专利名称：巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的羧酸产生成员的制作方法
巴斯德氏菌科(PasteureIIaceae)的羧酸产生成员本发明涉及最初从牛瘤胃中分离的，命名为DDl的新细菌菌株，其具有产生有机酸，尤其是琥珀酸(SA)的能力，并能够利用甘油作为碳源；还涉及来自所述菌株的保留该能力的变体菌株；以及涉及通过使用所述微生物产生有机酸，尤其是琥珀酸的方法。
背景技术：
因为来自生物质的琥珀酸(SA)代表合成树脂的重要成分或者是更具价值的低分子量化合物，尤其是四氢呋喃(THF)、1，4-丁二醇(BD0)、γ-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮的来源，来自所述酸的发酵产物早已经引起了很大关注(W0-A-2006/066839)。Lee等(2002a)描述了从牛瘤胃中分离的SA产生菌。所述细菌是不运动的、无孢子形成的、嗜中温且嗜二氧化碳的革兰氏阴性棒状或球杆菌。基于16S rRNA序列的系统发生分析及生理学分析表明所述菌株作为新的物种属于Marmheimia属，并已经命名为曼海姆产琥珀酸菌(Mannheimiasucciniciproducens) MBEL55E。在 100% CO2 条件下，其在 6. 0-7. 5 的PH范围内生长良好并产生2 1 1恒定比的琥珀酸、醋酸和甲酸。当曼海姆产琥珀酸菌MBEL55E在CO2-饱和葡萄糖作为碳源进行厌氧培养时，在温育的7. 5小时里消耗19. Sg/ L葡萄糖并产生13. 3g/L的SA。然而，所述生物的显著缺点是其不能代谢甘油的能力，所述甘油作为三酰甘油 (TAG)的组分可容易地获得(Dharmadi等，2006)，例如作为生物柴油生产的转酯反应中的副产物。已经在科学文献中描述了来自甘油的琥珀酸发酵产物(Lee等，2001 ；Dharmadi 等，2006)，并且利用甘油比利用常见的糖，如葡萄糖，可获得更高的产率[产生的SA的量/ 消耗的原材料的量](Lee等，2001)。然而，利用甘油获得的空间时间产率比利用葡萄糖获得的低得多(0. 14相比于1.0gSA/[L h])并且没有使用任何粗甘油。仅在少数情况下曾经描述过甘油到发酵产物的厌氧代谢。大肠杆菌(E.coli)能够在非常特定的条件下如酸性PH、避免发酵气体氢气积累以及适当的培养基组分下发酵甘油(Dharmadi等2006，Yazdani和Gonzalez2007)。许多微生物能够在外部电子受体存在下发酵甘油(呼吸代谢)，很少能够这样发酵(即在缺少电子受体的情况下)。已经在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)家族的几个物种中，如弗氏柠檬酸细菌(Citrobacterfreundii) 和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中详细研究了甘油的发酵代谢。这些生物中的甘油异化与其合成高度还原产物1，3-丙二醇(1，3-PD0)的能力紧密相关(Dharmadi等 2006)。已经报道了使用产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens) 将甘油转化成琥珀酸(Lee等2001)。该研究表明可以通过使用甘油作为碳源，在极少形成副产物醋酸的情况下产生琥珀酸，因此促进琥珀酸的纯化。通过间歇地喂饲甘油和酵母提取物获得最高产率，这是导致产生大约19g/L琥珀酸的策略。然而注意到，甘油发酵发生需要在酵母提取物中存在的未鉴定营养组分。通过酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)和丙酮酸羧化酶(PycA)催化的草酰醋酸盐的羧化反应利用HC03_作为CO2来源(Peters-Wendisch， PG等)。因此，碳酸氢盐(hydrogencarbonate)来源如NaHC03、KHCO3> NH4HCO3等可应用于发酵和培养基来提高HCO3-在底物向琥珀酸代谢中的有效性。迄今为止，在现有技术中未曾发现琥珀酸从葡萄糖的产生依赖于HC03_的添加。厌氧生物的生物量产生受限于从发酵途径产生的ATP的量。在厌氧生物中甘油的生物量产率比糖类，所述糖类像己糖如葡萄糖、果糖，戊糖如木糖、阿拉伯糖，和二糖如蔗糖或麦芽糖的生物量产率低(Lee等2001，Dharmadi 2007)。然而，因为糖类(Saccharides)相对于多元醇甘油具有更低的还原态，理论上， 糖类比甘油以显著更低的产率转化成琥珀酸。已经发现糖类与甘油的组合在产生琥珀酸的厌氧生物中起作用(Lee等2001)，但不能达到琥珀酸高于^g/l的值(titer)。因此，需要其他细菌菌株，其具有从甘油产生有机酸，尤其是SA的能力。具体而言，此类菌株应该以高生产率从甘油产生所述酸，尤其是如果使用例如来自生物柴油产品的粗甘油而不需前期纯化。发明概述本发明目标是提供具有从甘油，尤其是粗甘油产生琥珀酸能力的细菌菌株。本发明人解决了该目标，其令人惊奇地分离了具有期望的代谢特征的新细菌菌株，命名为DDI。附图简述
图1显示DDl的系统树。图 2 显示 DDl 的 16S rDNA 序列(SEQ ID NO :1)。图3显示DDl的23S rDNA序列(SEQ ID NO 2)；其与“曼海姆产琥珀酸菌"MBEL55E 的相应6个单独序列的比对；其中DDl序列(下)与MBEL55E序列之间的差异示于单独的附件1中；图4显示DDl的光学显微镜图像。图5显示在不同的初始葡萄糖浓度下DDl的NH4OH控制分批培养。图6显示在不同温度和pH值下DDl的NH4OH控制分批培养。图7显示DDl的NH4OH控制分批培养。图代表酵母提取物⑴、蛋白胨⑵和玉米浆(C)的初始浓度[g/L]。图8显示在含有和没有蛋白胨的情况下在DDl的NH4OH控制分批培养中获得的副产物。图9显示在葡萄糖作为碳源的情况下DDl需氧分批培养的结果。图10显示如Lee等，2002a和200 所述，在含有葡萄糖的(X)2饱和条件下DDl 的厌氧分批培养的结果。发明详述本发明的第一个实施方案涉及命名为DDl的细菌菌株，其可从牛瘤胃中分离，并能够利用甘油(包括粗甘油)作为碳源；并涉及来自其的保留该能力的变体菌株。优选地，所述菌株具有从甘油(包括粗甘油)，尤其是在厌氧条件下产生琥珀酸的能力。具体而言，所述新菌株具有SEQ ID N0:1的16S rDNA或显示至少96、97、98、99或 99. 9%序列同源性的序列；和/或SEQ ID NO :2的23SrDNA或显示至少95、96、97、98、99或 99. 9%序列同源性的序列。
两条核苷酸序列之间的“同一性”或“同源性”指在比对序列全长上的残基的同一性，例如在来自生物信息学软件包EMBOSS (版本5. 0. 0，http://emboss, sourceforge. net/what/)的程序needle的帮助下(对十分相似的序列)计算的同一性，所述程序具有默认参数-空位开放(开放空位的罚分)10.0-空位延伸(延伸空位的罚分)0·5-数据文件(软件包中包括的得分矩阵)EDNAFUL菌株DDl的23S rDNA序列与“曼海姆产琥珀酸菌” MBEL55E的相应6个单独序列的比对示于附件1中。其中，强调了 DDl序列(下)与MBEL55E序列的6个23S rDNA序列之间的差异。所述DDl序列(也参阅SEQ ID NO 2)代表通过测序PCR扩增的DDl的23S rDNA获得的序列信息。测序实验产生了确切的序列信息，说明来自DDl的23S rDNA信息可用作DDl菌株的辨别特征。所述DDl序列与各MBEL55E序列在至少6个序列位置上不同。 最显著的差异是在各MBEL55E序列中(接近位置1325)约13!3bp的插入，其在DDl序列中是缺失的。其他显著的特定序列差异在位置451、1741、2040、2041、2045和2492处(如比对中使用的编号)。本发明的菌株也优选显示至少一个以下额外的代谢特征a)从蔗糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下；b)从麦芽糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下；c)从D-果糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下；d)从D-半乳糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下；e)从D-甘露糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下；f)从D-葡萄糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下；g)从D-木糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下；h)从L-阿拉伯糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下；i)不利用木糖醇、肌醇和山梨醇；j)在需氧和厌氧条件下均生长；k)在75g/L和更高的初始葡萄糖浓度下生长；1)铵耐受。具体而言，所述菌株显示至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或全部所述额外特征。例如，进一步分析DDl共代谢糖类和多元醇甘油的能力。发现DDl能够共代谢麦芽糖与甘油，导致生物量形成、琥珀酸形成，同时还有麦芽糖和甘油的利用。应以其最广泛意义理解术语“酸”(在如本文涉及的有机单羟酸或二羟酸的上下文中，i. P.醋酸、乳酸和琥珀酸)，并也包括其盐，例如碱金属盐，像Na和K盐，或碱土金属盐， 像Mg和Ca盐，或铵盐；或所述酸的酐。术语“粗甘油”应理解为在这样的过程中产生的未加工的含甘油的流体，其中甘油是副产物，例如生物柴油或生物乙醇的产物。除非另有说明，如本文所用的术语“甘油”也包括“粗甘油”。在优选的实施方案中，本发明涉及保藏于DSMZ并具有保藏号DSM18M1的细菌菌株DD1，和来自其的变体或突变体菌株。所述变体和突变体保留至少其从甘油、蔗糖、麦芽糖、D-葡萄糖、D-果糖和/或D-木糖产生琥珀酸(SA)的能力。具体而言，它们也具有SEQ ID NO 1的16S rDNA或显示至少96、97、98、99或99. 9%序列同一性的序列；和/或SEQ IDNO 2的23S rDNA或显示至少95、96、97、98、99或99. 9%序列同一性的序列。所述DDl 菌株的变体或突变体具有不同于SEQ ID N0:2的23SrDNA，但保留如上讨论的至少一个序列差异，其使所述23S rDNA序列区别与MBEL 55E菌株的23S rDNA序列。例如，132bp的插入也在此类变体或突变体中缺失，任选地与附件1比对中描述的一个或更多个其他特定序列差异组合。根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以至少0. 5g/g高达约1，^g/g的产率系数 YP/S ；例如至少 0，6g/g、至少 0. 7g/g、至少 0. 75g/g、至少 0. 8g/g、至少 0. 85g/g、至少 0. 9g/ g、至少 0. 95g/g、至少 1. Og/g、至少 1. 05g/g、至少 1. lg/g、至少 1. 15g/g、至少 1. 20g/g、至少1.22g/g、至少l.Mg/g的产率系数YP/S将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸。根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以至少1.(^/^、或> 1.(^/^、或> 1.05g/ g、或〉1. lg/g、或〉1. Mg/g、或〉1. 20g/g、或〉1. 2^/g、或〉1. 24g/g 高达约 1，28g/g 的产率系数YP/S将至少^g/L的甘油转化成至少28. lg/L的琥珀酸。例如，28g/L的甘油可转化成高达约40或高达约35g/L琥珀酸。根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以至少0.6g gDCW^tT1琥珀酸、或至少 0. 65、至少0. 7g gDCW^T1、至少0. 75g gDCW、—1、或至少0. 77g gDOTl·1琥珀酸的特定生产产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸。根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以对琥珀酸而言至少2. 2g/(Lh)、或至少 2. 5、至少2. 75、至少3、至少3. 25、至少3. 5或至少3. 7g/(L * h)琥珀酸的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸。根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以对琥珀酸而言至少2. 2g/(L h)、或至少 2. 5、至少2. 75、至少3、至少3. 25、至少3. 5或至少3. 7g/(L h)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少^g/L的至少一种碳源转化成琥珀酸。根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以至少0，6g g DCW4IT1或至少0.65或至少 0. 7g gDCW—1!!-1琥珀酸，或至少0. 77g gDCW—i—1琥珀酸的特定生产产率，和对琥珀酸而言至少2. 2g/(L h)、或至少2. 5、至少2. 75、至少3、至少3. 25、至少3. 5或至少3. 7g/(L * h)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、 D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸。在如上定义的本发明细菌菌株的另一实施方案中，所述碳源是甘油或甘油与选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖的至少一种其他碳源的混合物。如本文所述，不同的产率参数(“产率(yield) ”或YP/S ；“特定生产产率(specific productivity yield) ” ；或空间时间产率(Space-Time-Yield，STY))为本领域所熟知并如 Song和Lee，2006描述来测定。
“产率”和“YP/S”(各自以产生的产物量/消耗的材料的量表述)此处用作同义词。特定生产产率描述产物，像每小时每升发酵培养液每克干生物量产生的琥珀酸的量。表述为DCW的细胞干重的量描述生物化学反应中生物活性微生物的量。给定的数值为每小时每克DCW多少克产物(即g gDCff^h"1)。本发明的其他实施方案涉及用于发酵产生有机酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a)在含有可同化碳源的培养基中培养如一项前述定义中所定义的细菌菌株，并在存在二氧化碳下，在约10到60，或20到50，或30到45°C的温度，5. 0到9. 0，或5. 5到8. 0， 或6. 0到7. 0的pH中培养所述菌株；和b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物。可间断地或连续地进行所述方法，并且可通过常规手段，例如HPLC或GC分析监测酸产生的过程。优选地，优选在厌氧条件下通过所述方法产生琥珀酸(SA)。可通过常规技术，例如通过将反应培养基的成分脱气并通过以例如0. 1到1或0. 2到0. 5vvm的流速引入二氧化碳或氮气或其混合物以及任选地氢气维持厌氧条件来建立厌氧条件。可通过常规技术，例如通过以例如0. 1到1，或0. 2到0. 5vvm的流速引入空气或氧
气来建立需氧条件。适当时，可应用0. 1到1. 5bar的轻微超压。在所述方法中，所述可同化碳源优选选自甘油、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、 D-半乳糖、D-甘露糖及其混合物，或含有至少一种所述化合物的组合物，或选自淀粉、纤维素、半纤维素和/或木质素纤维素的分解产物。可优选将可同化碳源的初始浓度调整到5到100g/l范围内的值，并可在培养过程中维持在该范围内。通过添加合适的碱例如NH40H、NH4HC03、(NH4)2C03>NaOH,Na2CO3^NaHCO3>KOH,K2C03> KHCO3、Mg (OH) 2、MgCO3、Mg (HCO3) 2、Ca (OH)2, CaCO3、Ca (HCO3) 2、CaO、CH6N2O2、C2H7N 或其他碱及其混合物控制反应培养基的pH。所述碱的生理状态可以是水溶液、水悬浮液、气体或液体。用于产生SA的尤其优选条件是碳源葡萄糖、木糖或麦芽糖和/或甘油(包括粗甘油)温度30到 45 °CpH 6. 0 到 7. 0，通过如上述碱，优选通过 HC03_ 源如 Na2CO3^ NaHC03、Mg(HCO3)2^ Ca (HCO3) 2 或 Mg (OH) 2、MgCO3、Ca (OH)2, CaCO3 控制供给气体0)2在另一实施方案中，本发明提供用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株；b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；并且所述方法的特征还在于至少28g/L的甘油以至少1. 08/^、或> 1. 08/^、或>1. (^g/g、或〉1. lg/g、或〉1. Mg/g、或〉1. 20g/g、或〉1. 2^/g、或〉1. 24g/g ；高达约 1，28g/g的产率系数YP/S ；例如以至少0，6g/g、至少0. 7g/g、至少0. 75g/g、至少0. 8g/g、 至少 0. 85g/g、至少 0. 9g/g、至少 0. 95g/g、至少 1. Og/g、至少 1. 05g/g、至少 1. lg/g、至少
1.15g/g、至少1. 20g/g、至少1. 22g/g、至少1. 24g/g的产率系数YP/S转化成至少28. lg/L 琥珀酸。例如，28g/L的甘油可转化成高达约40或高达约35g/L的琥珀酸。在另一实施方案中，本发明提供用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株；b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；并且所述方法的特征还在于以至少0.6g gDCW^tT1琥珀酸或至少0.65或至少0.7g gDCW^tT1琥珀酸、或至少0. 75g gDCW^tT1琥珀酸、或至少0. 77g gDCW^tT1琥珀酸的特定生产产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的碳源转化成琥珀酸。在另一实施方案中，本发明提供用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株；b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；并且所述方法的特征还在于以对琥珀酸而言至少2. 2g/(L h)、或至少2. 5、至少
2.75、至少3、至少3. 25、至少3. 5或至少3. 7g/(L * h)琥珀酸的空间时间产率将选自蔗糖、 麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的碳源转化成琥珀酸。在另一实施方案中，本发明提供用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株；b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；并且所述方法的特征还在于以对琥珀酸而言至少2. 2g/(L h)、或至少2. 5、至少 2. 75、至少3、至少3. 25、至少3. 5或至少3. 7g/(L ^ h)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少^g/ L碳源转化成琥珀酸。在另一实施方案中，本发明提供用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株；b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；并且所述方法的特征还在于以至少0，6g gDCW^tT1琥珀酸或至少0.65或至少 0. 7g gDCW—1!!-1琥珀酸，或至少0. 77g gDCW—i—1琥珀酸的特定生产产率，和对琥珀酸而言至少2. 2g/(L h)、或至少2. 5、至少2. 75、至少3、至少3. 25、至少3. 5或至少3. 7g/(L h)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、 D-甘露糖和/或甘油的碳源转化成琥珀酸。在产生琥珀酸的上述确定的方法的另一实施方案中，所述碳源是甘油或甘油的混合物和选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖的至少一种其他碳源。其他优选条件将来自所附实施例和附图。可通过本领域已知的方法例如结晶、过滤、电透析、层析，以常规方式来分离所产生的琥珀酸和/或琥珀酸盐。例如，可通过使用用于中和及过滤沉淀的氢氧化钙、氧化钙、 碳酸钙或碳酸氢钙在发酵过程中的发酵罐中通过沉淀将它们分离为琥珀酸钙产物。通过用硫酸对琥珀酸进行酸化从沉淀的钙或琥珀酸盐中回收期望的琥珀酸产物， 随后通过过滤除去硫酸钙(石膏)或沉淀物。可通过离子交换层析对所得的溶液进行进一步的纯化，以去除不想要的残留离子。本发明的另一实施方案涉及用于产生琥珀酸和/或琥珀酸盐，尤其是铵盐的方法，所述方法包括发酵产生如上定义的琥珀酸并用合适的碱，尤其是无机碱，像铵，或其水溶液控制pH。本发明的另一实施方案涉及产生四氢呋喃(THF)和/或1，4_ 丁二醇(BDO)和/ 或Y-丁内酯(GBL)的方法，其包括a)发酵产生琥珀酸和/或琥珀酸盐，例如如上定义的铵盐，和bl)将所获的游离酸直接催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL，或b2)所获游离琥珀酸和/或琥珀酸铵盐化学酯化成其对应的二低级烷基酯，并随后将所述酯催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL。低级烷基优选代表直链或分支C1-C6-,优选C1-C4-烷基残基，尤其是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基以及正戊基和n-neXyl及其分支类似物。本发明的另一实施方案涉及用于产生吡咯烷酮的方法，其包括a)发酵产生如上定义的琥珀酸盐，和b)以本身已知的方式，例如在W0-A-2006/066839(其文件在此引入作为参考)中描述的方式将琥珀酸铵盐化学转化成吡咯烷酮。在优选的实施方案中，用作可同化碳源的所述甘油是粗甘油。SA直接氢化的更多细节用于进行直接催化氢化的合适的实验条件是众所周知的，并例如描述于US 4，550，185中，此处引用作为参考。使用本领域技术人员熟悉的方法、装置和助剂如溶剂以本身已知的方式将SA氢化。具体而言，在适合酸氢化的多相催化剂存在下进行连续或分批液相氢化。本领域技术人员在可接受的努力下可确定最佳方法参数。例如，反应温度在约100到约300°C的范围内，优选在约130到285°C范围内，并且压力从约20到350bar，例如从100到250bar。可用于氢化反应的催化剂为本领域技术人员所知。例如，可使用多种钯/铼/碳催化剂。可用于氢化反应的溶剂为本领域技术人员所知。例如，可使用水溶剂介质。氢化后SA酯化的更多细节
直接催化氢化后用于进行化学酯化的合适的实验条件是众所周知的，并例如描述于在此引入作为参考的欧洲专利申请06007118. 0中。a)酯化方法使用本身已知的装置以多种设计进行酯化方法，其可包括反应性蒸馏(reactive distillation)。例如，可使用以连续方式运转的酯化车间(esterification plant)，其包含具有通过安装支架或填垫材料完成适当数量的理论级的精馏柱。一旦在柱中因上样 (feeding-in)链烷醇形成稳定状态温度模式，就将包含SA铵盐的水装料从储存容器上样到柱的顶部，所述链烷醇在粘着到所述柱的贮槽(sump)的蒸发器环路(evaporator loop) 中蒸发。反应形成下降的含铵盐液体与冷凝物，和上升的含链烷醇的蒸气相的对流。为了催化酯化反应，可向铵盐初始装料中加入均相催化剂。或者，可在柱内部提供多相催化剂。 所形成的羧酸酯在反应条件下是液体，并经柱的底部流向蒸馏柱的贮槽，并从所述贮槽中连续流出。从反应柱中去除气态组分，例如包含链烷醇-水和/或铵的共沸混合物，并因此在所述柱的顶部从反应平衡中去除。可通过本领域技术人员在可接受的努力下完成对上述特定实施方案的进一步修改。根据所用装置的配置，例如所用柱内容物的类型、反应物的类型和量、适当时所用催化剂的类型和量，本领域技术人员可容易地确定用于本发明酯化方法的合适的方法参数范围。例如，并非限制性的，可在以下参数范围中设置各参数柱温度0-300°C，具体而言40_250°C，或 70_200°C压力0. 1到6bar，具体而言标准压力停留时间几秒(例如1到60秒)多至几天(例如1到5天)，具体而言几分钟 (例如1到60分钟)至几小时(例如1到15小时)，更优选几分钟(例如5到20分钟) 至2小时。b)氢化方法使用本领域技术人员熟悉的方法、装置和助剂，如催化剂以本身已知的方式将根据本发明制备的SA酯氢化。具体而言，在适合酯氢化的多相催化剂的存在下进行连续或分批气相氢化。本领域技术人员在可接受努力下可为特定酯确定最佳方法参数。例如，反应温度在约100到约300°C的范围内，优选在约200到280°C范围内，并且压力从约5到lOObar，例如从10到 50bar。反应物与氢气的摩尔比值设置在约1 100到约1 2000，例如1 800到1 1500 的范围内。可用于本发明氢化反应的催化剂为本领域技术人员所知。例如，可使用多种铜催化剂。例如，现有技术描述了还原亚铬酸铜催化剂的用途，所述催化剂可获自Davy Process Technology Ltd.，英国，名称为85/1。然而，尤其适合于本发明的催化剂是支持性氧化铜催化剂，所述氧化铜应用于氧化铝或硅支持材料。也在以下论文中描述了利用铜催化剂将琥珀酸酯氢化成BD0(1，4-丁二醇)/GBL(Y-丁内酯)/THF的实例 Schlander, Jan. ,2000 年 2 月，University of Karlsruhe, “ Gasphasenhydrierung von Maleinsauredimethylester zu 1，4-Butandiol， gamma-ButyrolactonundTetrahydrofuran an Kupfer-Katalysatoren“。发酵步骤的更多细节可在搅拌发酵罐、鼓泡塔和环式反应器中进行本发明所用的发酵。包括搅拌类型和几何设计的可能的方法类型的综述可见于〃 Chmiel =Bioprozesstechnik =Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1"。在所述方法中，可获得的典型变体是本领域技术人员己知或例如在"Chmiel，Hammes and Bailey biochemical Engineering"中解释的以下变体，如分批式发酵、分批补料式发酵、重复分批补料式发酵或具有或不具有循环生物量的连续发酵。根据生产菌株，可以/必须完成空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或适当气体混合物的喷射，以达到好的产率。在本发明方法的发酵液中进行化学转化之前，可对发酵液进行预处理；例如，可以去除发酵液的生物质(biomass)。去除生物质的方法为本领域技术人员所知，例如过滤、 沉淀和浮选。结果，例如可通过离心机、分离器、倾析器、过滤器或在浮选装置中去除生物质。为了最大回收有价值的产物，经常建议例如以透析过滤的形式洗涤生物质。方法的选择依赖于发酵罐培养液中的生物质含量和生物质的性质，还有生物质与有价值产物的相互作用。在一个实施方案中，可将发酵液灭菌或巴士消毒。在其他实施方案中，将发酵液浓缩。根据需要，可分批或连续进行该浓缩。应该选择压力和温度范围，使得首先没有产物损伤发生，其次最少使用装置和能量是必须的。灵巧的选择用于多级蒸发的压力和温度水平使得能够节约能量。对于装置，可以天然的或强制循环方式利用搅拌罐、降膜式蒸发器、薄膜蒸发器、 强闪循环蒸发器和其他蒸发器类型。结果，术语“发酵液”理解为表示基于发酵方法并且如本文所述未曾起作用或已经起作用的水溶液。将通过以下实施例来更详细地描述本发明。以下实施例用于说明性目的，而不旨在限制本发明的范围。实施例1:分离DDl为了分离使用四步方法，该方法包括为取样、浓缩培养、分离纯培养物和检测纯培养物的琥珀酸(SA)产生的步骤。1.实验方法1.1 取样从牛瘤胃、来自城市污水处理厂的消化污泥和酿酒残渣果渣中取样。通过相对高浓度的有机物和无氧富含(X)2的大气来对这些产地进行表征。以下给出关于所述样品、其起源及处理的更详尽信息。a)瘤胃内含物取自 hstitut fur Tierernahrung ，University ofHohenheim的插管的Holstein奶牛。原位pH值及温度分别为6. 7和37°C。 将材料经无菌滤布过滤，通(X)2并立即在冰上冷却以当天运输并处理。b)消化污泥取自Marmheim-Sandhofen的城市污水处理厂的消化塔中。原位pH值及温度分别为7. 1和36. 3°C。将样品置于冰上冷却并当天处理。污泥中气相的主要成份为甲烷和二氧化碳。c)果渣样品于2005年11月收集于德国西南部的田地。来自红葡萄(SpStburgunder )的果渣取自大stash的中部。该区域应为无氧状态。来自白葡萄 (Muller-Thurgau)的果渣取自其中已在进行乙醇发酵的贮存容器中。1.2富集培养在含D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖作为唯一碳源的不同培养基上进行富集培养。培养基组分如下所述表1 用于富集培养的培养基组分。
权利要求
1.细菌菌株，以及来自其的保留以下能力的变体和突变菌株，所述菌株为巴斯德氏菌科的成员，最初从瘤胃中分离，能够利用甘油作为碳源。
2.权利要求1的菌株，其具有从甘油产生琥珀酸的能力。
3.前述权利要求中任一项的菌株，其具有SEQID NO :1的16SrDNA，或显示至少96、97、 98、99或99. 9%序列同源性的序列。
4.前述权利要求中任一项的菌株，其具有SEQID N0:2的23S rDNA，或显示至少95、 96、97、98、99或99. 9%序列同源性的序列。
5.前述权利要求中任一项的菌株，其显示至少一个以下额外的代谢特征a)从蔗糖产生琥珀酸；b)从麦芽糖产生琥珀酸；c)从D-果糖产生琥珀酸；d)从D-半乳糖产生琥珀酸；e)从D-甘露糖产生琥珀酸；f)从D-葡萄糖产生琥珀酸；g)从D-木糖产生琥珀酸；h)从L-阿拉伯糖产生琥珀酸；i)不利用木糖醇、肌醇和山梨醇；j)在需氧和厌氧条件下均生长；k)在75g/L和更高的初始葡萄糖浓度下生长；1)在70g/L和更高的初始甘油浓度下生长；m)铵耐受。
6.前述权利要求中任一项的菌株，其以至少0.5g/g的产率系数YP/S将蔗糖、麦芽糖、 D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油转化成琥珀酸。
7.前述权利要求中任一项的菌株，其具有至少一个以下特征a)以至少1.Og/g的产率系数YP/S将至少^g/L的甘油转化成至少28. lg/L的琥珀酸；b)以至少0.6ggDCW^tT1琥珀酸的特定生产产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸；c)以对琥珀酸而言至少2.2g/(L h)琥珀酸的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸；d)以对琥珀酸而言至少2.2g/(Lh)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、 D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少28g/L的至少一种碳源转化成琥珀酸；e)以至少0.6ggDCW-、-1琥珀酸的特定生产产率和对琥珀酸而言至少2.2g/(L h)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、 D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸。
8.以保藏号DSM18541保藏于DSMZ的细菌菌株DDl，其具有产生琥珀酸的能力，并且来自其的变体或突变体至少保留所述产生琥珀酸的能力。
9.用于发酵产生有机酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括以下步骤a)在含有可同化碳源的培养基中培养如前述权利要求中的一项中定义的细菌菌株，并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株；b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物。
10.权利要求9的方法，其中在存在二氧化碳下，在约10到60°C的温度范围和5.0到 9.0的pH范围内进行发酵。
11.权利要求9或10的方法，其中所述有机酸是琥珀酸。
12.权利要求9到11中一项的方法，其中所述可同化碳源选自甘油、蔗糖、麦芽糖、 D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖；淀粉、纤维素、半纤维素和木质素纤维素的分解产物；及其混合物。
13.权利要求12的方法，其中所述碳源是甘油，或甘油与选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、 D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖的至少一种其他碳源的混合物。
14.权利要求9到13中一项的方法，其中将所述可同化碳源的浓度调整到5到80g/l 范围内的值。
15.用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株，并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株；b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；其额外的特征在于至少一种以下特征c)以至少1.Og/g的产率系数YP/S将至少^g/L的甘油转化成至少28. lg/L的琥珀酸；d)以至少0.6ggDCW^tT1琥珀酸的特定生产产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸；e)以对琥珀酸而言至少2.2g/(L h)琥珀酸的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸；f)以对琥珀酸而言至少2.2g/(Lh)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、 D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少28g/L的至少一种碳源转化成琥珀酸；g)以至少0.6ggDCW-、-1琥珀酸的特定生产产率和对琥珀酸而言至少2.2g/(L h)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、 D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸。
16.权利要求15的方法，其中所述细菌菌株是在权利要求1到8中任一项定义的菌株。
17.权利要求9到16中任一项的方法，其间断或连续进行。
18.用于产生琥珀酸和/或琥珀酸铵盐的方法，所述方法包括发酵产生权利要求9到 17中任一项的琥珀酸，并且用氨或其水溶液，或NH4HC03、(NH4)2CO3^ NaOH, Na2C03、NaHCO3> KOH、K2CO3> KHCO3 > Mg (OH)2, MgCO3> MgH (CO3) 2、Ca (OH)2, CaCO3> Ca (HCO3) 2、CaO、CH6N2O2, C2H7N 及其混合物控制所述PH。
19.用于产生四氢呋喃(THF)和/或1，4-丁二醇(BDO)和/或γ-丁内酯(GBL)的方法，其包括a)发酵产生如权利要求18中定义的琥珀酸和/或琥珀酸盐，和 bl)或者将所获的游离酸直接催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL，或 b2)将所获的游离琥珀酸和/或琥珀酸盐化学酯化成其对应的二低级烷基酯，并随后将所述酯催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL。
20.用于产生吡咯烷酮的方法，其包括a)发酵产生如权利要求18定义的琥珀酸铵盐，和b)以本身已知的方式将琥珀酸铵盐化学转化成吡咯烷酮。
21.权利要求13到20中任一项的方法，其中通过三酰基甘油酯的酯切割获得所述用作可同化碳源的甘油。
22.权利要求21的方法，其中甘油是从生物柴油制备中获得的废品。
23.权利要求1到8中任一项中定义的细菌菌株用于发酵产生有机精细化学品的用途。
24.权利要求22的用途，其中所述有机精细化学品是琥珀酸或其盐或衍生物。
全文摘要
本发明涉及最初从牛瘤胃中分离的，命名为DD1的新细菌菌株，其具有产生有机酸，尤其是琥珀酸(SA)的能力，并能够利用甘油作为碳源；还涉及来自所述菌株的保留该能力的变体菌株；以及涉及通过使用所述微生物产生有机酸，尤其是琥珀酸的方法。
文档编号C12N1/20GK102317432SQ200880112009
公开日2012年1月11日 申请日期2008年8月14日 优先权日2007年8月17日
发明者D·德格勒, E·朔尔腾, H·施罗德, S·黑夫纳 申请人:巴斯夫欧洲公司