般是显示对某一个特定抗原有结合特异性的蛋白质或多肽。天然抗体通常 是异四聚体糖蛋白，由两条完全相同的轻(L)链和两条相同重(H)链组成。通常，每条轻链 以一个共价二硫键连接到一条重链上，而共价二硫键数因不同的免疫球蛋白厘型的重链而 异。每条重链和轻链也有定期间隔的链内二硫键。每条重链一端有可变区随后是若干恒定 区。每条轻链有一个可变区在一端(VL)而一个恒定区在其另一端；轻链的恒定区与重链的 第一个恒定区对齐而轻链可变区与重链可变域对齐。特定氨基酸残基被认为形成轻、重链 可变区之间的界面。任何脊椎动物物的抗体轻链可以分配到两种明确不同类型之一，称为 卡帕(kappa)与拉姆达(lambda)，基于其恒定区的氨基酸序列。取决于其重链的恒定区的 该氨基酸系列，免疫球蛋白可以分配到不同的类别。有五大类免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、 IgG和IgM，其中的一些可以进一步分为亚类(同型)，如，IgGl, IgG2，IgG3，和IgG4 ;IgAl 和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为阿尔法(α)、德尔塔(δ)、 伊普西龙(O、伽玛⑴、和亩(μ)。抗体，特别是IgM类，可能通过瞄准功能调解细胞毒性而间接抑制肿瘤生长这些 单克隆抗体属于一个亚类或同型，与受体络合后激活血清补体和/或调解抗体依赖性细胞 毒性(ADCC)。这种抗体可用来通过自然补体诱导溶解以及与细胞上通常存在的ADCC相互 作用。抗体调解病人的肿瘤细胞溶解的能力可以在体外测试，通过把抗体添加到体外生长 的病人肿瘤细胞。病人自己的血清然后可用来作为体外测试肿瘤细胞溶解的补体来源。这 些抗体，包括本发明的抗体，例如，抗体与PTHrPl-173特异性结合的抗体，显示体外最高水 平的细胞溶解(通过补体激活或ADCC)并且可施用于病人以达治疗消融。为治疗目的而选择一个抗体亚类将取决于特定PTHrP亚型在肿瘤中的表达。例 如，如果肿瘤表达了比正常组织水平更高的PTHrPl-173亚型，一个针对此亚型的IgM可能 是优选以诱导肿瘤细胞溶解。但是，如果PTHrPl-173亚型表达水平较低，最好使用一个针 对此亚型的IgG，它较小，因此更容易穿透肿瘤并且对正常细胞的细胞毒性也较低。此处使用，“抗体片段"包括一个完整的抗体的一部分，一般是完整抗体的抗原 结合区或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab' )2、以及Fv片段、双特异抗抗体、 单链抗体分子，和多特异性抗体。此处使用，术语"可变区"描述抗体的某些部分，其序列因抗体而异并且用于每 个特定抗体对其特定抗原的特异性结合。但是，可变性通常是不均勻地分布在抗体的可变 区。它通常集中在轻链和重链可变区的三个部分，称为互补决定区(cdr)或高变区。可变区的高度保守部分称为框架区(FR)。自然重链和轻链的每个可变区包括四个FR区，主要采 用一个β -折叠结构，由三个cdr相连，形成循环连接，而在某些情况下，构成β -折叠结构 的一部分。每条链的cdr与附近另一条链的cdr由FR区联在一起，有助于形成抗体的抗原 结合位点。恒定区不直接涉及抗原与抗体的结合，但显示各种效应功能，如抗体依赖性细胞 毒中抗体的参与。此处使用，术语〃单克隆抗体〃或〃 mAb〃是指从IIM同质的抗体群体获得的一 种抗体，即组成群体的个别抗体都一样，除了少量存在的可能自然发生的突变。单克隆抗体 是高度特异的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(抗原决定部位)的 传统(多克隆)抗体制剂相比，每个单克隆抗体是针对抗原的单一决定簇的。修饰语"单克隆"表示，抗体的特征是从IIM同质的抗体群体获得的，而不是通 过任何产生抗体所需的特定方法而构成。所属领域的技术人员应了解，本发明的抗体的修改此处已考虑。本发明的抗体可 通过此项技术中已知的方法修改，将本发明的抗体共轭、标签或标记到任何已知诊断剂或 治疗剂，包括(但不限于)细胞毒剂(例如免疫毒素共轭)、前体药物、药物(例如药物活性 物质)或能有效地治疗疾病的其他效应分子，以及已知的报告分子。这样修改的抗体也被 称为免疫组化衍生物包括，但并不限于(a)标记的(例如放射性标记的、酶标、荧光素或化 学发光化合物)本发明的单克隆抗体，最好是人化的或完全人的mAb，利用已知的成像技术 以帮助诊断或检测肿瘤及肿瘤扩散(例如转移)；及(b)本发明的单克隆抗体的免疫毒素 复合物，最好是人化的或完全人的单克隆抗体，其中本发明的单克隆抗体共轭到已知细胞 毒性的、放射性的、放射性标记的前体药物或药物部分(例如放射免疫疗法)。所属领域的 技术人员将理解本文中所使用术语"细胞毒性剂"、“细胞毒素"或"细胞毒性的"通常 指一种物质，抑制或防止细胞功能和/或造成细胞的破坏包括(但不限于)放射性同位素、 化疗药物、毒素(如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物源酶活性毒素，包括片段及/或其 变体。所属领域的技术人员应了解的，本申请用术语"前体药物"通常是指一种药物活性 物质的先驱或衍生形式，与药物活性物质相比对目标细胞毒性更小而且能够被激活或转换 为药学上更活动的物质。此处使用，“杂交瘤"是指细胞株已设计产生单克隆抗体，如通过科勒和米尔斯 坦，自然，256 =495(1975)首次所述的杂交瘤方法。在一个杂交瘤方法中，老鼠、仓鼠或其他 合适的宿主动物通常用免疫剂免疫，以诱发产生或有能力产生可能会特异性地与免疫剂结 合的抗体的淋巴细胞。使用合适融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生细胞融合以形成 杂交瘤细胞。请参阅，例如Goding，单克隆抗体原则与实践、学术出版社、(1986)，第59到 103页，或哈代等人，实验免疫手册(DM堰编辑)，布莱克韦尔科学，第13. 1页，其内容以引 用的方式并入本文中。永生细胞通常是转化的哺乳动物细胞，尤其是起源于啮齿动物、牛和 人类的骨髓瘤细胞。通常，用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞。杂交瘤细胞可以培养在合适的培养 基里，最好是包含一个或多个抑制非融合永生细胞生长或生存的物质。例如，如果细胞缺乏 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)这种酶，在杂交瘤细胞的培养基中通常可 能包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(“HAT培养基")，这些物质阻止缺HGPRT的细胞生长。杂交瘤细胞体外培养的培养基然后可用来测定针对抗原的单克隆抗体的存在。 最好通过免疫沉淀或体外结合实验，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附试验
16(ELISA)来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。这种技术与检测方法是此项 技术中已知的。单克隆抗体亲和力可以，例如由芒森和波拉德Scatehard分析测定，分析生 物化学，(1980年)，第107卷，第220页。识别对目标抗原具有高度特异性和高亲和力的抗 体是有利的。期望的杂交瘤细胞确定后，通过标准方法(Goding，1986)和有限稀释程序可把这 些克隆进行亚克隆和使其生长。适合此用途的培养基包括，例如，贝科的改良Eagle培养基 和的RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以生长在哺乳动物体内以刺激腹水产生。亚克隆分泌的单克隆抗体可用常规免疫球蛋白纯化程序(例如蛋白质 A-S印harose，羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、或亲和层析)从培养基或腹水中分离或 纯化。所属领域的技术人员应了解本发明的单克隆抗体也可以由重组DNA方法制作，如 美国专利号4，816，567中所述，以引用的方式并入本文中。编码本发明的单克隆抗体的DNA 可以用传统的程序(例如，通过使用寡核苷酸探针，该探针能够特异性地与编码小鼠抗体 重链和轻链的基因结合)很容易分离和测序。一旦分离，可以将DNA放入表达载体，然后转 染宿主细胞((如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)，否则这些细胞不产 生免疫球蛋白，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。DNA还可以进行修改，例如通过 替换在小鼠同源序列的地方为人类重和轻链恒定区编码序列(美国专利号4，816，567 ；莫 里森，自然(1994)，第368卷，第812到813页)或通过共价键将非免疫球蛋白多肽的所有 或部分编码序列连接到免疫球蛋白编码序列。这一非免疫球蛋白多肽可以取代本发明的一 种抗体的恒定区，或可以替换本发明的一种抗体的抗原结合位点可变区以创建嵌合的二价 抗体。本文中所使用的术语〃敲除(knockout)“和〃敲低(knockdown)“ —般是指从 功能上消除了基因产物的表达或减少表达以确定其基因产物的功能。所属领域的技术人员 应了解术语"从功能上消除表达"可能指要么完全消除其表达或减少其表达超出检测限。 术语“敲除动物”本文中所使用可理解为一般指的是转基因动物，其中一核苷酸转基因序列 (即，动物基因组天生没有的基因或cDNA)插入到基因组，以便减少、消除或“敲除”内源性 基因产物的产生和/或表达。术语"双敲除"应理解为一般指敲除，其中兴趣基因的两个 等位基因已被淘汰。这种动物对于体内研究、测试和验证由此核苷酸序列编码的产物功能 非常有用。所属领域的技术人员应理解"敲低"可指通过采用siRNA方法在体内或体外 (例如细胞)抑制。所属领域的技术人员应了解本发明组合物，包括(但不限于)抗体和siRNA，可 以用标准药物配方化学和方法制成为了施用(以这种材料的习惯施用的方式)的药物组 合物，所有这一切对于所属领域的技术人员来说都是现成的。所属领域的技术人员应理解 这种药物组合物可能包括一个或多个赋形剂、载体、稳定剂或其他药学上非活性化合物，如 (但不限于)润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。药学上可接受的盐也可能包含其中。药学 上可接受的赋形剂、载体和辅助物质的深入讨论可在雷明顿的制药科学(麦克出版社有限 公司，1991年，新泽西州)中找到，以引用的方式并入本文中。这种药物组合物可以准备为 注射剂或口服制剂。本发明的抗体可通过注射施用，包括(但不限于)肌肉注射、静脉注射、 皮下、腹膜，透皮或鼻注射。有效治疗剂量可能会根据体重有所不同，施用时间和持续时间将由特定临床研究医疗方案决定。后面的描述，以及其中所述的实施方式，是由本发明的原则和方面的特别实施方 式的一个实施例(或实施例们)说明的方式提供。这些实施例提供了解释的目的，而不是 限制这些原则和本发明。在描述中，相似部分在整个说明书中标志着并且附图带有相同的 各自的参考数字。本发明是针对肿瘤生长及其进展到转移部位的诊断、治疗和抑制，通过抑制一个 或多个PTHrP亚型(优选的是亚型PTHrPl-173)的产生或信号，作为疾病的治疗，包括几种 类型的癌症。更优选的是，本发明是针对抑制由特定PTHrPl-173亚型激活的受体和/或其 信号途径的方法。本发明还针对体内成像和肿瘤靶向治疗，以及表达一个或多个PTHrP亚 型(优选的是亚型PTHrPl-173)的转移部位，使用针对一个或多个PTHrP亚型(优选的是 亚型PTHrPl-173)的单克隆抗体，这种单克隆抗体最好是标签的或标记的(如报告分子) 诊断剂或治疗剂(如细胞毒性剂、前体药物或药物)。本发明还针对PTHrP亚型的检测，作 为疾病活动或转移扩散的指标，最好在高钙血症发生之前，或作为可能治疗的预后指标。本 发明可以适用于多种疾病状态，包括(但不限于)表达这些亚型的几种类型的癌症(包括 上皮癌例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和几种类型鳞状细胞癌以及黑 色素瘤)，单独或与其他治疗药物组合。PTHrP及其亚型的抑制已在体外和体内一系列人类癌症模型测试，此模型包括乳 腺癌、黑色素瘤、鳞癌、前列腺癌如此处所述。本发明的方法是通过一个或多个PHTrP亚型 (最好是特定的亚型PTHrPl-173)的拮抗剂针对阻止PHTrP的产生/活性。这些方法包括 (但并不限于)同源重组(双敲除)，siRNA敲低(knockdown)和包括如针对此亚型的单克 隆抗体以及肽片段这样的拮抗剂，此拮抗剂有可能与受体结合，并且阻止一个或多个PHTrP 亚型(最好是特定的亚型PTHrPl-173)的活性。
实施例实施例1抗PTHrPl-33，140-173和151-169的单克隆抗体的产生、制备和鉴定小鼠单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的，通过骨髓瘤细胞和产生抗体的小鼠(免 疫了衍生于PTHrP及其亚型的抗原)脾细胞之间的细胞融合。被选中的抗原要么是PTHrP 亚型1_173(来自C-末端片段)独有的或是所有人类PTHrP的亚型(来自N末端片段)共 同的。抗原的制备根据本发明，用于免疫的抗原包括以下肽(a)人PTHrP140_173， (“hPTHrP140-173 “)禾Π 人 PTHrP151_169 ( “ hPTHrP 151-169 “)；及(b)人 PTHrPl-33 ( ‘‘ hPTHrPl-33 ‘‘)。请了 解，hPTHrP140_173 抗原是一个多肽，包括在 PTHrPl-173亚型的氨基酸位置140至173的氨基酸残基。hPTHrP151_169抗原同样是一个 多肽，包括在PTHrPl-173亚型的氨基酸位置151至169的氨基酸残基。请了解，hPTHrPl_33 抗原是一个多肽，包括在PTHrP的氨基酸位置1至33的氨基酸残基，这是所有三种人类 亚型共有的。所属领域的技术人员应了解，因此，hPTHrP140-173和hPTHrP151-169抗原 是PTHrPl-173亚型特有的。任何基于下面列出的科学实验计划由这些抗原引起的任何抗体是针对PTHrPl-173亚型的抗原决定部位。在另一方面，所属领域的技术人员应了解， hPTHrPl-33抗原是所有三种hPTHrP亚型共有的。因此，基于下面列出的科学实验计划由 hPTHrPl-33抗原引起的任何抗体是针对所有三种人类PTHrP亚型的抗原决定部位。免疫与抗体生成细胞的采集合成人hPTHrPl-33、hPTHrP140_173和hPTHrP151_169购自谢尔顿生物技术中心 (麦吉尔大学，蒙特利尔)。在注射小鼠之前，hPTHrP140-173，hPTHrP151-169和hPTHrPl-33 抗原按如下所述以50% (ν/ν)与Freund'完全佐剂混合。年龄5到6周的雌性BALB/C小鼠腹腔注射25 μ g的hPTHrP140_173、hPTHrP 151-169和hPTHrPl-33抗原之一，50% (ν/ν)与Freund'完全佐剂乳化。分别给予小鼠乳 化于50%的(ν/ν)弗氏不完全佐剂中的相关抗原加强剂量，此相关抗原即以前注射小鼠的 抗原，在相关hPTHrP抗原的第一次注射后13至15天。hPTHrP抗原的加强剂量注射后一 周，从免疫小鼠的尾出血采集血清用于ELISA(酶联免疫吸附法)来确定针对用于免疫该特 定小鼠的抗原的抗体存在。产生对hPTHrP140-173，hPTHrP151_169或hPTHrPl-33抗原的 抗体的小鼠然后进一步被注射25 μ g相应或相关hPTHrP抗原。最终免疫三天后从接收最 后免疫的小鼠收集脾细胞。细胞融合单克隆抗体的制备根据(哈代等人，在实验免疫学手册(威尔编辑)，布莱克韦尔 科学，第pl3. 1页)。脾脏被手术删除，产生抗体的免疫动物的脾细胞由已知的方法分离并 且用37°C无血清的RPMI-1640轻轻地冲洗。该动物免疫了 hPTHrP140_173，hPTHrP151_169 或hPTHrPl-33抗原之一。分离的脾淋巴细胞然后与骨髓瘤细胞Sp2或FO(两者均来自 ATCC，罗克维尔，马里兰州)混合，并且根据已知的方法用50%聚乙二醇1500(默克，达姆 施塔特，德国)融合。由此产生的融合细胞，然后与正常小鼠脾淋巴细胞在预培养的96孔 组织培养板(贝克顿狄金森实验器具，富蘭克林湖，新泽西州；Immimolon Dynex，弗吉尼亚 州)杂交瘤选择培养基中培养，该培养基由RPMI辅以20%的胎牛血清、抗生素和抗真菌素 混合物以及次黄嘌呤_氨蝶呤_胸腺嘧啶(HAT) (Gibco BRL)组成。细胞在37°C培养并且 有5% C02存在。在培育的第4天和第8天，HAT培养基由新鲜HAT培养基取代。分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选和克隆脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，分泌抗体的杂交瘤细胞用选择性增长挑选和培 养，然后通过有限稀释筛选。培养13至15天后，从杂交细胞培养上清液中筛选三个所用抗 原之一的特异性抗体，此三抗原是hPTHrP140-173，hPTHrP151-169和hPTHrPl-33。此筛选 使用预涂有相应肽的96孔平底微孔板(VWR，密西沙加，安大略省)和ELISA法。所用的第 二抗体是羊抗鼠IgG、IgM和IgA(重链和轻链)抗体，与辣根过氧化物酶(HRP)(南方生物 技术，伯明翰，阿拉巴马州)共轭。过氧化物酶底物是ABTS (KPL公司，盖士堡，马里兰州)。 选出的杂交瘤用限制稀释法克隆两次。阳性的杂交瘤细胞克隆首先在24孔板中增殖，并且 在第二次ELISA测试后细胞到达合流(长满)时转移到T75瓶。单克隆抗体的收集确定为产生期望抗体的杂交瘤细胞适应BD细胞培养基，通过逐步增加BD细胞培 养基在现有的细胞培养基中的量，直到后来细胞转移到Cellline瓶(BD生物科学，圣地亚 哥，加利福尼亚州)，并且在BD细胞培养基中培养以便在上清液中产生单克隆抗体(mAb)。
19离心上清液2000 X克5分钟以清除细胞碎片，而且上清液通过0. 22到0. 45微米过滤器过 滤，以进一步消除细胞碎片，分成等分并在4°C保存。亲和纯化的单克隆抗体是用G蛋白层 析柱(阿默舍姆法玛西亚生物技术公司，Baied' Urfe，魁北克，加拿大)并利用一种蛋白 质检测试剂盒(皮尔斯，美国伊利诺斯州)量化。纯化的抗体都浓缩到1到5毫克/毫升， 对磷酸盐缓冲液(PBS)透析，并在零下70°C保存。单克隆抗体的抗体分型是用商业抗皿 型试剂盒(伯乐生命医学产品，美国)确定。如图5所示，获得了下面的杂交瘤细胞克隆。杂交瘤细胞第158号和第M45号 产生单克隆抗体(mAbl58和mAbM45)，显示对hPTHrPI-33(PTHrP的N端片段)的强大结 合能力。杂交瘤细胞第104号和第M18号产生的单克隆抗体(mAbl04和mAbM18)，显示对 hPTHrPI40-173(PTHrP的C端片段)的强大结合能力。杂交瘤细胞第6号产生单克隆抗体 (mAb6)，显示对hPTHrPI51-169 (PTHrP的C端片段)的强大结合能力。杂交瘤细胞株号104、M18和6分别产生单克隆抗体mAbl04、mAbM18和mAb6，并 且已存放于国际保存加拿大管理局(IDAC)，分别被授予登录号150807-02、150807-03和 150807-01。杂交瘤细胞株号M45和158分别产生单克隆抗体mAbM45和mAbl58，并且已在 IDAC存放及被分别授予登录号060808-01和060808-02。所属领域的技术人员应了解，本发明的单克隆抗体亦可使用腹水形成和其他此项 技术中已知的常规细胞培养或分子生物学方法获得。在腹水形成的方法中，杂交瘤细胞是 腹腔内接种到雌性的BALB/c裸鼠，腹水在1-4周后收集。单克隆抗体的亚类单克降抗体分型是用商业抗体分型试剂念(伯乐生命医学产品，美国)确定。针 对PTHrPl-33、PTHrP140_173和PTHrP151_169的单克隆抗体的亚类鉴定是在图5中。在 图5可以看出，显示一个代表针对不同亚型的PTHrP抗体亚类的鉴定表。如图5所示，确定 了 PTHrPl-173亚型的三个特异性单克隆抗体(i)mAbl04，(ii)mAbM18，和(iii)mAb6。本 发明的单克隆抗体包括以下亚型(i)mAbM18和mAbM45的IgMkappa，(ii)mAbl04的IgG2b kappa, (iii)mAb6的IgGlkappa，及(iv)mAbl58的IgG3(请参见图5)。这些单克隆抗体的 特异性后来用下面详细描述的ELISA、免疫印迹和免疫组织化学方法测试。单克隆抗体的抗原结合与中和活性的评价抗体浓度的测定纯化抗体的浓度用ELISA法确定。ELISA用于确定每个单克隆抗体的浓度如下。 一百微升hPTHrPl-33, hPTHrP140_173或hPTHrP 151-169抗原(浓度在5微克/毫升)固 定到96孔板的每个孔用于ELISA。在用200微升稀释的缓冲液(1%牛血清白蛋白)阻止 后，已知浓度相应的纯化(通过亲和纯化，使用如前面所述的G蛋白层析柱)的单克隆抗体 用作标准。要确定在后续准备上清液的单克隆抗体浓度，逐步稀释的单克隆抗体上清液被 添加到每个孔。接着是共轭辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG(IgM)抗体以及100微升 底物溶液的加入，其后在405纳米测量吸光度。每个特定抗体的浓度是在和每个特定的纯 化单克隆抗体的标准准备相比后确定。抗原结合活性的测定用于确定抗原结合活性的ELISA板的准备如下。hPTHrPl-33、hPTHrP140_173和 hPTHrP151-169抗原之一(浓度在1_10微克/毫升)固定到96孔板的每个孔用于ELISA。在用200微升稀释的缓冲液(1%牛血清白蛋白)阻止后，逐步稀释的单克隆抗体上清液被 添加到每个孔。接着是共轭辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG(IgM)抗体以及100微升 底物溶液的加入，其后在405纳米测量吸光度。图6显示通过ELISA的特异性的抗原/抗 体相互作用。正如此处详细描述，针对特定抗原所引起的本发明的单克隆抗体被发现对每 个抗原高度特异，并且没有观察到抗体与其他抗原之间的交叉反应性。单克隆抗体与抗原 的特异性识别还采用免疫印迹分析(见图7)。图7显示，本发明的单克隆抗体与抗原特异 性识别的免疫印迹。该mAbl04是针对和识别PTHrP140-173 ；mAbl04是对PTHrPl_173亚型 高度特异的(就像在图7)，并且与PTHrPl-139或PTHrPl-141亚型间没有观察到交叉反应。 图8 (A)及(B)显示体外组织培养PC-3前列腺癌细胞的免疫组织化学(见图8 (A))和A375 黑色素瘤细胞体内转移至淋巴结的组织切片(见图8(B))。如图8(A)所示，细胞免疫染色 是用本发明的单克隆抗体(针对PTHrPl-33(mAbl58)或PTHrP140_173 (mAbl04))。请注意， 只有稳定转染了表达PTHrPl-173 (PC_3/pl73)的本发明的构建的PC-3才被mAbl04识别， 而过度表达任何亚型的PC-3细胞被mAbl58识别。实施例2人转移性黑色素瘤的小鼠模型黑色素瘤的发病率在过去数十年中稳步上升(霍尔等人，美国皮肤病学会杂志 (1999)，第40，第35)，并且一旦黑色素瘤细胞侵袭基底膜患者的存活极差(希尔兹等人，英 国癌症杂志(2004)，第90卷，第693页)。这一阶段黑素瘤的治疗是非常有限的，并且反应 并不令人满意。本发明涉及人类黑色素瘤模型(A375细胞)的使用，其中PTHrP是过度表 达的(Abdaimi等人，美国生理学杂志(2000)第279卷，第C1230页)，以提供黑色素瘤的治 疗。黑色素瘤A375是众所周知的产生PTHrP的所有三种亚型。本发明的各种拮抗剂已对 这种模型测试。如图9到11所示，本发明的拮抗剂把所有三种亚型作为目标，表现体内肿瘤生长 和转移(见图9和11)和体外入侵(图10)显著减少。图9描述了在杀死时特定部位长有转移瘤的动物数比左心室移植了 A375细胞的 动物总数。在移植了 PTHrP基因敲除的A375细胞(DK0-/-A375)的动物，观察到各部位(除 骨外)转移扩散显著减少(超过50%)，骨转移扩散减少只有20%。然而，当较早时间使 用explore Optix仪器荧光成像(绿色荧光蛋白标记的A375细胞瘤)分析转移骨病变时， DK0-/-A375动物转移灶发生率在较早时间点观察到显著减少(肿瘤移植后9和14天)(见 图 Il(E)和(F))。DK0-/-A375动物的尸体解剖清楚显示淋巴结转移的减少(请参阅图11 (D))。请注 意与有宏观可见多个淋巴结转移的野生型WT+/+A375动物相比，单病变由荧光成像检测， 如图Il(B)所示。与野生型WT+/+A375动物相比，DK-/-A375动物的健康和维持体重仍然保 留(请参阅图11(A)，(C)及(H))。此外请注意循环钙浓度在DK0-/-A375动物维持正常， 但在野生型WT+/+A375动物中随着时间的推移而增加(请参见图11(1))。在这两个模型中，在移植肿瘤细胞后，转移可进行视化，此细胞稳定转染了绿色荧 光蛋白(GFP)。如图Il(E)所示，骨转移癌体内成像可以用explore Optix仪器(GE/ART) 做。这种技术允许X光片上的可见病变前骨转移的早期检测，并且可容易地用于监视，在治 疗干预(如本发明的单克隆抗体)期间骨转移以及其它转移部位的进展。一个典型骨转移病灶的荧光成像如图11 (E)并且显示与野生型WT+/+A375动物相比，移植了 DK0-/-A375细 胞的动物骨转移的抑制。此外，PTHrP敲除动物在移植A375肿瘤细胞后，动物的存活大大延长(请参见图 11 (G))。通过A375人黑色素瘤细胞内同源重组(DK0-/-)，卡普兰迈尔分析显示所有三种亚 型PTHrP抑制增加动物存活。与移植了野生型细胞(WT+/+)的动物相比，左心室移植了敲 除(DK0-/-)A375细胞的小鼠演示了这种存活优势(请参阅图11(G))。图10㈧及⑶显示所有三种亚型PTHrP抑制作用的结果，通过同源重组(双敲 除，DKO-/-)以扰乱A375人黑色素瘤细胞的PTHrP基因的两个等位基因。细胞生长(请参 阅图10(A))和体外侵袭(请参阅图10(B))然后被确定。如图10(A)及(B)所示，与转染 了单独载体的野生型细胞(WT+/+)相比，A375敲除细胞(DK0-/-)有细胞生长和侵袭抑制。在后续的实验中，针对PTHrP的N端单克隆抗体(因此识别所有亚型)的效率与 针对PTHrPl-173特定亚型C端的特异性单克隆抗体的效率进行了比较。这些抗体在体外 对细胞生长及侵袭的功效类似(请参阅图12)。图12显示本发明的单克隆抗体的中和活性对A375细胞的生长及侵袭的影响。图 12(A)显示最佳单克隆抗体浓度测定，而图12(B)显示各种单克隆抗体对细胞生长的影响。 图12(C)显示了不同的单克隆抗体对入侵的影响。此外，通过本发明的siRNA，体外所有 PTHrP亚型的敲低复制了用单克隆抗体所见到的所有效果，如图13所示。图13显示了针对 所有PTHrP亚型的siRNA的中和活性对A375细胞的生长及侵袭的影响。如图13(A)所示， 随着时间的推移有提供的肿瘤细胞生长或速度，而图13(B)显示通过matrigel的侵袭。请 注意siRNA敲低(抑制)对生长及侵袭的显著抑制作用(p ^ 0. 01)。人无色素黑素瘤细胞株A375 (ATCC)被移植到裸鼠并且单克隆抗体对肿瘤生长和 转移的治疗效果进行检查。这些人细胞可以皮下移植以检查肿瘤生长，或移植到左心室以 检查转移。在肿瘤移植后5个星期内，转移到多个器官包括肺、肝、骨、心和淋巴结迅速发 展，并且动物总是在7到8周内死亡。肿瘤细胞皮下移植后单克隆抗体对肿瘤生长的治疗效果在4到5周雌性裸鼠 (BALB/c-nu/nu,查尔斯河)进行测试。黑素瘤细胞A375 (1 X IO6)悬浮在100 μ 1的PBS中 并且皮下植入雌性nu/nu小鼠(查尔斯河，St. Constant，魁北克省)。细胞接种1天后治 疗开始，每2天使用100微克抗体皮下注射，持续达5周。对照动物每2天注射100微克非 免疫IgM或IgG(Sigma)持续达5周。原发性肿瘤生长率通过绘制肿瘤的的两个正交直径 的平均值(在5天时间间隔测量)确定。三维肿瘤测量用FST卡尺(Switzerien)做。测 量肿瘤直径长轴(L)和平均中轴宽度(W)以估计肿瘤体积(V)，使用以下公式
4 L(W\2ν=-πχ-—
3 2{2)生长曲线是用小鼠肿瘤平均体积绘制的。用单克隆抗体(针对N端部分或C端 部分)治疗这些动物可以显著地延迟肿瘤的发病及进展(见图14(A)到(C))。就像在图 14(A)到(C)，显示本发明的单克隆抗体对皮下移植了 A375细胞的裸鼠体内肿瘤生长的影 响。㈧肿瘤体积随着时间的推移。(B)在杀死时摘除肿瘤的照片。(C)图⑶所示肿瘤 的重量(平均值士平均误差)。(D)在杀死时摘除肿瘤的苏木素和伊红(“H&E")染色 (单独载体)。与对照组相比，mAbM18 (针对PTHrP140-173)和mAbl58 (针对PTHrPl-33)显示对肿瘤生长和重量减少影响最大(超过75% )(请参见图14(A)、(B)及(C))。其他 mAbs (mAbl04、mAb6和mAbM45)降低了 30% -40%的肿瘤生长。图14(D)显示在杀死时摘 除肿瘤的典型A375黑素瘤细胞的苏木素和伊红染色。在心脏内注射A375细胞后，检查了单克隆抗体对肿瘤细胞转移扩散的作用。心 内的人黑色素瘤细胞A375的注射按前面所述的有关技术中程序(佐佐木等人，癌症研究 (1995年)，第55卷，第3551页)进行。在麻醉下使用27号针将A375细胞(5X IO5)悬浮 在0.1毫升PBS中，然后注入雌性裸鼠(BALB/C nu/nu)的左心室。每隔5天监视动物的肿 瘤生长和健康状况达50周。正如本申请提到，抗体治疗在细胞接种1天后开始。抗体(100 微克)被皮下注入，每隔3天达20周。对照动物被注射了 100微克非免疫性IgG或IgM(例 如，不是来自免疫了 PTHrP亚型的动物的IgM或IgG)，每隔3天达20周。对照小鼠非免疫 抗体IgG、IgM从西格玛(聖路易，密苏里州，美国)获得，并在使用之前用Centricon柱子 除盐(密理博，贝德福德，马萨诸塞州，美国)。其它对照动物注射了来自非免疫小鼠的杂交 瘤细胞培养上清液。当动物被杀死时，分析肝、肺、骨、淋巴结、心、脾、胰和肾中的肿瘤病变大小和数 量。动物的存活用所属领域已知的卡普兰迈耶分析法确定。本发明的单克隆抗体的施用导致转移抑制(请参见图15A)和存活优势(请见图 15B)。就像在图15㈧和(B)，通过内心途径移植了 A375细胞的裸鼠有提供的本发明单克 隆抗体对体内转移(宏观，请参阅图15(A))和存活(卡普兰迈耶分析法)的影响(请参阅 图 15(B))。请注意用 mAbM45(针对 PTHrPl-33)或 mAbM18(针对 PTHrP 140-173)治疗小 鼠的存活优势。百分之百的载体/对照处理的动物在肿瘤细胞移植后2个月内死亡，而用 本发明的mAb 二者之一治疗的动物超过30%在肿瘤细胞移植4个月后还活着(请参阅图 15(B))。用本发明的mAb治疗达4个月的动物尸体解剖显示宏观转移的证据30% M45治 疗的动物和18% M18治疗的动物(请参阅图15(A))。用本发明的单克隆抗体治疗的动物 大约15%在肿瘤移植后达8个月显示没有明显的健康恶化。中止此组的抗体治疗(肿瘤细 胞植入后4个月)导致50%注射了 mAbM45的动物转移扩散复发，而0%注射了 mAbM18的 动物显示没有疾病的迹象，并且注入左心室的动物尸体解剖没有证据显示转移扩散(参见 图16)。图16是一个表，代表A375细胞注入左心室的动物在本发明的单克隆抗体中止后转 移扩散的复发。这些结果显示，本发明的单克隆抗体可用于治疗黑色素瘤及其转移并发症。此外， 针对hPTHrP140-173的单克隆抗体治疗效果至少相当于针对hPTHrPl_33的单克隆抗体，指 示PTHrPl-173亚型的抑制就足以获得预期效果。本发明的单克隆抗体对A375细胞生长及侵袭的体外疗效也已证明(请参见图 12)。在检查过程中，单克隆抗体mAbM45和mAbM18显示对细胞生长最强(完全)抑制作用。 与对照(动物)相比，单克隆抗体mAbl58、mAbl04和mAb6减少了约60%的细胞生长(请 参阅图12(B))。所有测试的本发明的mAb降低50%以上的基质胶(Matrigel)入侵(请参 阅图 12(C))。实施例3人转移性乳腺癌的小鼠模型乳腺癌是女性最常见的癌症(疾病预防控制中心新闻处2003年)。乳腺癌有几
23种类型(哈里斯等人，乳腺疾病，第三版，费城，宾夕法尼亚州，利平科特威廉斯和威尔金斯 (2004年)，第971页))，最常见的一种是乳腺上皮细胞(MEC)引起的。大部分手术切除 的乳腺肿瘤中由免疫反应检测到PTHrP (紹斯等人，癌症研究(1990年)，第50卷，第7710 页)。但是，用N端区域(包括氨基酸1到34)或中区(包括氨基酸37到106)特异性的 免疫分析檢測血液中PTHrP，只在与高钙血症相关的晚期乳腺癌患者检测到此分子，但不是 在无高钙血症患者血液中(格里洛等人，临床内分泌与代谢杂志(1991年)，第73卷，第 1309页；Bundred等人(1991)，英国医学杂志，第303卷，第1506页)。使用siRNA或单克 隆抗体的PTHrP体外抑制导致生长和侵袭的抑制(请参阅图17(A)及(B))。就像在图17， 有提供的本发明的单克隆抗体的中和活性对人乳腺癌细胞MDA-MB-435细胞生长(请参阅 图17(A))和侵袭(请参阅图17(B))的影响。请注意mAbM45和mAbM18对细胞生长的强大 抑制作用(P <0.01)。针对PTHrP的C端和N端的单克隆抗体的特定类型(IgG和IgM) 之间无统计学显著性差异。请注意针对PTHrP氨基端(mAbM45)或羧基端(mAbM18)的IgM 类mAb对细胞生长的完全抑制作用。针对PTHrPl-33 (mAbl58)、PTHrP140_173 (mAbl04)或 PTHrP 151-169 (mAb6)的IgG类mAb有较小的但类似的生长抑制作用，与对照相比约30% (请参阅图17(A))。但是，如图17(B)所示，所有的mAb显示对侵袭的类似抑制作用。特异 性识别PTHrPl-173但不能识别其它亚型的抗体强烈抑制人乳腺癌细胞的生长及侵袭。单 克隆抗体处理原代正常人乳腺上皮细胞没有观察到对细胞生长影响或毒性作用。在本发明中，对PTHrPl-173亚型羧基端特异的(M18)或针对所有亚型的(M45) 单克隆抗体用于移植了人乳腺癌细胞MDA-MB-435的裸鼠(图18(A)到(D)并且表现出 对乳腺癌生长和转移扩散的抑制。图18(A)、(C)及(D)提供在移植了人乳腺癌肿瘤细胞 MDA-MB-435的裸鼠体内单克隆抗体对肿瘤生长和肺转移的效果。㈧肿瘤体积。(B)在杀 死时摘除肿瘤的苏木素和伊红(“H&E")染色。(C)在杀死时有肺转移的动物的百分比。 (D)载体处理的动物和mAb治疗的动物肺部H&E染色。为了比较显示了正常肺。T表示肿 瘤(转移)位置。人乳腺癌细胞株MDA-MB-435移植到了裸鼠的乳腺脂肪垫，并且单克隆抗体对 肿瘤生长和转移的治疗效果进行检查。当这些肿瘤细胞移植到乳房的脂肪垫时，可检查 肿瘤生长和肺部转移。肿瘤移植大约6个星期后，未经处理的动物体内的肿瘤生长达到 1.5-2. 0cm3。在此阶段大于80%的动物发生肺转移。在这个例子中，在4_5周龄雌性裸鼠 (BALB/C-nu/nu,查尔斯河)测试了单克隆抗体mAbM45和mAbM18的治疗效果，。在解剖镜 直视下，悬浮在100微升PBS的MDA-MB-435细胞(1 X IO6)被接种到手术暴露的右侧乳房脂 肪垫。细胞接种后一天治疗开始，使用100微克的抗体皮下注射，每两天一次为期6周。对 照动物被注射了 100微克非免疫IgM或来自非免疫动物的杂交瘤细胞株的上清液。原发肿 瘤生长速率用所绘制的每5天时间间隔测量的肿瘤的两个正交直径方法确定。本发明的单克隆抗体的施用导致肿瘤生长的大量减少(请参阅图18(A))和肺转 移的抑制(请参阅图18(C)及(D))。与对照动物相比，单克隆抗体PTHrPl-33(mAbM45) 或PTHrP140-173(mAbM18)抑制肿瘤生长大约50% (请参阅图18(A))。此外，用本发明的 单克隆抗体治疗的动物在杀死时肯定确定有肺转移的动物数量大约减少70% (请参阅图 18(C))。用任一单克隆抗体治疗的动物转移瘤的大小也显著减少(请参阅图10(D))。图 10(B)显示在尸体解剖时一个摘除肿瘤的典型组织学。这些结果显示本发明的单克隆抗体对乳腺癌和及其转移并发症的治疗有用。针对PTHrP140-173的单克隆抗体的疗效相当于 针对PTHrPl-33的单克隆抗体的疗效，表明PTHrPl_173亚型的抑制足以获得预期效果。实施例4前列腺癌的体外模型前列腺癌是男性最常见的癌症类型(疾病预防控制中心新闻办公室(2003年))。 相对于乳腺癌所示的溶骨性病变，它经常会扩散到骨成骨细胞病变发生的地方(Roodman， 新英格兰医学杂志(2004)，第350卷，第1655页)。PTHrP表达于大多数前列腺癌组织 (Deftos，癌(2000)第88卷，第3002页)，但它在前列腺癌进展与转移中的作用是未知的。 本发明是使用siRNA技术在两个人前列腺癌细胞株中针对体外PTHrP敲低并且表现出细 胞生长及侵袭的强烈抑制作用(图19(A))至(D))。图19显示一个图形，表示单克隆抗体 (mAbl58、mAbM45、mAbl04和mAbM18)的中和活性和siRNA对过度表达各种PTHrP亚型的 PC-3细胞生长和侵袭的影响。如图中所示，图19(A)是各种单克隆抗体和本发明的siRNA 对细胞生长的影响，这些细胞转染了单独载体或含有具体亚型的载体。图19(B)、(C)及(D) 显示mAbl58、mAbl04或siRNA对基质胶中侵袭的影响。在转染了单独载体的PC-3细胞中， 使用任何IgM mAb达到生长的适度抑制(25% )，这些抗体针对PTHrP140-173(mAbM18)或 PTHrPl-33(mAbM45)。当用针对N末端(mAbl58和mAbM45)的单克隆抗体治疗时，在过度 表达任何一种亚型(PC3/pl39、PC3/pl41、PC3/pl73)的细胞株中观察到一个对细胞生长的 强大抑制作用。相比之下，针对PTHrP140-173 (mAbl04和mAbM18)的mAb只是在过度表达 PTHrPl-173(PC-3/pl73)的细胞株中有效。使用siRNAl_22的所有亚型siRNA敲低是同样 有效的，在所有过度表达任何亚型的细胞中细胞生长减少大约40%。此外，针对PTHrP羧 基端区域的mAbs(mAbl04和mAbM18)复制了使用siRNA(siRNAl-22)时见到的所有PTHrP 抑制作用，并且与用针对PTHrP的N端区域的抗体(mAbMlS和mAbM45)观察到的效果类似 (请参见图19(B)到(E))。实施例5皮肤鳞癌体外模型皮肤癌是美国最常见的癌症。每年诊断100多万例皮肤癌(国家癌症研究所(2007 年)SEER数据库)。鳞状细胞癌是第二类最常见的皮肤癌，在美国每年诊断超过250000例 (Christenson等人，美国医学协会杂志(2005年)，第294卷，第681页)。人类皮肤鳞癌来 自正常人角质细胞的转化。肿瘤进展的一个知名模型用于此处。在此模型中，用人乳头状 瘤病毒16(" HPV16")使正常人角质细胞永生，以产生非肿瘤HPKlA细胞株。通过激活的 H-Ras癌基因的过度表达，此细胞株随后转化成癌细胞以产生HPKlAras细胞。此细胞发展 成为一个经典的鳞状肿瘤。在角质细胞肿瘤进展模型中已证明，与恶性转化相关的PTHrP 产量逐步增加。这种角质形成细胞肿瘤进展模型用于分析在HPV16HPK1A永生细胞中PTHrP过度 表达的后果。HPKlA细胞培养于贝科的改良伊格尔的培养基中(DMEM)辅以10%胎牛血清。 分流的细胞(70% )通宵转染了 2微克编码PTHrP-139，1-141或1-173亚型氨基酸序列的 表达载体或空的对照载体(pcDNA3)。在体外本发明的单克隆抗体在细胞生长的功效体现在HPKlAras细胞株的完全抑 制(和细胞毒性的证据)，并且用针对N端(mAbM45)或C端(mAbM18)的IgM类抗体观察到了类似疗效。针对迚^冲1-33(11^13158)，迚11!1冲140-173(11^13104)和 hPTHrP151_169 (mAb6) 的单克隆抗体的IgG类抑制细胞生长约40%，无细胞毒性的证据(见图20 (A)左面板)。图 20(A)(右面板)显示一个图形，表示特异性地针对不同亚型的mAb中和活性对非致瘤永生 HPKlA细胞和原代正常人角质形成细胞(NHK) (CloneticsJ^H)的生长的影响。没有看到 mAb对母细胞(HPKlA)或NHK细胞生长的抑制作用(细胞毒性作用的证据)。图20 (B)显示针对特定PTHrP亚型的本发明的siRNA对PTHrP产生的效果。针对 所有亚型的siRNA(siRNAl-22)在4天后抑制PTHrP产生超过90%，并且特异性地针对每 个亚型(PTHrP-139 (siRNAl-139)，PTHrPl-141 (siRNAl-141)和 PTHrPl-173 (siRNAl-173)) 的siRNA抑制PTHrP约30 %。每个亚型也受到siRNA敲低，就像在图20 (B)，即 PTHrP 1-139 (siRNAl-139)、PTHrPl-141 (siRNAl-141)和 PTHrPl-173 (siRNAl-173)。在图 20(B)中可以看出，每个亚型(siRNAl-139+siRNAl-141+siRNAl-173)的siRNA抑制的累积 影响大体相当于使用siRNAl-22的总抑制作用，siRNAl-22识别所有的亚型。siRNA 构建siRNAl-22 要通过siRNA敲低实验抑制总PTHrP，PTHrP正义和反义链选择的序列 如下正义 5' -CACCA GCT GTG TCT GAA CATCAG CTC C TTC AAG AGA G GAG CTG ATG TTC AGA CAC AGC-3 ‘；反义 5' -AAAA GCT GTG TCT GAA CAT CAG CTC C TCT CTT GAA GGAG CTG ATG TTC AGA CAC AGC T-3'。此寡核苷酸序列的衍生基于N-末端区hPTHrP氨基酸 残基1到7(丙氨酸缬氨酸丝氨酸谷氨酸组氨酸谷氨酰胺亮氨酸)的序列。siRNAl-139 为抑制该PTHrPl_139亚型，PTHrP正义和反义链选择的序列如下正 义5' -CACCA TAA CAG GCT TCT CTG GCC CGTA TTC AAG AGA T ACG GGC CAG AGA AGC CTG TTA-3 ‘；反义 5' -AAAA TAA CAG GCT TCT CTG GCC CGT A TCT CTT GAA T ACGGGC CAG AGA AGC CTG TTA T-3'。此寡核苷酸序列的衍生基于hPTHrPl_139的3'未翻译端序列 (5' -CACCA TAA CAG GCT TCT CTGGCC CGT A-3')第七外显子中。siRNAl-141 要抑制PTHrPl-141亚型，PTHrP正义和反义链选择的序列如下正义 5' -CACCA AGG CAT TGA AAT TTT CAG CAG ATTC AAG AGA T CTG CTG AAA ATT TCA ATG CCT-3 ‘；反义 5' -AAAA AGG CAT TGA AAT TTT CAG CAG A TCT CTT GAA T CTGCTG AAA ATT TCA ATG CCT T-3'。此寡核苷酸序列的衍生基于hPTHrPl-141氨基酸140-141 (精氨 酸组氨酸)和3'未翻译端的顺序(5' -CACCA AGG CAT TGA AAT TTT CAG CAG Α)第九外 显子中。siRNAl-173 要抑制PTHrPl-173亚型，PTHrP正义和反义链选择的序列如下正义 5' -CACCA ACA GCA CTT CTG TGG GGT TTG ATTC AAG AGA T CAA ACC CCA CAG AAG TGC TGT-3 ‘；反义 5' -AAAA ACA GCA CTT CTG TGG GGT TTG A TCT CTT GAA T CAAACC CCA CAG AAG TGC TGT T-3'。此寡核苷酸序列的衍生基于hPTHrPl_173羧基端顺序(氨基酸 140到146之苏氨酸丙氨酸亮氨酸亮氨酸色氨酸甘氨酸亮氨酸)。本发明的siRNA构建中的寡核苷酸序列与使用BLAST程序(基因序列数据库)获 得的任何基因序列没有同源性。上述看到的合成寡核苷酸序列是由英杰(Irwitrogen)生 命科技公司(伯林顿，安大略省)制备，退火后生成一个短的双链寡核苷酸。按照制造商的 规格使用一个BLOCK-iT 诱导型HlRNAi入门载体试剂盒(Invitrogen生命技术，伯灵顿， 安大略省)，把siRNA克隆到pENTRTM/Hl/TO载体中。抗hPTHrP的siRNA构建在使用前已
26测序(谢尔顿生物技术中心，麦吉尔大学，蒙特利尔，加拿大)。在无血清DMEM培养基中使 用10微升脂质体(GibcoBRL，伯灵顿，安大略省，加拿大)通宵瞬时转染细胞，用2微克的 抗PTHrP的siRNA质粒构建或单独的pENTRTM/Hl/TO载体。然后把培养基换成辅以10%胎 牛血清的DMEM。转染的A375、PC-3和HPKlAras细胞的生长及侵袭然后被评估(请参见图 13，19 到 20)。PTHrP 表达本发明PTHrP的表达载体构建如下。根据制造商的科学实验计划(安法玛西亚生物技术公司，Baied' Urfe，魁北克， 加拿大)，用快速准备微mRNA纯化试剂盒分离聚㈧+mRNA。经过沉淀，mRNA被溶解到二乙 基焦碳酸酯处理的水中并受脱氧核糖核酸酶I处理。在1毫摩尔浓度的每个dNTP、20单位 核糖核酸酶抑制剂(安法玛西亚生物技术公司，Baie d' Urfe，魁北克，加拿大)和反应缓 冲液的存在下，使用逆转录酶(Superscript RT，200单位/微升，GIBCO BRL，伯灵顿，安大 略省)把2微克从细胞分离的聚(A)+HiRNA用作随机引物法的第一链合成模板，于摄氏37度 为2小时。然后在1毫摩尔浓度的每个dNTP、2. 5毫摩尔浓度的MgCl2，500纳克引物和反应 缓冲液的存在下，用PCR(92°C 1分钟；55°C 1分钟和72°C 1分钟；共30个循环)扩增cDNA， 使用了热浴缸 DNA聚合酶(3.0单位/微升，安法玛西亚生物技术公司，Baie d' Urfe，魁 北克，加拿大)。下面的寡核苷酸引物(麦吉尔大学谢尔顿生物技术中心，蒙特利尔)用来 扩增546，550和846碱基对cDNA片段，对应于人PTHrP的cDNA的3种亚型如上文(请参 阅图3(A))(i)正向 N-38 5' AGA CGA TGC AGC GGA GAC TGG TTC A3'；(ii)反向 C139 :5' CCA GAG AAG CCT GTT ACC GTGAAT CG3'；(iii)反向 C141 5' GGT CTC TGC TGA AAA TTT CAA TGC C3'；及(iv)反向 C173 5' GCA GGA TAG GTC ATT CAC TGT GCT C 3'以下的寡核苷酸引物用来扩增对应于基于其已发表的序列的人PTH/PTHrP的1型 受体cDNA的1780碱基对cDNA片段。(I)正向 PRIN:5' ATG GGG ACC GCC CGG ATC 3'；及(II)反向 PRIC 5' TCA CAT GAC TGT CTC CCA CTC 3'应用RT-PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶中进行了分析，使用Ikb的DNA(GIBC0 BRL, 伯灵顿，安大略)作为分子量标记。PCR产物的核苷酸序列用自动测序(麦吉尔大学谢尔登 生物技术中心，蒙特利尔)确定。然后使用TA克隆试剂盒(Irwitrogen生命技术，伯灵顿，安大略省)把PCR产物 克隆到pCRII载体中。接着把所有三个PTHrP cDNA亚型插入到pcDNA3表达载体的EcoRI 限制性内切酶位点(Invitrogen生命技术，伯灵顿，安大略)，以便在巨细胞病毒启动子的 启动下得以表达，并且其序列测序发现与发表的人PTHrP的cDNA序列相同(安田等人1988 和序列数据库J04710)。为了在体外和体内使用荧光检测或影像检测肿瘤细胞中的蛋白质产物表达， PTHrPl-173的编码序列还融合了绿色荧光蛋白(GFP)，使用pEGFP-Nl载体(Clon-tech公 司实验室公司，山景城，加州)的EcoRI/BamHI限制性内切酶位点。GFP克隆到了 PTHrp的 下游，因此在可能表达特殊PTHrP亚型的细胞中共表达。
稳定转染了包含PTHrPl-173亚型cDNA的pcDNA3表达载体的HPKlA细胞现称为 ΗΡΚ1Α/ρ173。稳定转染了包含PTHrPl-141亚型cDNA的pcDNA3表达载体的HPKlA细胞现 称为ΗΡΚ1Α/ρ141。稳定转染了包含PTHrPl-139亚型cDNA的pcDNA3表达载体的HPKlA细 胞现称为ΗΡΚ1Α/ρ139。在稳定转染的细胞ΗΡΚ1Α/ρ173、ΗΡΚ1Α/ρ141和ΗΡΚ1Α/ρ139中，显示出在各亚型过 度表达后人乳头状瘤病毒16永生细胞的形态学变化。图1 (A)到1 (C)显示HPKlA细胞中 PTHrPl-141和1-173亚型过度表达对细胞生长(图1(A))、细胞形态学(图1(B))和在软琼 脂中生长(图1(C))的影响。ΗΡΚ1Α/ρ173中PTHrPl-173亚型的过度表达导致这些细胞被 拉长并且在多层次生长(请参阅图1(B))。转染了 PTHrPl-173的细胞(ΗΡΚ1Α/ρ173)的生 长速度、细胞形态及不依赖支持物生长增加(P < 01)。如图1 (A)到1 (C)所示，PTHrPl-141 的过度表达(ΗΡΚ1Α/ρ141)或载体的单独转染(HPK1A/载体)并不影响HPKlA细胞的形 态，这些细胞仍然与野生型细胞(HPKlA)相同(请参见图1(B))。过度表达PTHrPl-173的 HPKlA (ΗΡΚ1Α/ρ173)细胞，但既不是过度表达PTHrPl-141 (ΗΡΚ1Α/ρ141)的细胞也不是对照 细胞HPKlA/载体和野生型HPK1A，在软琼脂中形成集落(请参阅图(C))。ΗΡΚ1Α/ρ173细胞被皮下移植到裸鼠并显示肿瘤生长，此生长在裸鼠移植了对照 HPKlA细胞或过度表达PTHrPl-141 (ΗΡΚ1Α/ρ141)的HPKlA中看不到(请参见图2(A)和 2(B))。图2(A)是一张照片，显示裸鼠体内摘除的皮下病变，此裸鼠移植了 PTHrP过度表 达细胞(ΗΡΚ1Α/ρ173和ΗΡΚ1Α/ρ141)、对照HPKlA细胞(野生型HPKlA和表达单独载体的 HPK1A)，以及移植了 HPKlAras细胞的小鼠阳性对照肿瘤。如图2(B)所示，移植了相同细胞 株的裸鼠有提供的体内肿瘤生长速度，其中只有转染PTHrPl-173 (HPK1A/P173)的HPKlA细 胞在裸鼠产生肿瘤，类似移植了恶性细胞株HPKlAras的小鼠。移植了 HPKlAras细胞的小鼠 用作阳性对照(请参阅图2(A))。五分之五(100%)小鼠移植了转化的HPKlA细胞(HPK1A/ P173)或HPKlAras细胞会在4个星期内产生肿瘤，而移植了母细胞株(HPKlA)的老鼠没有 产生肿瘤(显示小摘除的病变是纤维化的，没有肿瘤细胞的证据)。染色体核型分析已转化 的ΗΡΚ1Α/ρ173细胞证实细胞来源。这些转化细胞的体外形态学和体内行为类似于H-ras癌基因转化的HPKlA细胞 (HPKlAras,林等人，癌基因(1989年)，第4卷，第1403页)，指示PTHrPl-173亚型的过度 表达有致癌特性。值得注意的是，只是PTHrPl-173但不是PTHrPl-141亚型的过度表达导 致体外细胞转化和体内肿瘤生长(见图1和2)。RT-PCR结果显示，三种亚型在已转化的HPKlAras细胞以及其他恶性细胞表达(图 3(A)到 3(D))。就像在图 3，RT-PCR 显示三种亚型(PTHrPl-139、PTHrPl-141、PTHrPl_173) 在HPKlAras、A375和MDA-MB-435人肿瘤细胞株的表达。图3 (A)提供用于RT-PCR的引物位 置，而图3 (B)显示该细胞株中的三种亚型的RT-PCR表达的结果。图3 (C)提供PTH/PTHrP 的1型受体的RT-PCR表达。这说明该受体和其配体共同在同一个细胞株表达。就像在图4(A)至(D)，PTHrP亚型在其它细胞株(包括前列腺肿瘤细胞株PC_3、 Cos-7细胞、A375人黑色素瘤细胞和永生化人近端肾小管细胞株R67)的过度表达有提供的 对细胞形态的影响。图4(A)提供R67永生人肾近端小管细胞。图4(B)提供转化了 SV40A 的非洲绿猴肾细胞(Cos-7细胞)。图4(C)提供人前列腺癌PC-3细胞。图4(D)提供了 A375人黑色素瘤细胞。下部面板显示细胞共同表达绿色荧光蛋白与不同亚型的A375细胞(请参阅图4(E))。就像在图4(A)至(C)，只有PTHrPl-173亚型的稳定过度表达诱导形态学改变，但 不是转染独自载体或PTHrPl-139或1-141亚型的细胞。PTHrPl_173过度表达增强体外侵 袭，此处由基质胶测定评估。使用涂有基质胶的Costar24孔transwell细胞培养室，由8. 0 微米微孔的聚碳酸酯膜(康宁公司，康宁，纽约州)隔开。这些小室以前已经显示允许人黑 色素瘤细胞的侵袭。小室底部膜涂有基质胶基底膜(基质胶30微克/毫升)混合物(贝 克顿狄金森医学实验，贝德福德，马萨诸塞州)在室温层流罩中紫外线下培养48小时，并储 存在摄氏四度。用0.2毫升的无血清培养基把涂的膜水化2小时。若要检查趋化性，吸去 水化液并向每孔添加700微升含10%胎牛血清的DMEM。用胰酶消化细胞，用无血清培养基 洗两次。把5X IO4细胞重悬到0. 5毫升无血清培养基中，种于上室并在含5% C02的37°C 加湿纟目织培养箱中培养24小时。然后去掉培养基，将膜上侧面剩余的细胞用棉签擦掉并用 PBS洗两次。迁移到膜下侧和那些生长在该膜的下表面的入侵细胞用含0.5%戊二醛、2% 多聚甲醛和pH为7. 4的0. 1摩尔浓度磷酸缓冲液固定30分钟，用甲苯胺蓝溶液染色，装到 玻璃片上。在显微镜(尼康，Eclipse TE300，日本；数码摄像机C4742-98，卢德尔电子产品 有限公司，霍桑，纽约州655)下计数每个膜的10个随机视野，以确定侵入细胞平均数。数 据表示为三个独立实验中达到膜下表面细胞的数量平均值(士标准误)，请参见图12、13到 17。从不同的细胞株收集到的条件培养基中产生的PTHrP的分析是用一个针对 PTHrPl-86的PTHrP放射免疫分析法(DSL的8100，诊断系统实验室，韦伯斯特，得克萨斯 州)。它的灵敏度为0. 3pmol/升(3. 0皮克/毫升)。在一定的时间间隔收集条件培养基， 离心清除碎片，并存储在摄氏零下八十度，直到检测。非条件、含10%胎牛血清的DMEM培养 基作为空白，并从所有值中扣除。在用PTHrP亚型转染之前，细胞产生不同水平的PTHrP，最 高在A375细胞中和最低在PC-3和HKPlA细胞中看到。转染细胞都产生了高水平的PTHrP， 如表1所示。实施例6条件性敲除模型PTHrP基因特定地在乳腺上皮细胞中消融的条件性基因敲除模式已开发。在此模 型中，Cre/LoxP重组系统用来破坏人乳腺癌(PyVMT)转基因小鼠模型的乳腺上皮细胞中 PTHrP的功能。在此模型中，100%的动物的增生发生在4到5周，腺癌在7到8周，肺转移 在12到13周。携带有条件的PTHrP等位基因的小鼠(其中第四编码外显子的两侧各插入 了 1个LoxP重组位点)在FVB背景下回交。这些小鼠首先与乳腺肿瘤模型PyVMT回交，然 后再与一个不同的在乳腺上皮表达Cre的转基因种(MMTV/Cre)回交，都在FVB背景下。使 用分子和组织学方法证实了 PTHrP等位基因的有针对性的切除。正常FVB动物的PTHrP的 消融不干扰乳腺导管生长。卡普兰Meier分析表明，PyVMT动物的PTHrP消融显著推迟了 肿瘤的发生(见图21 (A))。年龄在50天时，与杂合子(PyVMT-PTHrP+/fIox-Cre+) 67天时 (P < 0. 005)和纯合子(PyVMT-PTHrPf lox/f Iox-Cre+) 78 天时(P < 0. 001)的动物相比， 50% 的对照动物(PyVMT-PTHrPf lox/f Iox-Cre-和 PyVMT-PTHrP+/+-Cre+)有触及肿瘤。此 夕卜，在PyVMTf lox/+-Cre+和PyVMT-PTHrPf lox/f Ιοχ-Cre+两种动物中各时间点观察到肿瘤 生长随着时间的推移显著减缓。肿瘤重量在杀死时在纯合子(67士5%，p < 0. 001)和杂合
29子动物(48士8%，p< 0.005)显著降低(见图21㈧及(B))。最后，在杀死时肺部转移扩 散可在14/14对照动物、0/13纯合子动物和6/14杂合子动物中看到。肿瘤组织的分子与免 疫组织化学分析显示，肿瘤进展的标志物(包括细胞周期蛋白Dl、Neu/Erb2和Ki67)在纯 合 PyVMT-PTHrPflox/flox-Cre+ 动物中 80%受抑制和在杂合 PyVMT-PTHrPflox/+-Cre+ 动 物中减少40%。Bagi C. Skeletal compl icat ions of malignanct-Third North AmericanSympοsium. IDrugs(2002) 5 :553_556·Birch MA et al. Parathyroid hormone (PTH)/PTH-related protein (PTHrP) receptor expression and mitogenic responses in human breast cancer cell lines. Br JCancer(1995) 72 :90_5.Bouizar Z et al. Polymerase chain reaction analysis of parathyroid hormone—related protein gene expression in breast cancer patients and occurrence of bonemetastases. Cancer Res(1993) 53 :5076_8.Bundred et al. Parathyroid hormone related protien and hypercalcemia inbreast cancer. Br Med J(1991) 303 :1506-1509.Budayr AAet al. Increased serum levels of a parathyroid hormone-like proteinin malignancy-associated hypercalcemia. Ann Intern Med(1989)111 :807-812.Campos RV et al. Differential expression of RNA transcripts encoding unqiuecarboxy-terminal sequences of human parathyroid hormone-related peptide. Mol. Endocrinol. (1994)8 1656-66.Carron JA et al.PTHrP and the PTH/PTHrP receptor are co-expressed inhuman breast and colon tumors. Br J Cancer(1997) 76 1095-8.CDC Press Release. Latest cancer incidence report shows prostate leadingcancer among men, breast cancer leads for women. (2003) http://www. cdc. gov/cancerChristenson LJ et al. Incidence of basal cell and squamous cell carcinomas in apopulation younger than 40years. JAMA(2005) 294 :681-690.Deftos LJ. Prostate carcinoma. Production of bioactive factors.Second NorthAmerican Symposium on Skeletal Complications of Malignancy(1999).Diel IG et al. Reduction in new metastases in breast cancer with adjuvantclodronate treatment. N Engl J Med(1998) 339 :357_363.Fahn HJ et al. The incidence and prognostic significance of humoralhypercalcemia in renal cell carcinoma. J Urol(1991) 145 248~250.Grill V et al. Parathyroid hormone-related protein :elevated levels in bothhumoral hypercalcemia of malignancy and in hypercalcemia complicating metastaticbreast cancer. J Clin Endocrinol Metab(1991) 73 :1309-1315·Grone A et al. Cloning and sequencing of the 3 ' region of the canineparathyroid hormone-related protein gene and analysis of alternative mRNA splicingin two canine carcinomas. Domest. Anim. Endocrinol. (2002)22(3) 169-77.
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表1不同细胞株在转染多种PTHrP亚型的前后PTHrP的产量
权利要求
一种分离的抗体能够与一个PTHrP1 173亚型的N端部分特异性地结合。
2.一种分离的抗体能够与一个PTHrPl-173亚型的C端部分特异性地结合。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其中抗体是多克隆抗体。
4.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其中抗体是单克隆的抗体。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的分离的抗体，其中的抗体与一种诊断剂 或治疗剂连接。
6.根据权利要求5所述的分离的抗体，其中的诊断剂是一个报告分子。
7.根据权利要求6所述的分离的抗体，其中报告分子选自一个酶、放射性同位素、荧 光、化学发光化合物组成的小组。
8.根据权利要求5所述的分离的抗体，其中治疗剂选自细胞毒性剂、前药、药物组成的小组。
9.根据权利要求1和3至8中任一权利要求所述的分离的抗体，其中N端部分包括氨 基酸残基1至33。
10.根据权利要求2至8中任一权利要求所述的分离的抗体，其中C端部分包括氨基酸 残基140至173。
11.根据权利要求2至8中任一权利要求所述的分离的抗体，其中PTHrPl-173的C端 部分包括氨基酸残基151至169。
12.—种产生抗体的方法，包括(a)给予宿主动物一种多肽抗原，以诱导宿主动物 针对此抗原的抗体的产生，此多肽抗原选自由下列部分组成的小组一个或多个PTHrP亚 型的N端部分氨基酸残基1至33、PTHrPl-173亚型的C端部分氨基酸残基140至173和 PTHrPl-173亚型的C端部分氨基酸残基151至169 ； (b)监测由施予宿主动物肽抗原所产 生的抗体滴度；(c)提取宿主动物产生的抗血清；和(d)从抗血清中分离和选择至少一种抗 体。
13.根据权利要求12所述的方法，其中的动物是小鼠。
14.一种治疗癌症细胞生长和转移的方法，此方法包括给予需要这样治疗的对象有效 量的分离的抗体，此抗体与一个或多个PTHrPl-173亚型的N端部分或PTHrPl-173亚型的 C端部分特异性地结合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中抗体是多克隆抗体。
16.根据权利要求14所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
17.根据权利要求14至16中任一权利要求所述的方法，其中抗体连接到一种治疗剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中的治疗剂是选自一个细胞毒性剂、前药、药物组 成的小组。
19.一种以诊断一种疾病的活动性或转移扩散的方法，此方法包括给予需要这样 治疗的对象有效量的分离的抗体，此抗体与一个或多个PTHrPl-173亚型的N端部分或 PTHrPl-173亚型的C端部分特异性地结合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中抗体是多克隆抗体。
21.根据权利要求19所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
22.根据权利要求19至21中任一权利要求所述的方法，其中的抗体与一种诊断剂连接。
23.根据权利要求22所述的方法，其中的诊断剂是选自一个酶、放射性同位素、荧光、 化学发光化合物组成的小组。
24.根据权利要求19至23中任一权利要求所述的方法，其中诊断是在高钙血症的发生 之前做出。
25.根据权利要求19所述的方法，其中的疾病是选自乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、卵 巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤组成的小组。
26.—种调节一个或多个PTHrPl-173亚型的表达的方法，通过给予与编码人PTHrP的 核酸分子杂交的siRNA分子。
27.根据权利要求26所述的方法，其中的亚型是PTHrPl-173。
28.—个siRNA的组成包括一个能与编码一个或多个人类PTHrP的亚型的核酸分子杂 交的siRNA分子。
29.根据权利要求28所述的siRNA的组成，其中的亚型是人类PTHrPl-173。
30.根据权利要求28所述的siRNA的组成，其中siRNA包含编码人PTHrP的N端区域 氨基酸残基1-22的核苷酸序列。
31.根据权利要求28或29所述的siRNA的组成，其中siRNA包含编码人PTHrP的C端 区域氨基酸残基140-146的核苷酸序列。
32.根据权利要求28所述的siRNA组成，其中siRNA包含编码人PTHrP的N端区域氨 基酸残基1-22和C端区域氨基酸残基140-146的核苷酸序列。
33.一种抑制病人PTHrP表达的方法，包括给予病人与病人编码人PTHrP的核酸分子杂 交的siRNA分子从而实现抑制。
34.根据权利要求33所述的方法，其中病人已被诊断为选自乳腺癌，肺癌，结肠癌，胰 腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌和黑色素瘤组成的小组的疾病。
35.分离的杂交究I细胞存放于国际保存加驾f理局登录号150807--02。
36.分离的杂交究I细胞存放于国际保存加驾f理局登录号150807--01。
37.分离的杂交究I细胞存放于国际保存加驾f理局登录号150807--03。
38.分离的杂交揭富细胞存放于国际保存加驾大 f理局登录号060808--01。
39.分离的杂交揭富细胞存放于国际保存加驾大 f理局登录号060808--02。
全文摘要
本发明涉及通过抑制PTHrP，其亚型或者PTHrP信号的作用和产生诊断和治疗疾病，优选抑制肿瘤生长及其进展到转移位点。本发明的一个方面还涉及通过其拮抗剂，包括单克隆抗体和针对其的siRNA抑制PTHrP1-173亚型的方法。本发明可以适用于多种疾病状态，包括但不限于表达PTHrP及其亚型的几种类型的癌症(包括上皮癌例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和鳞状细胞癌以及黑色素瘤)，单独或与其他治疗药物组合。
文档编号C12N15/113GK101952433SQ200880112153
公开日2011年1月19日 申请日期2008年8月18日 优先权日2007年8月17日
发明者理查德·克雷默, 黄道超 申请人:百奥克罗姆制药公司