专利名称：一种副猪嗜血杆菌lz-20100109株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌疫苗领域，特别涉及ー种副猪嗜血杆菌LZ-20100109株，还涉及所述副猪嗜血杆菌LZ-20100109株的应用。
背景技术：
副猪嗜血杆菌parasuis, HPS)是一种 NAD (Nicotinamide adeninedinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即辅酶I )依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科(Pastteurellacea)嗜血杆菌属(Haemophilus)。HPS常引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎，由该菌引起的病又称为猪革拉斯氏病。该菌是在1922年由Schermer和Ehrlich首次分离出来的，但是直到1992才通过SPF (Specific Pathogen
Free，无特定病原体)猪证实HPS的致病性以及不同血清型菌株之间的毒力差异。据调查，HPS可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5周龄 8周龄的猪，发病率可达40%，严重时死亡率可达50%。HPS还可感染生产母猪，引起流产、产死胎或弱仔等。随着养猪业的不断发展，猪场规模化、集约化程度的不断提高，猪群饲养密度越来越大，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育猪发病和死亡的一个重要原因。另外，ー些免疫抑制性疾病如猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等经常与HPS混合感染或继发感染，对全球的养猪业造成巨大的经济损失，也给副猪嗜血杆菌病的诊断和综合防治带来更多的难度。近年来，副猪嗜血杆菌病已在我国普遍流行，在我国的主要养猪区域如广东、河南、湖北、湖南、山东、江西、河北、上海、吉林、四川、浙江、甘肃、江苏等省份都有副猪嗜血杆菌病发生以及HPS分离鉴定的报道。而HPS的真实发病率可能为实际确诊的10倍之多，给我国的养猪业带来了极大的威胁，已经引起了政府和社会上的高度重视。由于HPS耐药性现象越来越常见，常用的抗生素对副猪嗜血杆菌病已无明显的疗效，而且随着人们对绿色食品需求的期望越来越高，抗生素在本病预防和控制等方面的应用必将受到严格限制和逐步禁止，疫苗免疫成为预防和控制副猪嗜血杆菌病的主要措施。由于HPS血清型较多，且不同血清型的菌株，其毒力与致病力差异较大，各个血清型之间免疫交叉保护カ很低，不同地方分离的菌株具有较强的地方性特征，致使现有国内外的副猪嗜血杆菌商品化疫苗不能对该病提供完全有效的免疫保护。因此发掘更多的交叉保护性好且免疫原性强的HPS并利用其研制高效的副猪嗜血杆菌疫苗是该病防控的迫切需要。Bak> Riising于2002年在《Veterinary record))上报道了一种血清5型副猪嗜血杆菌灭活疫苗，并评估了免疫猪群对同源和异源副猪嗜血杆菌0 parasuis)进行实验感染后其保护性免疫的形成。5 7周龄的猪群免疫2周后，同源攻毒(血清5型非疫苗株)的保护率可达到80% (4/5);血清I型副猪嗜血杆菌攻毒的保护率可达40% (2/5);血清12型副猪嗜血杆菌攻毒的保护率可达100% (5/5);血清13型副猪嗜血杆菌攻毒的保护率可达75% (3/4);血清14型副猪嗜血杆菌攻毒的保护率可达100% (5/5)。可见，该血清5型副猪嗜血杆菌灭活疫苗不仅可保护同源攻毒，还可为异源攻毒(血清1、12、13和14)提供部分保护。
发明内容
为了解决以上现有国内外的副猪嗜血杆菌商品化疫苗各个血清型之间免疫交叉保护力低、免疫原性不强的问题，本发明提供了ー种免疫原性强的副猪嗜血杆菌LZ-20100109株。本发明还提供了所述副猪嗜血杆菌LZ-20100109株在制备各个血清型之间免疫交叉保护カ强的灭活疫苗中的应用。本发明是通过以下措施实现的
ー种副猪嗜血杆菌LZ-2010010 9株,其保藏编号为CGMCC No. 5802。所述的副猪嗜血杆菌LZ-20100109株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。优选所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗为油乳剂疫苗或铝胶疫苗。优选所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗为铝胶疫苗。所述铝胶疫苗中含菌量彡2. 5 X IO9 CFU/mL。本发明的有益效果副猪嗜血杆菌LZ-20100109株对猪有较强的致病性，且具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活铝胶疫苗安全可靠，不仅能提供同源攻毒保护，还可为血清I型、2型、4型、12型、14型和15型HPS等异源攻毒提供一定的交叉保护，免疫后能够产生较强免疫力，接种猪群的发病率和死亡率均明显减少，其免疫效果达到或优于市场上现有的商品化疫苗，具备了与国内外同类产品竞争的优势，能够有效预防副猪嗜血杆菌病的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。菌株保藏信息
保藏时间2012年2月24日，
保藏单位中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，
保藏编号CGMCC No. 5802，
保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，
分类命名副猪嗜血杆菌paT3suis_')。
附图I为攻毒试验中腹腔注射不同剂量LZ-20100109株菌液后仔猪体温变化状况。
具体实施例方式为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进ー步说明。实施例I :
副猪嗜血杆菌{Haemophilus parasuis) LZ-20100109株,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 5802。生产用培养基
TSA培养基配制称取4 g TSA (Tryptic Soy Agar，胰蛋白胨大豆琼脂)粉末加入100mL蒸馏水中，充分混匀后，121°C灭菌15 min，冷却至50 60°C时，加入终浓度O. 001% NAD(Nicotinamide adenine dinucleotide,烟酸胺腺嘌呤二核苷酸即辅酶I )和5%新生牛血清，混合均匀后倾倒平板备用。
TSB培养基配制称取3 g TSB粉末加入100 mL蒸馏水中，121°C灭菌15 min。临用前加入终浓度O. 001% NAD和5%新生牛血清，混合均匀后配制而成。I. I HPS菌株的分离纯化方法
从山东省临淄地区疑似副猪嗜血杆菌病的某大型养猪场选取病猪，无菌采集病猪的心包积液、胸腔积液、关节液和心血划线接种于含O. 001% NAD和5%新生牛血清的TSA培养基上，置于37°C培养箱培养36 h 72 h，挑取圆形、光滑湿润、无色透明的露珠状小菌落革兰氏染色镜检，选取革兰氏阴性细小杆菌进行划线纯培养。将纯培养菌株分别划线接种于鲜血琼脂平板和普通琼脂平板，同时水平划线接种鲜血琼脂平板后，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37°C培养24 h 48 h，选取在鲜血琼脂平板和普通琼脂平板上不生长，但与金黄色葡萄球菌在鲜血琼脂平板上共同培养时呈现明显的“卫星生长现象”且不溶血的微小菌落进行纯化培养。 将进ー步纯化培养的两株菌株，分别接种于含NAD的微量生化反应管，37°C培养48 h，结果均为硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验阴性，脲酶试验阴性，氧化酶试验阴性，接触酶试验阳性，发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、果糖和木糖，不发酵蔗糖和甘露醇。该菌株根据其病猪的来源地和分离时间命名为LZ-20100109株。I. 2 16S rRNA基因序列测定与分析
1.2.1引物设计根据HPS 16S rRNA (GenBank No: M75065)序列设计引物，上游引物5’ -GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’，下游引物5’ -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’，该引物扩增编码16S rRNA长度约为822 bp的特异片段，引物由上海生物工程有限公司合成。I. 2. 2细菌DNA模板的制备将被检菌株菌液5000 r/min离心5 min,弃上清液，用无菌水重悬后，于沸水中煮沸10 min, _20°C冻结、融化后，10000 r/min离心5 min,取上清液作模板进行PCR扩增。I. 2. 3 PCR 扩增将细菌 DNA 模板 3 μ , 10 倍 PCR 缓冲液 2. 5 PL、dNTP( 10 mmol/L)0. 5 μ 、引物各 I PL (10 Mmol/L)和 TaqDNA 聚合酶 O. 25 μ (5 U/μ )混合，加水至25 PL，94°C预变性5 min，94°C变性30 s、58°C退火30 s、72°C延伸I min，循环34次，最后72°C延伸10 min, PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，可观察到822 bp大小的特异DNA条带。用DNA快速回收试剂盒回收PCR产物，_20°C保存备用。I. 2. 4 16S rRNA扩增产物的克隆与测序将回收的PCR产物与pMD19_T在16°C连接30 min，转化DH5a感受态细菌，37°C过夜培养12 h 16 h。挑取平板上的单菌落于氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中37°C过夜振荡培养，次日应用菌液PCR的方法扩增16SrRNA基因筛选阳性克隆，鉴定为阳性的菌液提取质粒交由上海生エ公司测序。LZ-20100109株16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表中序列I所示，将序列在GenBank中进行BLAST比对，与已发布的副猪嗜血杆菌相应序列的同源性达到99%以上。I. 3 HPS LZ-20100109 株的血清学鉴定
将LZ-20100109株分别密集划线接种于TSA培养基，37°C培养24 h后，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗下菌落，将悬液稀释至含菌量为3. OXlO9 CFU/mL，121 °C高压2 h，菌液7000 r/min离心10 min，取上清用于琼脂扩散试验的分型抗原。用生理盐水配制1%的琼脂糖凝胶，根据需要在相应的琼脂糖凝胶孔中加抗原和相应的抗血清，以刚加满孔为宜，湿盒内37°C下放置24 h 48 h，可见LZ-20100109株于5型血清孔与抗原孔之间出现清晰的白色沉淀线，故判定副猪嗜血杆菌LZ-20100109株为血清5型。I. 4动物攻毒试验
1.4.1攻毒菌液的制备挑取HPS LZ-20100109株单菌落密集划线接种于TSA培养基，37°C培养12 h 16 h后，用PBS收获细菌。将菌液涂布于TSA培养基，37°C培养24 h后，用PBS收获细菌，并将菌液的活菌数调整为3. OXlO9 CFU/mL。I. 4. 2动物攻毒试验结果取3周龄 4周龄健康易感仔猪40头，随机分成4组，每组10头，其中3组分别以I mL、l. 5 mL和2mL三个不同剂量进行腹腔注射LZ-20100109株菌液(3. O X IO9 CFU/mL),另外I组注射灭菌生理盐水2 mL作为对照。攻毒组大部分仔猪的体温在攻毒第二天或第三天开始升高，持续三四天后，体温逐渐恢复正常，如图I所示；其还出现被毛粗乱、精神沉郁、食欲減退、呼吸困难、关节肿大、跛行、甚至死亡等临床症状；剖检可观察到其胸腹腔积液增多、胸腹腔内粘连甚至出现纤维素性滲出物、心包积液增多甚至心包膜增厚有纤维素渗出物、全身淋巴结肿大、或后肢关节腔内关节液增多甚至有胶 冻样渗出物。LZ-20100109株的攻毒剂量越大，试验猪的最高体温越高，死亡越快，其发病率和死亡率越大。攻毒组仔猪的发病率和死亡率如表I所示。对照组仔猪的体温无明显变化，亦无发病和死亡。由于用I. 5 mL菌液(3. OX IO9 CFU/mL)攻毒可使仔猪发病率达到90%，所以后面的LZ-20100109株攻毒试验选用1.5 mL剂量。表I LZ-20100109株不同攻毒剂量仔猪的发病率和死亡率
攻毒剂量_「发病数发病率死亡数死亡率
ImL 菌液5/10 50% 1/10 10%
I. 5mL 菌液 9/10 90% 7/10 70%
2mL 菌液10/10 100% 10/10 100%
2mL 生理盐水
θ [
I.5免疫原性的測定
I.5. I取3周龄 4周龄健康易感仔猪40头，随机分成4组，每组10头。LZ-20100109株菌种扩增培养物分别制成含菌量为2 X 109CFU/mL、2. 5 X 109CFU/mL和3 X IO9 CFU/mL的灭活铝胶疫苗(疫苗的配制和成品检验方法參照实施例2)。其中3组仔猪分别颈部肌肉注射上述三种疫苗，2 mL/头，2周后按相同剂量进行ニ免，另外I组仔猪作为未免疫对照组。ニ免后2周采血通过玻片凝聚法检测仔猪的血清抗体效价，采血后4组仔猪均腹腔注射LZ-20100109株菌液(3. OX IO9 CFU/mL)I. 5 mL/头。未免疫对照组仔猪的抗体为阴性，攻毒后有9头仔猪发病，其中5头死亡。而免疫组中，除最低剂量组(含菌量为2X IO9 CFU/mL)免疫效果较差外，其余两组(含菌量为2. 5 X 109CFU/mL和3 X IO9 CFU/mL)均产生较好的免疫效果，仔猪抗体效价均在1:32以上，攻毒后仔猪均健活，剖检无明显病理变化，详细结果如表2所示。表2不同含菌量的灭活疫苗对仔猪的免疫效果
权利要求
1.ー种副猪嗜血杆菌LZ-20100109株，其特征在于其保藏编号为CGMCC No. 5802。
2 权利要求I所述的副猪嗜血杆菌LZ-20100109株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗为油乳剂疫苗或招胶疫苗。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗为铝胶疫苗。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述铝胶疫苗中含菌量S2.5X109CFU/mLo·
全文摘要
本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌疫苗领域，特别涉及一种副猪嗜血杆菌LZ-20100109株，其保藏编号为CGMCCNo.5802。所述的副猪嗜血杆菌LZ-20100109株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。副猪嗜血杆菌LZ-20100109株对猪有较强的致病性，且具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活铝胶疫苗安全可靠，不仅能提供同源攻毒保护，还可为血清1型、2型、4型、12型、14型和15型HPS等异源攻毒提供一定的交叉保护，接种猪群的发病率和死亡率均明显减少，能够有效预防副猪嗜血杆菌病的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。
文档编号A61K39/102GK102851249SQ20121034787
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年4月1日
发明者吴家强, 张玉玉, 李俊, 于江, 杜以军, 丛晓燕, 王大鹏, 王金宝 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所