鉴定调变钙活化型氯通道活性的药剂的方法

专利名称：：鉴定调变钙活化型氯通道活性的药剂的方法
技术领域：
：本发明涉及鉴定调变钙活化型氯通道(calcium-activatedchloridechannel)活性的药剂的方法，所述钙活化型氯通道称为Anoctamin1(ANOl)。
背景技术：
：转运上皮是覆盖于腺体、导管、血管、肠道和气道的薄层上皮层，其允许分泌并吸收大量的水和电解质，这对于保持水和电解质的内稳态和湿化上皮是必需的。此外，媒介物电解质转运提供了跨上皮电解质转运通过的方式。这种形式的转运涉及受到在上皮细胞的基底侧膜或顶膜中被差异表达的多种离子转运蛋白、泵和通道控制下的离子单向运动(Hille,B.,IonChannelsofExcitableMembranes(ed.Hille,B.)269-306(SinauerAssociatesInc，Sunderland，2001))。此外，由于媒介物转运在分泌和吸收上皮中具有生理学重要意义，上皮层的通道病通常导致致死性疾病，例如囊性纤维化(CF)或胰腺功能缺陷(Eggermont,J.，ProcAmThoracSoc.1，22—7(2004)；Nilius,B.&Droogmans,G.，ActaPhysiolScandl77，119-47(2003)；和Rosenfeld，Μ.Α.&Collins,F.S.，Chest109，241-52(1996))。氯通道在许多生理学功能中发挥重要的作用，这些通道中有一组是由细胞内Ca2+活化的，且因此统称Ca2+-活化型氯通道(CaCC)。CaCC控制Cl_的顶外流，其对于通过肾脏、呼吸道、肠道、胰腺、唾液腺和泪腺中的分泌型上皮的电解质和水的媒介物转运至关重要(Eggermont,J.,ProcAmThoracSoc.1,22-7(2004)；Nilius,B.&Droogmans,G.,ActaPhysiolScand177，119-47(2003)；Hartzell，C.etal.,J.,AnnuRevPhysiol67，719-58(2005)；和Kidd，J.F.&Thorn，P.，AnnuRevPhysiol62，493-513(2000))。此外，还知道CACC可通过控制血管平滑肌的弹性(LARGE，W.A.&WANG,Q.，AmJPhysiol271，C435-54(1996))并通过调节心肌细胞兴奋性(Zygmunt，A.C.，Calcium-activatedChlorideChannels(ed.Fuller,C.Μ.)81—98(AcademicPress,Amsterdam,2002))而有助于心血管功能。此外，通过改变膜电位，CACC也调节神经元细胞的兴奋性，后者负责光传导、嗅觉、味觉和本体感觉(Frings,S.etal.，ProgNeurobiol60，247-89(2000))。已知CaCC介导众多生理学功能。当被组胺、缓激肽或ATP刺激后，CaCC促进Cl—转运通过气道上皮的顶膜，而在外分泌腺(例如，唾液腺或胰腺)中，CaCC激动剂在腺泡细胞或导管细胞的顶极诱导液体或电解质分泌，在该处，在CaCC控制下的Cl—跨上皮移动驱动液体移动(Hartzell,C.etal.，J.，AnnuRevPhysiol67，719-58(2005)；Kidd,J.F.&Thorn，P.，AnnuRevPhysiol62，493—513(2000)；禾口Melvin，J.Ε.etal.，AnnuRevPhysiol67，445-69(2005))。在肾小管，小管重吸收或Cl—分泌均需要CaCC活性(Kose，H.etal.，BrJPharmacol131，1689—99(2000)；禾口Boese，S.H.etal.，JPhysiol523，325-38(2000))。在血管平滑肌中，内皮缩血管肽、去甲肾上腺素、血管紧张素II和ATP引起Ca2+-活化的Cl—传导，并由此引起强有力的去极化作用，导致收缩(LARGE，W.A.&WANG,Q.，AmJPhysiol271，C435-54.(1996))。在嗅觉受体神经元，CaCC放大气味活化的电、流(Lowe,G.&Gold，G.H.，Nature366,283-6(1993)；和Reisert，J.etal.，JGenPhysiol122，349-63(2003))，而在哺乳动物视网膜，CaCC很可能参与侧抑制的调节，后者是视觉信号处理的一部分(Barnes,S.&Deschenes,Μ.C.，JNeurophysiol.68,745-55(1992)；和Maricq，A.V.&Korenbrot，J.I.，Neuronl，503-15(1988))。此外，在神经元细胞，例如DRG神经元，CaCC负责后去极化作用(Frings，S.，Reuter,D.&Kleene,S.J.，ProgNeurobiol60，247-89(2000))。以上CaCC介导的细胞应答经由激素、旁分泌或神经递质的G蛋白偶联受体(GPCR)的刺激而起始。以ATP、碳酰胆碱、内皮缩血管肽-1、溶血磷脂酸(LPA)、组胺和多种其他配体处理引起Cl-流(Kajioka，S.etal.,AmJPhysiolRenalPhysiol286，F77-85(2004)；Nilius,B.etal.，JPhysiol.498,381-96(1997)；禾口Zholos,A.etal.，JGenPhysiol125，197-211(2005))。也可通过增加细胞内Ca2+的措施活化Ca2+-活化的Cl—流，例如通过将Ca2+透析至记录吸液管内、注射肌醇1，4，5，-三磷酸酯(IP3)或直接将Ca2+施加至分离的膜片(Kuruma,A.&Hartzell，H.C.，JGenPhysiol115，59-80(2000)；和Piper,Α.S.&Large，W.A.，JPhysiol547，181-96(2003))。此外，即便它们存在于不同类型的组织中，不同细胞内的内源性CaCC均保留了特征性的生物物理学和药理学特性，即Ca2+-活化的Cl_流具有外向整流性(outwardly-rectifying)，对Cl_通道阻断剂敏感，且它们的离子通透性的次序为Γ>Br">Cr(Eggermont,J.，ProcAmThoracSoc.1,22-7(2004)；Nilius,B.&Droogmans,G.,ActaPhysiolScandl77,119-47(2003)；Hartzell,C.etal.,J.，AnnuRevPhysiol67，719-58(2005)；KIDD,J.F.&TH0RN,P.，AnnuRevPhysiol62，493-513(2000)；和FRINGS，S.ETAL.,ProgNeurobiol60，247-89(2000))。同时，囊性纤维化(CF)是一种危及生命的疾病，其中气道和其他分泌性上皮的Cr分泌大为下降(Rosenfeld,M.A.&Collins,F.S.,Chest109,241-52(1996))通过采用位置克隆技术研究造成这些组织中的Cl—分泌功能异常的基因而克隆了囊性纤维化跨膜调节物(CFTR)(Rosenfeld,M.A.&Collins,F.S.，Chest109,241-52(1996)；禾口Schwiebert,Ε.M.etal.,PhysiolRev79，S145-66(1999))。CFTR是由细胞内c_AMP活化的Cr通道，已知其是分泌上皮内的主要Cl_分泌通道。不过，令人瞩目的证据提示CaCC也参与这些组织中的CF分泌。例如，在CFTR缺陷小鼠中报道了CaCC活性(Clarke,L.L.etal.，ProcNatlAcadSciUSA91,479-83(1994)；和Clarke,L.L.etal.，Science257，1125-8(1992))，所述小鼠不表现出液体分泌减少或明显的CF症状(Grubb，B.R.etal.，AmJPhysiol266，C1478-83(1994))。因此，在小鼠中，CaCC看起来可补偿CFTR的功能缺失。与此不同的是，在人的CF中这种功能性补偿不明显，原因在于CFTR功能异常独自即足以诱导CF样病理学。不过，有证据表明活化潜在的CaCC能够补偿人的CFTR功能缺失。例如，Ca2+离子载体在CF患者中有效诱导了Ca2+-依赖型CF分泌(Boucher,R.C.etal.，JClinInvest84,1424-31(1989)；和Anderson，Μ·P.&Welsh，Μ·J.，ProcNatlAcadSciUSA88,6003-7(1991))。此外，发现以嘌呤能受体拮抗剂UTP处理人类气道上皮细胞在CF上皮中引起了Cl-传导(Knowles,Μ.R.etal.,NEnglJMed325,533-8(1991)；禾口Willumsen,N.J.&Boucher,R.C.，AmJPhysiol256,C226-33(1989))。此夕卜，在CFTR与CaCC之间似乎存在一种组成型的反相关，即CFTR过表达下调CaCC，而CFTR功能异常上调CaCC(Kunzelmann，K.etal.,PflugersArch435，178-81(1997)；和Wei，L.etal.，PflugersArch442，280-5(2001))。Ca2+离子载体或拮抗剂诱导的Ca2+-活化的Cl—流在CF气道中被放大(Clarke，L.L.etal.,ProcNatlAcadSciUSA91,479-83(1994)；Grubb,B.R.etal.，AmJPhysiol266，C1478—83(1994)；禾口Thomas，Ε.J.etal.，AmJPhysiolCellPhysiol279，C1578-86(2000))。这些结果不可忽视地提示CaCC活化可补偿CF中的CFTR功能缺失。鉴于其病理生理学重要性，一直在积极争取克隆CaCC，但尚未确定产生Ca2+-活化的Cr流的分子的身份(Eggermont,J.，ProcAmThoracSoc.1,22-7(2004)；Nilius,B.&Droogmans,G.，ActaPhysiolScand177，119—47(2003)；禾口Hartzell，C.etal.，J.，AnnuRevPhysiol67，719-58(2005))，而这限制了对CaCC相关性生理学功能和病理状态的理解。因此，为了更多地了解CaCC的病理生理学作用，需要克隆由细胞内Ca2+活化的Cl—通道。此外，本领域特别需要鉴定能够调变钙依赖型氯分泌的药剂，以便开发用于治疗由Ca2+-活化型氯通道功能异常所导致的疾病的药物。
发明内容因此，本发明的主要目标在于提供鉴定调变钙活化型氯通道活性的药剂的方法，所述钙活化型氯通道称为Anoctamin1(AN01)。根据本发明的一个方面，提供了鉴定调变蛋白质活性的药剂的方法，其中所述蛋白质由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成或与SEQIDNO:1具有至少90%的氨基酸序列相同性并转运氯离子通过细胞膜，所述方法包括(a)将表达所述蛋白质的细胞暴露于所述药齐U;和(b)测量所述暴露细胞内氯离子转运的程度，其中与表达所述蛋白质但不暴露于所述药剂的对照细胞相比，氯离子转运程度的改变表明药剂能够调变所述蛋白质的活性。根据本发明的另一个方面，提供了鉴定抑制蛋白质活性的药剂的方法，其中所述蛋白质由SEQIDNO1的氨基酸序列表示或与SEQIDNO1具有至少90%的氨基酸序列相同性并转运氯离子通过细胞膜，所述方法包括(a)将表达所述蛋白质和G蛋白偶联受体(GPCR)的细胞暴露于所述药剂；(b)给所得细胞施加GPCR配体；和(c)测量所述暴露细胞内氯离子转运的程度，其中与表达所述蛋白质和GPCR但不暴露于所述药剂的对照细胞相比，氯离子转运程度的降低表明药剂能够抑制所述蛋白质的活性。附图简述通过下文中对本发明的描述并结合以下附图，本发明的上述以及其他目的和特征将更加清楚，所述附图分别显示图1小鼠(SEQIDNO:1)、人(SEQIDNO3)和大鼠(SEQIDNO5)Anoctamin1(AN01)序列的多重比对。相同的氨基酸以黑体示出。TM:跨膜结构域。图2=ANOl的推定的拓扑学及其亚单位组成。A.显示人的Anoctamin家族的系统发生树(TreeView，http//taxonomy,zoology,gla.ac.uk/rod/treeview.html)。单位每位点0.1个核苷酸取代。B.小鼠ANOl(mANOl)的推定的拓扑学。C.采用抗mANOl抗体的mANOl和mANOl-GFP融合蛋白的免疫印迹。D.ANOl在各种器官内的分布。Ε.ΑΝΟΙ主要定位于浆膜中。图3由mANOl应答于G蛋白偶联受体(GPCR)刺激(其是CaCC的生理学刺激)而引起的强内向电流。由GPCR刺激激活的mANOl流引发外向整流，这是CaCC的另一标志。A.当将mANOl与ETAR、AT1R、MIR、HlR或P2Y2R共转染至HEK293T细胞内时，内皮缩血管肽-1(50nM)、血管紧张素II(1μΜ,AngioII)、碳酰胆碱(1μΜ)、组胺(100μΜ)或ATP(100μΜ)激活了大量内向电流。Eh。ld=-60mV。点划线代表零点电流。B.受体刺激活化电流小结(实验编号=518)。对照细胞、ANOl转染的细胞和GPCR转染的细胞的一些电流应答太小以致观察不到。**p<0.001，与对照细胞或GPCR转染的细胞相比(ANOVA,Duncan，sposthoc检验)。C.将范围为-100至+IOOmV的电压阶梯以20mV的增量施加于以mANOl和ETaRR染的HEK细胞所引起的电流应答。在50nM内皮缩血管肽-1(上方的图)引起的峰值电流处记录应答于电压阶梯的电流。应答于电压阶梯的电流的电流-电压关系。注意到电流-电压关系显示为外向整流，这是内源性CaCC的标志。图4在爪蟾卵母细胞中由ANOl产生的Ca2+-活化的Cl_流。爪蟾卵母细胞是研究内源性CaCC的公认模型，这是因为它们表达内源性CaCC，后者与哺乳动物CaCC具有类似的生物物理学和药理学特性。因此，我们在爪蟾卵母细胞中表达了mANOl并使用溶血磷脂酸(LPA)刺激受体而测试其活化。A.施力卩ΙμΜLPA在注入了mANOl互补RNA的爪蟾卵母细胞中引起大内向电流，与此不同的是，在注入了水的卵母细胞(对照)中LPA引起的小而强的电流。控制电位-60mV。电解溶液ND-96。B.注入mANOl或水的卵母细胞中LPA-引起的电流的小结。**p<0.001。C.LPA-诱导的电流的电流-电压关系。在施加LPA之前(虚线)和之后(黑线)，将-100至+IOOmV的电压斜坡施加于表达mANOl的爪蟾卵母细胞。D.注入光滑爪蟾(Xenopuslaevis)ANOl(xANOl)的siRNA降低了应答于1μMLPA的内源性Ca2+-活化的Cl—流。注入水(对照)、siRNA或乱序siRNA后5天，给卵母细胞施加LPAE.siRNA和乱序siRNA对LPA-引起的电流的影响的小结。记录电流后，通过RT-PCR确定每组卵母细胞的xANOl转录本的水平。确定爪蟾3-磷酸甘油醛脱氢酶(xGAPDH)转录本的水平作为对照。**p<0.001，与对照相比(AN0VA，Duncan’sposthoc检验)。括号内的数字是实验的数目(误差棒=平均值士S.E.M)。图5:AN01是Cl_通道。为了证实mANOl是Cl_通道，我们在HEK细胞中表达了mANOl，并记录其由内皮缩血管肽-1引起的电流并进行了各种生物物理学测试。A.内皮缩血管肽-1在不同时间点在mAN01_ETAR/HEK细胞中引起的电流的典型电流_电压关系。电压斜坡_80+80mV，持续时间320ms，0.83Hz。B.内皮缩血管肽-1在mAN01_ETAR/HEK细胞中引起的电流的阴离子选择性。吸液管溶液含有140mMNMDG-Cl。电解溶液含有HOmMNMDG-Cl或葡糖酸钠。C.阴离子通透性。电解溶液含有140mMNaCl、NaBr、NaI、NaNO3或NaF。图6=CaCC的特异性药理学阻断剂以及Cl_通道阻断剂阻断了mANOl电流。A.(左侧)以Cl-通道阻断剂、4，4，-二异硫氰酸基-均二苯代乙烯-2，2，-二磺酸(DIDS，300yM)、尼氟灭酸(NFA,200μΜ)或5-硝基-2-(3-苯基-丙胺基)-苯甲酸盐(ΝΡΡΒ,200μΜ)预处理在注入mANOlRNA的爪蟾卵母细胞中抑制了LPA-引起的电流。(右侧)Cl—通道阻断剂对卵母细胞中LPA-诱导的电流的影响的小结。数字代表实验的数目。**p<0.001，与对照卵母细胞内的电流相比(Student，sT-检验)。B.CF通道阻断剂以及天然CaCC的经典抑制剂(每组η=5)在mAN01_ETAR/HEK细胞中抑制了内皮缩血管肽-1引起的电流。在第二次施用内皮缩血管肽-1之前5分钟施加各种化合物，浓度ομM(仅甲氟喹为5μΜ)。对照(η=12)。<0.001，与对照相比(ANOVA,Duncan，sposthoc检验)(误差棒=平均值士S.Ε.M)。图7细胞内Ca2+以电压依赖方式活化ANOl。A.在-60或+60mV的控制电位下反复向分离自mAN01_ETAR/HEK细胞的外翻膜片槽液中施加不同浓度的Ca2+引起的可见电流应答。吸液管和电解溶液含有140mMNMDG-C1。B.Ca2+SKmANOl的剂量应答关系。根据10μM(_60mV，n=8)或3μMCa2+(+60mV,η=8)处观察到的电流应答对电流应答进行标准化。将数据点拟合到Hill方程中(误差棒=平均值士S.Ε.Μ)。C.在外翻膜片中由Ca2+(0.5μΜ)活化的单通道电流。信号在2kHz处滤波。D.Ca2+在+60mV处活化的单通道电流的振幅直方图。E.Ca2+活化的单通道Cl_流的电流-电压关系(n=37)。误差棒(平均值士S.Ε.Μ)太小，无法以符号显示。图8=ANOl在转运上皮和其他组织中的表达。选择mANOl的第451至466残基来产生用于免疫组化分析的ANOl多克隆抗体。a肺，b胰腺，c肾，d视网膜，e背根神经节，f下颂下腺，g皮肤，h心室。放大倍数=x400o图9mANOlsiRNA对mANOl的下调降低了毛果芸香碱诱导的唾液排出。A.mANOl(箭头)在经对照、mANOlsiRNA处理和乱序siRNA处理的动物的下颂下腺内的表达B.mANOlsiRNA处理对唾液产生的影响。每5分钟测量对照(η=10)、siRNA处理的(η=8)和乱序siRNA处理的(η=10)小鼠的唾液排出。通过腹腔内注射(箭头)毛果芸香碱(lmg/kg)来诱导充足的唾液产生。**p<0.01，与对照相比(AN0VA，Duncan’sposthoc检验)(误差棒=平均值士S.Ε.M)。C.分离自小鼠下颂下腺的细胞内由乙酰胆碱(Ach，0.5yM)诱导的电流的代表性示踪，其中给小鼠注射mANOlsiRNA或乱序RNA，4天后取分离自小鼠下颂下腺的细胞进行培养。(下方)下颂下腺腺泡细胞内电流应答的小结。*P<0.05，与对照相比(AN0VA，Duncan，sposthoc检验)。(误差棒=平均值士S.Ε.M)图10磷脂酶C抑制剂(U-73122)和Ca2+-耗竭剂(毒胡萝卜内酯)对ANOl电流的阻断，以及通过给表达mANOl的爪蟾卵母细胞注入肌醇1，4，5_三磷酸酯(IP3)而使之活化。A.施加LPA之前以1μM毒胡萝卜内酯或10μMU-73122预处理阻断了LPA-诱导的电流应答。B.毒胡萝卜内酯或U-73122预处理对LPA-诱导的ANOl电流的影响的小结。括号内的数字为实验数目。<0.001，与未处理的注入mANOl的卵母细胞相比。C.给表达mANOl的卵母细胞注入50nl2mMIP3引起大内向电流(左侧)，而给注入水的卵母细胞中注入IP3诱导小内向电流(右上)。以ιμM毒胡萝卜内酯预处理阻断了表达mANOl的卵母细胞内由IP3诱导的电流。D.注入IP3对注入了水(对照)或mANOl的卵母细胞和以毒胡萝卜内酯预处理的表达mANOl的卵母细胞的影响的小结。**p<0.001，与未处理的注入mANOl的卵母细胞相比。E.Ca2+离子载体，即离子霉素，活化mANOl。给对照以及表达mANOl的卵母细胞注入离子霉素(4μΜ)。(误差棒=平均值士S.Ε.Μ)图11:GPCR刺激也活化人ANOl(hANOl)。hANOl克隆自人的气管并与ETaR—起在HEK细胞中表达于。A.给hAN01/ETAR-HEK细胞施用内皮缩血管肽-1(50ηΜ)引起大Cl—流。(右侧)内皮缩血管肽-1弓丨起的hANOl电流的小结。吸液管和电解溶液含有140mMNMDG-C1。B.hANOl应答于内皮缩血管肽_1的反复刺激并出现轻度快速耐受。图12:mAN01稳定细胞系显示出应答于Ca2+离子载体即离子霉素的Cl-流。构建组成型过表达mANOl的稳定细胞系(HEK细胞)用于进行高通量筛选分析。为了测试HEK细胞系是否引发ANOl电流，施用离子霉素。施用离子霉素在全细胞中引起了强内向Cl—流。吸液管和电解溶液含有140mMNMDG-Cl。图13高通量筛选(HTS)分析的测试结果。mANOl稳定细胞系生长于96孔板的孔中。将稳定表达mANOl的HEK细胞与电压传感器荧光染料(Flipr_膜电位试剂盒，MolecularDevice)温育。Α.洗去荧光染料后加入100μMATP。通过荧光强度检测发现，给稳定表达mANOl的HEK细胞(左侧)施用ATP引起膜电位强烈改变，而对照HEK细胞中则无(右侧)。通过FlexStation2(Moleculardevice)以530nm激发波长和565nm发射波长检测荧光强度。B.施用Ca2+离子载体(即A23187，其增加细胞内Ca2+)在稳定表达ANOl的HEK细胞内引起膜电位改变(左侧)，但在对照HEK细胞中则无(右侧)。F/F。荧光强度比。C.2APB(已知的IP3受体阻断剂)预处理在稳定表达ANOl的HEK细胞中阻断了ATP诱导的膜电位改变。发明详述本发明包括新鉴定的钙活化型氯通道(CaCC)蛋白，其由SEQIDNO1的氨基酸序列代表，或与SEQIDNO:1具有至少90%的氨基酸序列相同性，并转运氯离子通过细胞膜。本发明的蛋白质包括天然存在的直系同源物，它们具有的氨基酸序列与源自小鼠的由SEQIDNO:1代表的氨基酸序列略有不同。示例性的直系同源物包括来自人(SEQIDNO3)和大鼠(SEQIDNO5)的直系同源物(图1)。本发明的蛋白质还包括所述蛋白质的保守变体。在本文中，保守变体指的是氨基酸序列的改变不会对蛋白质的生物学功能产生不良影响。如果取代、插入或缺失后被改变的序列妨碍或破坏了与该蛋白质相关的生物学功能，则称其对蛋白质产生了不良影响。例如，可以改变蛋白质的总电荷、结构或疏水/亲水特性而不对生物学活性产生不良影响。因此，可以改变氨基酸序列，例如使得肽更加疏水或者亲水，而不对蛋白质的生物学活性产生不良影响。通常，保守变体具有的氨基酸序列与SEQIDNO:1所示的鼠序列具有至少约90%、更优选地至少约95%的氨基酸序列相同性。此类序列的相同性或同源性在此被定义为，经对齐序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比同源性后，候选序列中与已知肽相同的氨基酸残基的百分数，且不将任何保守性取代视为序列相同性的一部分。N端、C端或内部延伸、缺失或肽序列内的插入将不会被视为影响同源性。本发明的CaCC基因是通过cDNA克隆实验鉴定的，这些实验的目的是鉴定新的CaCC基因。在功能未知的推定的通道样基因或转运蛋白样基因中，TMEM16A吸引了本发明人的注意，这是因为其具有多个推定的跨膜结构域并在人类中具有10个同源物(图2A)。由于所表达的TMEM16A序列标签常见于视网膜，因此采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从分离自小鼠眼睛的总RNA中扩增出了小鼠TMEM16A的全长互补DNA(cDNA)。小鼠TMEM16A(SEQIDNO1)与其人类的直系同源物(SEQIDNO:3；图1)具有高同源性(91%的氨基酸序列相同性)。推定大鼠的直系同源物(SEQIDNO5)在其N端具有额外的123个氨基酸。大鼠序列的其余部分与小鼠TMEM16A具有高同源性(99%相同性)。TMEM16A位于llql3人染色体，该处簇集了多种肿瘤相关基因，例如周期素D1、成纤维细胞生长因子3和4前体基因、骨髓瘤过表达基因和口腔癌过表达1基因，它们均与肿瘤发生密切相关(Huang,X.etal.,GenesChromosomesCancer45,1058-69(2006)禾口Schwab,Μ.,Bioessays20,473-9(1998))有趣的是，ΤΜΕΜ16Α在头颈部皮肤癌、口腔癌和其他癌症中被高度扩增。功能性表征的天然CaCC具有一些共同的特征(Eggermont，J.，ProcAmThoracSoc.1,22-7(2004)；Hartzell,C.etal.,J.,AnnuRevPhysiol67，719-58(2005);Frings,S.，Reuter,D.&Kleene，S.J.，ProgNeurobiol60,247-89(2000)；Machaca,K.etal.,Calcium-activatedChlorideChannels(ed.Fuller,C.M.)(AcademicPress,Amsterdam,2002)；禾口Nilius，B.&Droogmans，G.，PhysiolRev81，1415—59(2001))。当MfCa2+直接施加至膜片或将Ca2+透析到细胞内时，细胞内Ca2+的动员可活化CaCC。这种Ca2+敏感性取决于膜电位，因为CaCC在去极化时对Ca2+更加敏感。CaCC对一价阴离子具有通透性，其次序为Γ>Br_>Cl_，且被多种Cl_通道阻断剂抑制，例如，DIDS、尼氟灭酸和NPPB。小通道传导是CaCC的另一特征。更重要的是，通过受体刺激，CaCC可被一大类已知可动员细胞内Ca2+的配体活化。所克隆的TMEM16A符合天然CaCC的所有这些生物物理学和药理学谱。TMEM16A具有8个跨膜结构域(图2B)。由于TMEM16A具有8个跨膜结构域并具有阴离子通道特性，本发明人将其命名为Anoctamin1(“AN01”)。ANOl在细胞内蛋白质节段处具有多个蛋白激酶Α、蛋白激酶C、蛋白激酶G和酪蛋白激酶磷酸化的位点，在细胞外节段具有多个糖基化位点。尽管ANOl被细胞内Ca2+活化，但不存在结合Ca2+的特异性共有位点，例如电压门控Ca2+通道中存在的钙调蛋白的EF手或Ca2+-钙调蛋白的IQ基序。此外，在ANOl与其他克隆的Cl-通道(即囊性纤维化传导调节物(CFTR)C1_通道、ClCUCLCAUGABA受体亚型1和甘氨酸受体亚型1)之间未发现特异性序列同源性。ANOl表达于已知其中存在CaCC的组织中，气道内的上皮、唾液腺、胰腺导管、肾小管、肠道和皮肤表达高水平至中等水平的ΑΝ01。此外，在所有视网膜层和感觉神经元中均观察到致密ANOl免疫反应性，已知CaCC在这些组织中调节光传导和感觉传导(Frings，S.，Reuter,D.&Kleene,S.J.，ProgNeurobiol60，247-89(2000))。心肌表达ANOl，这与心室动作电位受CACC调变的认识相一致(ZYGMUNT,A.C.，Calcium-activatedChlorideChannels(ED.FULLER,C.Μ.)81-98(ACADEMICPRESS，AMSTERDAM,2002))。ANOl的表达谱显然与表现出CACC活性的组织相一致，这进一步支持ANOl是一种候选CACC。本发明还包括编码CaCC的核酸分子，特别是编码SEQIDNO:1的蛋白质(ANOl)的核酸分子和与之具有至少90%核苷酸序列相同性的核酸分子。本发明的核酸分子可包括编码具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:5的蛋白质以及在此所述的有关蛋白质的核酸分子，所述核酸分子优选地为分离的形式。示例性的核酸为SEQIDNO:2和4代表的核酸，它们分别编码SEQIDNO:1和3的蛋白质。在本文中，“核酸”被定义为RNA或DNA，它们编码上文定义的蛋白质或肽，或是与编码此类肽的核酸序列互补，或是编码与所述肽序列具有至少90%序列相同性、更优选地至少95%序列相同性的多肽。在本文中，当核酸分子基本上与来自核酸源中编码其他多肽的污染核酸分开时，称所述核酸分子是“分离的”。此外，本发明提供鉴定调变蛋白质活性的药剂的方法，其中所述蛋白质由SEQIDNO1的氨基酸序列代表或与SEQIDNO1的氨基酸序列具有至少90%的相同性并转运氯离子通过细胞膜，所述方法包括(a)将表达所述蛋白质的细胞暴露于所述药剂；和(b)测量所述暴露细胞内氯离子转运的程度，其中与表达所述蛋白质但不暴露于所述药剂的对照细胞相比，氯离子转运程度的改变表明药剂能够调变所述蛋白质的活性。可通过以编码本发明的CaCC蛋白的核酸分子转染真核细胞而制备本发明的方法中所使用的细胞。可用于本发明的方法的真核细胞无特别限制，只要细胞系适合于细胞培养方法并适合表达所述基因产物即可。优选的真核宿主细胞包括但不限于，哺乳动物细胞，优选脊椎动物细胞，例如来自小鼠、大鼠、猴或人类细胞系的细胞。细胞可选自上皮细胞、肌细胞、神经元细胞和腺细胞。优选的真核宿主细胞包括人胚肾(HEK)细胞、HEK293细胞(ATCCCRL1573)、3T3-L1细胞(ATCCCL173)、C6细胞(ATCCCCL107)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCCCCL61)、CH0_K1细胞(ATCCCCL61)、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3(ATCCCRL1658)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、C0S-1细胞(ATCCCRL1650)、C0S-7细胞(ATCCCRL1651)、HaCaT细胞、HeLa细胞(ATCCCCL2)、HeLaS3细胞(ATCCCCL2.2)、H印G2细胞(ATCCHB8065)、HL-60细胞(ATCCCCL240)、HUV_EC_C细胞(ATCCCRL1730)、Jurkat细胞(ATCCTIB152)、K-562细胞(ATCCCCL243)、L6细胞(ATCCCRL1458)、MCF7细胞(ATCCHTP22),MDCK细胞(ATCCCCL34)、NIH/3T3细胞(ATCCCRL1658)、RAW264.7细胞(ATCCTIB71)、RBL-I细胞(ATCCCRL1378)、SH-SY5Y细胞(ATCCCRL2266)、U-937细胞(ATCCCRL1593.2)和类似的真核组织培养细胞系。ANOl的鉴定已经导致发现了能够上调或下调其活性的化合物。活性被定义为ANOl的氯通道功能或表达的任何改变。下调ANOl的分子因此是本发明的一部分。下调在此被定义为AN01、其配体或激活物的活化、功能或合成的降低。在本发明中，与无药剂的对照细胞中的情况相比，诱导本发明的CaCC(例如，AN01)的氯离子转运程度发生至少10%、优选地至少1000%的改变的药剂被选定作为所需的药剂。所述改变可以是氯离子转运程度的升高或降低。在本发明的方法中，可通过检测电流应答以及荧光改变而确定氯离子转运程度，所述荧光改变检测细胞内氯浓度或膜电位改变。本发明的方法可进一步包括测量特定蛋白质的表达，其中该特定蛋白质的表达与由SEQIDNO:1的氨基酸序列代表的蛋白质或与SEQIDNO:1具有至少90%的氨基酸序列相同性的蛋白质的活性相关。所述特定蛋白质可以是唾液腺蛋白、肺蛋白、神经元蛋白、胰腺蛋白、心脏蛋白、胃肠道蛋白、肾脏蛋白、视网膜蛋白和外分泌腺蛋白。根据本发明的另一个方面，提供了通过所述方法鉴定的药剂。所述药剂可选自化学化合物、天然产物、寡核苷酸、肽和抗体的库。药剂可以是ANOl的激动剂或拮抗剂。本发明的拮抗剂包括那些与ANOl相互作用或结合并使之灭活的分子。本发明包括阻断ANOl活化的ANOl拮抗剂。拮抗剂是这样的化合物，它们本身不具有药理学活性，但通过妨碍激动剂的作用而产生作用。为了鉴定本发明的拮抗剂，可测试其与ANOl的天然配体的竞争性结合。可通过监测ANOl功能的下调而产生拮抗性结合和活性的测定法。拮抗剂的结合可涉及所有已知类型的相互作用，包括离子力、氢键、疏水相互作用、范德华力和共价键。此外，本发明也提供妨碍ANOl的合成或降低其生物学稳定性的化合物。本发明的拮抗剂可以是ANOl的抗体。ANOl的抗体可以是多克隆或单克隆的，可采用本领域熟知的标准技术制备。抗体与本发明的ANOl蛋白的关键位置具有免疫反应性。可通过用(含有所述蛋白质上意欲被抗体所针对的那些区域作为抗原性区域的)肽来免疫合适的哺乳动物对象而获得抗体。根据本发明的一个方面，提供了药物组合物，其包含调变ANOl或与之具有序列同源性的蛋白质的活性的药剂，所述药剂是通过本发明的方法鉴定的。此外，根据本发明的另一个方面，提供了所述药剂在制备用于治疗因Ca2+-活化型氯通道功能异常而引起的疾病的药物中的用途。可使用调变或下调所述蛋白质的表达的药剂或例如所述蛋白质的至少一种功能的激动剂或拮抗剂等药剂来调变与所述蛋白质的功能和活性相关联的生物学和病理学过程。在本文中，对象可以是任何哺乳动物，只要所述哺乳动物需要对由本发明的蛋白质介导的病理学或生物学过程进行调变即可。病理学过程指的是一类产生有害效应的生物学过程。由于CaCC广泛参与多种基本过程，认为ANOl功能异常很可能导致一些疾病，例如囊性纤维化、口腔干燥症、眼球干燥症、高血压、各种癌症、肾脏疾病、心律失常、胰腺疾病和疼痛。在本文中，当药剂降低疾病过程的程度或严重性时，称该药剂调变病理学过程。例如，可通过施用以某种途径降低或调变本发明的ANOl的表达或至少一种活性的药剂而预防囊性纤维化或调变其疾病的进展。因此，本发明的药剂可用于预防或治疗囊性纤维化、口腔干燥症、眼球干燥症、高血压、各种癌症、肾脏疾病、心律失常、胰腺疾病、疼痛和各种其他慢性病。近来有越来越多的证据表明AN01/TMEM16A参与肿瘤发生。TMEM16A最初命名为TA0S2(肿瘤扩增和过表达的蛋白质2)，这是因为其位于人染色体Ilq13的基因座内，在大量的肿瘤例如口腔鳞状细胞癌、食道癌、膀胱癌和乳腺癌中，一些基因例如周期素D1、成纤维细胞生长因子3和4前体基因均在该处被扩增(Huang，X.etal.，GenesChromosomesCancer45，1058-69(2006)；和Schwab，Μ.,Bioessays20,473-9(1998))。基因微阵列分析发现，ΑΝ01/ΤΜΕΜ16Α在头颈部鳞状细胞癌中被上调17倍(Carles，A.etal.，Oncogene25，1821-31(2006))，其还在胃肠道基质瘤中高表达(ffest,R.B.etal.,AmJPathol165，107-13(2004))。尚不知造成ANOl在肿瘤中的这种倾向的原因，但推测肿瘤细胞增殖可能需要一种分泌环境。因此，本发明的药剂可用于预防或治疗这些组织的癌症。口腔干燥症是由医学处理、各种疾病或老年所引起的口腔干燥。口腔干燥症患者的唾液流量降低，且因此造成患者讲话和吞咽困难、口腔感染和食欲低下。老年人常有口腔干燥症。已知CaCC在唾液产生中具有关键作用(Arreola，J.etal.,JGenPhysiol108，35-47(1996))。实际上，唾液腺存在高ANOl免疫反应性(图8F)。由于通过注射ANOl小干扰RNA下调ANOl使得唾液产生减少(图9Β)，因此ANOl显然在唾液产生中发挥关键作用。因此，本发明的药剂可用于预防或治疗口腔干燥症。在另一实施方式中，本发明人鉴定了可通过上调ANOl而进行治疗的疾病状态。本发明提供通过上调ANOl而进一步增加钙依赖性氯分泌来治疗囊性纤维化气道上皮中cAMP介导的氯分泌缺陷的方法。上调ANOl导致氯分泌增加并恢复细胞的氯梯度，使得气道上皮细胞功能正常。本发明的药剂可通过胃肠外、皮下、静脉、肌肉、气管内、经皮或含服等途径施用。或者，所述药剂可通过口服途径施用或直接施用至靶器官。剂量将取决于被治疗者的年龄、健康状况和体重、同时进行的治疗类型和所需的治疗效果。药剂可全身施用或局部施用，这取决于被治疗的疾病、是否需要部位特异性治疗、施用药物的量等因素以及类似因素。可采用局部施用。可使用任何常规的局部配制品，例如溶液、悬液、凝胶、药膏或或软膏等等。制药领域熟知此类局部配制品的制备方法。对于局部施用，这些药剂可作为粉剂或喷剂施用，特别是以气溶胶形式施用。可将活性成分置于适合于全身施用的药物组合物中施用。众所周知，如果药物被全身施用，其可以被配制为粉剂、丸剂、片剂等等或作为糖浆或酏剂，用于口服。对于静脉、腹腔内或病灶内施用，药剂可被配制为能够注射施用的溶液或悬液。某些情况下，可以将这些药剂配制为栓剂形式，或者是用于皮肤下包埋或肌肉内注射的缓释制剂。在优选的实施方式中，可通过吸入方式施用本发明的药剂。对于吸入治疗，可将药剂置于溶液内用于通过计量吸入器施用，或者是用于干粉吸入器的形式。有效量是可上调或下调ANOl的量。具体的有效量将随情况而变化，在特定情况下可依据待治疗的疾病的严重程度和患者对治疗的敏感性而不同。因此，可通过常规实验确定具体时间和地点的具体有效量。不过，预期在治疗因ANOl功能异常引起的疾病时，治疗有效量通常在0.01至500mg/kg体重/天之间。本发明还包括药物组合物，其包含本发明的药剂和药用可接受的载体。药用可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括来源于石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油和麻油等等。当静脉施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射液。除了药理学活性齐IJ，本发明的组合物还可含有合适的药用可接受的载体，包括赋形剂和辅料，它们有助于将活性剂加工成可药用制剂，以便输送至作用部位。适合胃肠外施用的配制品包括水溶性形式的活性剂的水溶液，例如，水溶性盐。此外，可以合适的油性注射悬液施用活性剂悬液。合适的脂溶性溶剂或载体包括脂肪油，例如，麻油或合成的脂肪酸酯，例如，油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬液可含有增加悬液粘稠度的物质，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或右旋糖酐。任选地，悬液还可含有稳定剂。可利用脂质体包囊化药剂用于输送至细胞内。本发明的用于全身施用的药用配制品可配置为用于胃肠道、胃肠外或局部施用，例如，气溶胶配制品。实际上，可同时采用所有这三种类型的配制品来实现活性成分的全身施用。适合口服施用的配制品包括硬胶囊和软胶囊、丸剂、片剂包括包衣片剂、酏剂、悬液、糖浆或吸入剂及其缓释形式。在实施本发明的用途和方法时，本发明的药剂可单独使用，或是与其他治疗剂或诊断剂组合使用。在某些优选的实施方式中，本发明的药剂可与根据普遍接受的医疗实践而通常用于治疗该疾病的其他药物一起共同施用。本发明的药剂可体内使用，通常用于哺乳动物，优选地用于人类。以下实施例用于进一步阐述本发明，其无意于限制本发明的范围。此外，下文中用于固体固体混合物、液体液体混合物和固体液体混合物的百分数分别基于wt/wt、vol/vol和wt/vol，如无特别指出，所有反应均在室温下进行。参考实施例1克隆小鼠和人的ANOl(1)克隆小鼠ANOl使用PowercDNASynthesisKit和oligo(dT)引物(iNtRONBiotech，Sungnam，Korea)自分离自小鼠眼睛的总RNA反转录分离第一链cDNA。通过RT-PCR获得mANOl的全长编码序歹Ij(TMEM16A；NM178642.4GI:110835695)，其中使用了位点特异性PCR引物正向引物5'-CCGCTCGAGGCCACCATGAGGGTCCCCGAGAAG-3‘(SEQIDNO6)和反向引物5'-GGGGTACCCTACAGCGCGTCCCCATGGTAC-3‘(SEQIDNO:7)。将PCR产物插入pGEM-Teasy载体(Promega，Madison，WI)，以XhoI和KpnI酶切，并插入pSDTF(SeoulNationalUniversity的Prof.Kang惠赠)的XhoI/KpnI位点用于卵母细胞表达，或插入pEGFP-Nl(Clontech，PaloAlto，CA)用于在哺乳动物细胞内表达mANOl。所得载体分别命名为pSDTF-mANOl和pEGFP-附-mANOl。pEGFP-Nl载体含有EGFP基因。为了表达AN01-EGFP融合蛋白，使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla,CA)缺失了pEGFP-m-mANOl中的终止密码子，这是因为pEGFP-附-mANOl在mANOl和GFP编码序列之间具有一个密码子，所得载体命名为pEGFP-Nl-mAN01-GFP。(2)克隆人ANOl通过PCR方法从人气管总RNA(Clontech，PaloAlto,CA)克隆hANOl(人TMEM16A；ΝΜ_018043,GI:40354209)，使用了如下引物正向引物5'-CTCGAGGCCACCATGAGGGTCMCGAGMGTACTC-3‘(SEQIDNO8)和反向引物5'-GGTACCCTACAGGACGCCCCCGTGGTAG-3‘(SEQIDNO9)。PCR产物经XhoI和KpnI酶切，然后插入pSDTF或pEGFP-Nl的XhoI/KpnI位点。参考实施例2克隆GPCR通过RT-PCR分别从HEK293T细胞、大鼠背根神经节细胞和HaCaT细胞的单链cDNA获得以下基因的全长cDNA人内皮缩血管肽受体类型A(EDNRA(ETaR):NM_001957,gi4503464，正向引物5'-GCGGCCGCGCCGCCACCATGGAAACCCTTTGCCTCAG_3'(SEQIDNO:10)，反向引物5'-TCTCTAGATCAGTTCATGCTGTCCTTATG_3'(SEQIDNO:11))、大鼠组胺受体类型1(Hrhl；NM_017018,gi:7549757，正向引物5'-CGGGATCCGCCACCATGAGCTTTGCCAATACCT-3‘(SEQIDNO:12)，反向引物5'-GGAATTCTTAGGAACGAATGTGCAGAATCTTTTTGAATGTCTTCT-3‘(SEQIDNO13))、人嘌呤能受体P2Y，G-蛋白偶联2(P2RY2；AY_136753,gi:22658488，正向引物5'-CGGAATTCGCCACCATGGCAGCAGACCTGGGCC-3‘(SEQIDNO:14)，反向引物5'-CGGGATCCCTACAGCCGAATGTCCTTAGTGTTC-3‘(SEQIDNO:15))。将所述全长cDNA分别插入哺乳动物细胞表达载体PCDNA3.1(Invitrogen)、pEGFP-Nl(clontech)禾口pXOON(UniversityofCopenhagen的Prof.Τ·Jespersen惠赠)。大鼠血管紧张素II受体亚型l(Agtrla；NM_030985,GI=140969764)和人毒蕈碱受体亚型1(CHRM1；NM_000738,GI37622909)分别由Dr.YSBae(EwhaWomen'sUniversity,Seoul,Korea)禾口Dr.CHLee(HanyangUniversity,Seoul,Korea)赠予。参考实施例3卵母细胞记录使用BamHI将参考实施例1中得到的pSDTF_mAN01线性化。使用SP6RNA聚合酶(mMESSAGEmMACHINESP6Kit，Ambion，Austin，TX)转录互补RNA。光滑爪蟾卵母细胞经胶原酶(IA型，Sigma)去滤泡膜后，将50nl焦碳酸二乙酯处理的水中的50ng的mANOl互补RNA注入卵母细胞。注入后2至5天，采用双电极电位箝技术记录全细胞电流。电解溶液含有96mMNaCl,ImMMgCl2,5mMHEPES,2mMKCl禾口1.8mMCaCl2,pH7·5，以2ml/min灌注。实验在室温下进行。参考实施例4=RTQ-PCR分析采用实时定量PCR(RTQ-PCR)测量组织中ANOl的表达水平。使用ProbeFinder软件(http//www,universalprobelibrary.com)设计小鼠ANOl特异性通用探针(#9，5'-TGGTGATG-3')和PCR引物(正向引物5'-TGGCATTTGTCATTGTCTTCC-3'(SEQIDNO:16)，反向引物5'-TCACCCAGTCCACAAAGTCA-3'(SEQIDN0:17))。使用LIGHTCYCLER2.O系统(ROCHEAPPLIEDBIOSCIENCE，MANNHEIM，GERMANY)，根据生产商的方案进行RTQ-PCR扩增。采用外部标准方法，通过标准曲线从交叉点值计算出每250NG总RNA的绝对拷贝数。使用通过对含有MAN01CDNA的线性化质粒进行系类稀释而制备的5份样品建立标准曲线。所有反应一式三份进行。参考实施例5哺乳动物细胞表达MFuGENEHDii齐[J(RocheDiagnostics,Penzberg,Germany)VXpEGFP-Nl(对照)(1.Oμg)或pEGFP-Nl-mANOl(0.81.Oμg)和/或参考实施例2中所获得的任何一种GPCRcDNA(l.Oyg)转染HEK293T细胞。将转染的细胞培养在DMEM，37°C，5%CO2的湿化环境中，DMEM中补充了热灭活的10%胎牛血清(GIBC0BRL，Rockville，MD)和青霉素_链霉素。转染后1或2天将转染的细胞用于生物化学和电生理学实验。参考实施例6产生抗体使用相应于位于ANOl的TM2和TM3之间的胞浆区域(SEQIDNO1的第451466位氨基酸KDHPRAEYEARVLEKS)的合成肽(ABFRONTIERCO.,SEOUL,KOREA)在兔子中产生针对小鼠ANOl的多克隆抗体。简言之，以THERMO(THERMOELECTRON,BREMEN,GERMANY)合成免疫级的肽。通过背部皮下注射2.5MG的肽抗原免疫兔子，所述肽抗原缀合于IOMG的钥孔血蓝蛋白载体蛋白并在完全弗氏佐剂中乳化。第一次免疫后4周，给兔子加强免疫3次，间隔为2周，使用不完全弗氏佐剂中的肽-钥孔血蓝蛋白缀合物(500yG)。使用抗原肽特异性亲和柱层析和蛋白A-SEPHAR0SE柱层析纯化小鼠ANOl多克隆抗体。通过免疫印迹证实了所纯化的抗体的特异性。参考实施例7构建ANOl的稳定细胞系使用Lipofectamine(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)以pEGFP-N1-mANOl转染HEK293细胞。在800μg/ml遗传霉素(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)中筛选15天后，以克隆柱挑取单个集落并测试ANOl的活性。参考实施例8=ANOl的免疫组化染色制备10%福尔马林固定石蜡包埋的组织切片(4μm厚度)，置于硅烷化玻璃载片上，以二甲苯脱蜡3次，在系列乙醇中再水化，然后浸入0.3%H202猝灭内源性过氧化物酶活性。将切片在IOmM柠檬酸缓冲液(pH6.0)中微波20min以恢复抗原，与1400稀释的参考实施例6制备的兔抗小鼠ANOl多克隆抗体温育60min，以漂洗溶液(含有0.1%Tween20的蒸馏水)漂洗3次。然后将它们与缀合有山羊抗兔抗体和辣根过氧化物酶的右旋糖酐聚合物(Envisionpluskit,DAKO,Carpinteria，CA)室温温育20分钟，漂洗并洗涤。然后以液体3，3'-二氨基联苯胺显色5分钟。然后以Meyer苏木素复染切片，脱水并以加拿大树胶封片。以正常兔血清进行平行处理作为阴性对照；未观察到阳性染色。参考实施例9:记录电流为形成千兆封口(gigaseal)，通过轻柔抽吸使得3M欧姆的包被Sylgard的玻璃吸液管与各个细胞表面接触，然后将接头电位调整至OmV。然后通过抽吸破坏与吸液管相接处的膜以形成全细胞。吸液管溶液含有140mMNMDG-Cl,2mMMgCl2,IOmMHEPES,2mMATP和0.3mMGTP，调节至pH7.2，电解溶液含有140mMNMDG-C1，2mMMgCl2和IOmMHEPES(pH7.2)。对于例证选择性实验，将电解溶液中的140mMNMDG-Cl替换为等摩尔的NaCl，NaI，NaBr,NaNO3,NaF或葡糖酸钠。为了确定电流_电压关系，给全细胞施加从_80或-IOOmV至+80或+IOOmV的电压斜坡达350ms，或施加从-IOOmV至+IOOmV的电压脉冲达400ms。当mANOl被300nM细胞内Ca2+活化时，施加2500ms的电压脉冲。使用Axopatch200B放大器(MolecularDevice,Sunnyvale,CA)放大全细胞电流，经Digidata1440(MolecularDevice)数字化后储存于个人电脑中。对于单通道电流记录，从千兆封口形成接触的细胞或外翻膜片。吸液管和对照电解溶液含有140mMNMDG-Cl,2mMMgCl2和IOmMHEPES(pH7.2)。将电流放大，经2kHz滤波，存储于数据记录器中，需要时可将这些数据传输至个人电脑进行电流振幅分析。为了创建振幅直方图，使用PClamp软件(version6.0,MolecularDevice)分析开放和闭合的单通道电流事件。采用半振幅算法确定开放事件。开放事件的最小持续时间设定为0.Ims0参考实施例10通过电压感知荧光法测定ANOl活性根据生产商的说明，使用FLIPR.膜电位试剂盒(Moleculardevices,Sunnyvale,CA)表征ANOl-稳定细胞系的活性。将ΑΝ01-稳定细胞系接种于聚-D-赖氨酸包被的96孔板(50，000个细胞/孔)。铺板后1天，将细胞与含有膜电位染料的50μLHank平衡盐溶液(HBSS)温育40min，37°C。为了测试ANOl稳定细胞系的活性，开始检测后20秒将100μMATP或10μMΑ23187(Sigma,StLouis,MO,USA)加入至各孔。通过荧光成像板读数器(FlexStationII,MolecularDevices)测定荧光强度。在530nm激发膜电位染料，在565nm测定发射荧光的强度。实施例1克隆和表征ANOl(I)ANOl的克隆为了克隆推定的CaCC，本发明人搜索了公共数据库中的具有两个以上跨膜结构域和多个亚型的推定的通道样基因或转运蛋白样基因。在功能未知的推定的通道样基因或转运蛋白样基因中，TMEM16A吸引了本发明人的注意，这是因为其具有多个推定的跨膜结构域并在人类中具有10个同源物(图2A)。由于所表达的TMEM16A序列标签常见于视网膜，因此按照参考实施例1的方法，采用RT-PCR(反转录-聚合酶链反应)从分离自小鼠眼睛的总RNA中扩增出了全长TMEM16A互补DNA(cDNA)。小鼠TMEM16AcDNA含有2，880个核苷酸的开放读码框(SEQIDNO:2)，其编码一960个氨基酸的蛋白质(SEQID而1;图1)。克隆的TMEM16A具有12个额外的核苷酸，即1342-GGAAGCTGTCAA-1353，其编码4个额外的氨基酸(448-EAVK-451)，它们未被纳入公共数据库BLAST所报道的核苷酸序列(NM_178642，gi110835695)中。小鼠TMEM16A与其人类的直系同源物(SEQIDN0:3;图1)具有高同源性(91%的氨基酸序列相同性)，其推定的大鼠直系同源物(SEQIDNO5)在其N端具有额外的123个氨基酸，大鼠序列的其余部分与小鼠TMEM16A具有高同源性(99%相同性)。TMEM16A位于llql3人染色体，该处簇集了多种肿瘤相关基因，例如周期素D1、成纤维细胞生长因子3和4前体基因、骨髓瘤过表达基因和口腔癌过表达1基因，它们均与肿瘤发生密切相关(Huang，X.etal.，GenesChromosomesCancer45，1058—69(2006)和Schwab，Μ.，Bioessays20,473—9(1998))。有趣的是，ΤΜΕΜ16Α在头颈部皮肤癌、口腔癌和其他癌症中被高度扩增。(2)亲水区分析亲水区分析(ΗΜΜΤ0Ρ2.0软件，http//www.enzim.hu/hmmtop)提示TMEM16A具有8个跨膜结构域(图2B)。由于TMEM16A具有8个跨膜结构域并具有阴离子通道特性(见下文)，本发明人将其命名为Anoctaminl。共有序列分析(Myhits基序扫描软件，http://myhits.isb-sib.ch/cgi_bin/motif_scan)推定ANOl在细胞内蛋白质节段处具有多个蛋白激酶Α、蛋白激酶C、蛋白激酶G和酪蛋白激酶磷酸化的位点，在细胞外节段具有多个糖基化位点。尽管ANOl被细胞内Ca2+活化(见下文)，但未发现存在结合Ca2+的特异性共有位点，例如(电压门控Ca2+通道中存在的)钙调蛋白的EF手或Ca2+-钙调蛋白的IQ基序。此夕卜，在ANOl与其他克隆的Cl—通道(即囊性纤维化传导调节物(CFTR)Cr通道、C1C1、CLCA1、GABA受体亚型1和甘氨酸受体亚型1)之间未发现特异性序列同源性。(3)蛋白印迹对于蛋白印迹分析，收集以pEGFP-m-mAN01或pEGFP-m_rnAN01-EGFP转染的HEK293T细胞的总裂解物，在10%SDS-PAGE凝胶中电泳，转移至PVDF膜，然后以抗mANOl多克隆抗体(15，000)进行印迹分析。加入N-糖苷酶F以裂解潜在的糖基化加合物。结果观察到一130kDa的蛋白质发生迁移。该蛋白质稍大于预期的mANOl(IlOkDa)，推定为是糖基化所致。不过，以N-糖苷酶F处理裂解物后观察到一IlOkDa的分离条带(图2C)。(4)实时定量PCR根据参考实施例4的方法进行实时定量PCR确定各种器官中ANOl转录物的水平。如图2D所示，发现ANOl转录物均勻分布于各器官，唯独发现肺和睾丸内的水平要高的多。(5)ANOl的细胞内定位为了确定ANOl的细胞内定位，以参考实施例1中制备的载体pEGFP-Nl、pEGFP-Nl-mAN01-GFP或pEGFP-Nl_mAN01转染HEK293T细胞，并获得其共聚焦显微镜图像。使用mANOl抗体和AlexaFluor594-缀合的第二抗体(山羊抗兔IgG)检测mANOl。当异源表达于HEK293T细胞时，在质膜处观察到ANOl-GFP融合蛋白，而异源表达的GFP主要表达于胞浆(图2E；pEGFP-Nl(左侧)、pEGFP-附-mANOl-GFP(中间)或pEGFP-附-mANOl(右侧))。mANOl被发现定位于转染了mANOl的HEK293T细胞的质膜。实施例2=ANOl由受体刺激操控在生理学条件下已知CaCC由GPCR刺激活化。内皮缩血管肽_1是强血管收缩剂，其通过激活CaCC使得血管平滑肌去极化(Klockner，U.&Isenberg，G.，PflugersArch.418，168-75(1991)；禾口Salter，K.J.&Kozlowski,R.Ζ.,JPharmacolExpTher.279,1053-62(1996))。因此，根据参考实施例5的方法将mANOl和内皮缩血管肽受体亚型A(ETaR)转染入HEK293T细胞，一起转入的还有GFP，用于观察鉴定转染的细胞。使用全细胞测试mANOl对ETaR刺激的电流应答。吸液管和电解溶液含有140mMN-甲基D-葡萄糖胺(NMDG)-Cl，其使得Cl_可用作主要电荷载体。吸液管溶液不含有Ca2+且不含EGTA。当膜电位保持在_60mV时，施加50nM内皮缩血管肽_1给mANOl-ETAR/HEK细胞引起强内向电流。与此不同的是，在以ETAR转染的HEK细胞或对照(仅转染GFP)细胞中内皮缩血管肽-1引起的电流很小。仅转染mANOl时，50nM内皮缩血管肽_1引起可感知到的电流，推测这是因为HEK细胞存在内源性内皮缩血管肽受体。类似地，给HEK细胞共转染mANOl与毒蕈碱受体亚型1(MlR)、组胺受体亚型1(HlR)、嘌呤能受体亚型2(P2Y2R)或血管紧张素受体亚型I(ATlR)(已知它们的细胞内功能均使用CaCC(Zholos,A.etal.，JGenPhysiol125，197-211(2005)；Guibert,C.etal.，AmJPhysiol270，L637-42(1996)；和Wayman，C.P.etal.,BrJPharmacol121,1301-8(1997))导致对碳酰胆碱(ΙμΜ)、组胺(100μΜ)或血管紧张素11(1μΜ)产生强电流应答(图3Α和3Β)。于此不同的是，当仅以这些受体转染HEK细胞时或是在对照(仅转染GFP)细胞中，这些配体引起很小的电流。此外，在转染mANOl的细胞中，施加碳酰胆碱引起的电流虽小，但仍明显强于对照细胞中的电流，推测这是因为对照HEK细胞中存在这些配体的内源性受体(图3B)。内皮缩血管肽-1-诱导的ANOl电流的电流-电压关系是弱外向整流或线性的(图3C)，这与当细胞内具有高Ca2+浓度时内源性CaCC的线性电流-电压关系相一致(图5A)(Kuruma,A.&Hartzell，H.C.，JGenPhysiol115，59-80(2000)；Piper,A.S.&Large,W.Α.,JPhysiol547，181-96(2003)；和Evans，Μ.G.Marty,Α.，JPhysiol378，437-60(1986))。总之，这些结果证实ANOl由受体刺激活化。实施例3活化爪蟾卵母细胞内的mANOl爪蟾卵母细胞是研究内源性CaCC的公认模型，这是因为它们表达‘受精去极化作用，所需的内源性CaCC(Hartzell，H.C.etal.，MolPharmacol51,683-92(1997))。此外，爪蟾CaCC的生物物理学和药理学特性类似于哺乳动物CaCC(Machaca,K.etal.,Calcium-activatedChlorideChannels(ed.Fuller,C.Μ.)(AcademicPress,Amsterdam,2002))因此，本发明人在爪蟾卵母细胞中表达mANOl并使用1μMLPA(溶血磷脂酸)测试其被受体刺激的活化。已知爪蟾的CaCC被LPA活化(Guo，Ζ.etal.,ProcNatlAcadSciUSA.93，14367—72(1996)；禾口Kim，M.J.etal.,BiochemPharmacol.59，241-7(2000))。发现将LPA施加给注入水的卵母细胞引起的内向电流与所报道的相当(Guo,Z.etal.，见上文；和Kim,M.J.etal.，见上文)(图4A和4B)。于此不同的是，当根据参考实施例3的方法将LPA施加给注入互补mANOlRNA的爪蟾卵母细胞时，针对LPA的电流应答增加大约6倍(图4B)。此外，LPA-诱导的ANOl电流是外向整流的，类似于爪蟾卵母细胞中的天然CaCC的情况(Machaca，K.etal.，见上文)(图4C)。反转电位是37.7士1.05mV(n=5)，接近于爪蟾卵母细胞中的Cr平衡电位(Weber,W.，BiochimBiophysActa1421,213-33(1999))。实施例4受体操控的CaCC的信号途径已知各种GPCR通过Gq类Gα-蛋白的作用活化CaCC，所述Gα-蛋白刺激磷脂酶C(PLC)以产生IP3，随后Ca2+从内部储存处释放(Zholos，A.etal.，JGenPhysiol125，197-211(2005)；和Mauduit，P.etal.，AmJPhysiol264,C1550-60(1993))。因此，ANOl被LPA活化很可能是PLC/IP3信号途径介导的。的确，给表达mANOl的卵母细胞施加LPA(1μM)诱导大内向电流。在施加LPA之前以1μM毒胡萝卜内酯(细胞内Ca2+储存耗竭剂)预处理3小时或以10μMU_73122(PLC抑制剂；Sigma,St.Louis,MO)预处理20min完全阻断了LPA电流应答(图IOA和10B)。此外，给表达ANOl的卵母细胞微注射50nl2mMIP3引起强内向电流，而给注入水的卵母细胞(对照)注入IP3引发较小、但仍是可检测到的电流，并且与卵母细胞中内源性CaCC的情况相当(Kuruma,A.&Hartzell,H.C.,AmJPhysiol276，C161-75(1999))。此外，1μM毒胡萝卜内酯预处理在表达mANOl的卵母细胞中阻断了IP3-诱导的电流(图IOC和10D)。因此，这些结果提示，ANOl由增加细胞内Ca2+浓度的细胞内信号、特别是通过PLC/IP3途径活化。实施例5=ANOl是氯通道为了确定ANOl的离子选择性，根据参考实施例9的方法给AN01_ETaR/HEK细胞施加从-80至+80mV的电压斜坡。给全细胞施加内皮缩血管肽-1(50nM)引起ANOl电流；吸液管溶液含有HOmMNMDG-Cl(OmMCa2+，OmMEGTA)。当电解溶液(细胞外液)含有等摩尔的NMDG-Cl时，观察到在OmV(-4.5mV)附近反转的线性电流-电压关系(图5B)。此外，当电解溶液改变为140mM的葡糖酸钠，未观察到外向电流。由于NMDG+和葡糖酸盐不能通过通道，因此这些结果证实ANOl是阴离子通道。一价阴离子的通透次序是CaCC的特征(Hartzell，C.etal.，J.，AnnuRevPhysiol67,719-58(2005)；Kidd，J.F.&Thorn，P.，AnnuRevPhysiol62,493-513(2000)；和Frings，S.，Reuter,D.&Kleene,S.J.，ProgNeurobiol60，247—89(2000))，因此研究了ANO1对其他一价阴离子的相对通透性。对于本实验，吸液管溶液含有14OmMNMDG-Cl(OCa2+)。利用Goldman，HodgkinandKatz方程从以Br、I-或NOf替换细胞外Cr所诱导的反转电位来改变估计通透性比率(Px/Pci)(Arreola,J.&Melvin,J.Ε.，JPhysiol547，197-208(2003))。当槽内的NaCl被等摩尔的NaF，NaBr，NaI或NaN03替换时，反转电位从-9.0士0.6mV(η=5)分别改变为+12.5士2.9(η=8)，-23.1士2.2(η=5)，-24.7士2.5(η=5)和-29.1士1.ImV(η=7)(图2C)。因此，这些一价阴离子的相对通透性是Ν03_(2.20)>Γ(1.85)>Br_(1.74)>CF(LO)>F_(0.43)，这与内源性CaCC的情况完全一致(图5B；Hartzell,C.etal.，J.，AnnuRevPhysiol67，719—58(2005)禾口Frings，S.，Reuter,D.&Kleene,S.J.，ProgNeurobiol60，247-89(2000))。CF通道阻断剂可阻断LPA-诱导的ANOl电流。在施加LPA之前1020min施加Cl_通道阻断剂。如图6A所示，施加已知的内源性CaCC阻断剂，4，4’-二异硫氰酸基-均二苯代乙烯-2，2，-二磺酸(DIDS，300yM)、尼氟灭酸(NFA，200yM)或5-硝基-2_(3_苯基-丙胺基)_苯甲酸盐(ΝΡΡΒ，200μΜ)(Hartzell,C.etal.，J.，AnnuRevPhysiol67，719-58(2005)；Kidd,J.F.&Thorn,P.，AnnuRevPhysiol62，493-513(2000)；和Frings，S.，Reuter，D.&Kleene，S.J.,ProgNeurobiol60，247-89(2000))，明细阻断了爪蟾卵母细胞中LPA-诱导的ANOl电流(图6A)。在转染了mANOl的哺乳动物细胞中也观察到了DIDS、尼氟灭酸或NPPB可阻断激动剂诱导的ANOl电流。在AN01/ETaR-HEK细胞中，以5分钟的间隔施加2次50nM内皮缩血管肽-1，发现第二次应答达到第一次应答的87.1士11.4%(η=12)，引发的弱快速耐受。不过，DIDS(10yM)、miflumicacid(lOyM)^PNPPB(10μΜ)预处理或共施用显著抑制了AN01/ETaR-HEK细胞对第二次施加内皮缩血管肽-1的这种应答(图6B)。实施例6=CaCC-特异性抑制剂的抑制作用此外，已知多种酶或转运蛋白的调变剂例如氟西汀(血清素再摄取抑制剂)、他莫昔芬(雌激素受体调节剂)、正苯基邻氨基苯甲酸(NPA，环加氧酶抑制剂)和甲氟喹(抗疟疾药)可阻断天然CaCC(Eggermont，J.，ProcAmThoracSoc.1，22-7(2004)；Nilius,B.etal.JPhysiol.498,381-96(1997)；Nilius,B.&Droogrnans,G.,ActaPhysiolScand177，119-47(2003))。如果ANOl是CaCC，那么mANOl应该被这些CaCC阻断剂抑制。的确，当采用实施例5的方法来测试时，这些化合物显著抑制了AN01/ETaR-HEK细胞中内皮缩血管肽-1诱导的电流(图6B)。实施例7=ANOl被细胞内Ca2+活化为证明ANOl被Ca2+活化，将Ca2+施加于分离自AN01/ETaR_HEK细胞的外翻膜片。将不同浓度的Ca2+加至槽液(细胞内侧)以剂量依赖性方式引起了可见单通道电流(Eh。ld=-60mV)(图7A)。在-60mV处，ANOl活化的半最大浓度(EC5tl)为2.6μM。在_60mV控制电位，Ca2+的阈值浓度达到大约0.3μM(图7B)。引人注目的是，Ca2+对ANOl的活化是电压依赖性的,这也是内源性CaCC的特征(Nilius,B.etal.，CellCalcium22,53-63(1997),Kuruma,A.&Hartzell,H.C.,JGenPhysiol115，59-80(2000)，Evans,Μ.G.&Marty,Α.，JPhysiol378,437-60(1986))。在去极化膜电位(+60mV)，ANOl对Ca2+更加敏感，且浓度应答曲线左移，使得EC5tl为0.4μM(图7B)。在-60和+60mV，浓度应答曲线的Hill系数分别为2.0和2.4。单通道ANOl电流的振幅很小，类似于内源性CaCC的情况(Nilius，B.etal.，JPhysiol498，381-96(1997)，Piper,Α.S.&Large,W.Α.,JPhysiol547,181-96(2003))。在_60mV，平均单通道电流振幅为0.42士0.OlpA(η=6)(图7C)。此外，在不同的膜电位测定了被Ca2+活化的ANOl的单通道电流振幅，并发现了线性电流-电压关系。此外，ANOl的斜坡电导(slopeconductance)为8.3pS，与各种类型细胞的天然CaCC的情况相当(Nilius，B.etal.，见上文，Piper,Α.S.&Large,W.Α.，见上文)。实施例8:表达谱为了观察ANOl的组织分布，按照参考实施例6的方法产生了用于免疫组化分析的ANOl多克隆抗体。为此选择了第451至466位残基，它们位于跨膜结构域2和3之间的细胞内环(图2Β)。此外，使用该多克隆抗体根据参考实施例8的方法进行多种组织的免疫组化染色。正如为CaCC候选物所预期的那样，发现ANOl表达于具有CaCC活性的组织中。如图8Α所示，在肺细支气管的上皮细胞中观察到致密的ANOl免疫反应性，而肺泡细胞中的表达较不显著。胰腺腺泡细胞也被ANOl抗体重度染色(图8Β)。在肾，致密的免疫反应性主要见于近端肾小管上皮(黑箭)，而远端肾小管较弱(箭头)(图8C)。引人注目的是，如电生理实验所证实的那样(Maricq，Α.V.&Korenbrot,J.I.，Neuron1，503-15(1988)，致密ANOl免疫反应性见于所有视网膜细胞层(图8D)，即含有光感受器体的外核层(箭头)、内核层和神经节细胞层(箭头)。背根神经节中的绝大多数感觉神经元而非卫星细胞具有阳性ANOl染色(图8Ε)，这与CaCC在感觉传导中的调节作用相一致(Kenyon,J.L.&Scott,R.H.,Calcium-activatedChlorideChannels(ed.Fuller,C.Μ.)135-166(AcademicPress，Amsterdam，2002))。与大感觉神经元(箭头)相比，小感觉神经元(箭头)倾向于染色更加致密，提示ANOl在伤害性知觉中具有调节作用，这是因为背根神经节中的小神经元密切参与伤害性知觉(Willis，W.D.&Coggeshall,R.Ε.，SensoryMechanismsoftheSpinalCord(ed.)(PlenumPress,NewYork,2004))。在下颂下腺，在腺泡细胞顶部观察到致密免疫反应性(图8F)。ANOl也表达于皮肤(图8G)，特别是角质细胞(箭头)和皮脂腺中(黑箭)。心肌细胞中也观察到中等ANOl表达(图8H)。于此不同的是，ANOl免疫反应性未见于脑内的特定神经核中，相反，神经束中有弱免疫反应性。此外，观察到莱迪希细胞有致密免疫反应性，而而睾丸内的正在生长的精母细胞内有中等免疫反应性。因此，ANOl在这些分泌性上皮细胞、心肌细胞和视网膜和感觉神经元内的表达谱与所报道的CaCC的定位一致(Hartzel1,C.etal.，J.，AnnuRevPhysiol67,719-58(2005)；禾口Frings，S.，Reuter,D.&Kleene,S.J.，ProgNeurobiol60，247-89(2000))ο实施例9:hAN01中的电流记录为了确定hANOl是否被GPCR刺激所活化，将根据参考实施例1的方法克隆的hANOl与ETaR—起表达于HEK细胞内。如图11所示，给hAN01/ETAR_HEK细胞施用内皮缩血管肽-1(50ηΜ)引起大Cl_流。此外，hANOl应答于内皮缩血管肽-1的反复刺激，引发小快速耐受。因此，与mANOl类似，hANOl也被受体刺激活化。实施例10小鼠ANOl稳定细胞系中的电流记录为了检测来自化合物库或其他化合物来源的活性化合物，根据参考实施例7的方法构建组成型表达小鼠ANOl的稳定细胞系。为了构建稳定细胞系，将小鼠ANOlDNA整合至人胚肾(HEK)细胞的基因组DNA中。如图12所示，施用500nM离子霉素(Ca2+离子载体)在该稳定细胞系中引起强内向电流。这证实ANOl在该稳定细胞系中组成型表达。实施例11通过ANOl中的电压敏感性荧光染料监测ANOl的活性为了确定ANOl是否适合于高通量筛选(HTS)分析，本发明人构建了组成型表达mANOl的稳定细胞(参考实施例7)。将该mANOl稳定细胞系生长于96孔板的孔中。将稳定表达mANOl的HEK细胞与电压传感器荧光染料(Flipr_膜电位试剂盒，MolecularDevice)温育，以检测当被ANOl活化时膜电位的改变。当ANOl被活化时，Cl—会流出细胞以使得膜去极化，这使得荧光染料发出荧光。洗去荧光染料之后，施加100μMATP。如图13Α所示，通过检测荧光强度发现，给稳定表达mANOl的HEK细胞(左侧)施加ATP引起膜电位强烈改变，但这不发生于对照HEK细胞(右侧)。通过FlexStation2(Moleculardevice)以530nm激发波长和565nm发射波长检测荧光强度。此外，如图13B所示，施加Ca2+离子载体A23187(其升高细胞内Ca2+)引起稳定表达ANOl的HEK细胞发生膜电位改变(左侧)，但这不发生于对照HEK细胞(右侧)。F/FQ:荧光强度比率。以2APB(—种已知的IP3受体阻断剂)预处理阻断了稳定表达ANOl的HEK细胞中由ATP诱导的膜电位改变(图13C)。这些结果表明采用荧光染料和稳定细胞系的方案适合于高通量筛选分析，也适合用于筛选改变ANOl活性的化合物。尽管前文结合上述具体实施方式描述了本发明，但应该认识到，本领域人员可以对本发明做出各种改动或变化，这些改动或变化也落入如所附权利要求书所定义的本发明的范围内。权利要求鉴定调变蛋白质活性的药剂的方法，其中所述蛋白质由SEQIDNO1的氨基酸序列表示或与SEQIDNO1具有至少90％的氨基酸序列相同性并转运氯离子通过细胞膜，所述方法包括(a)将表达所述蛋白质的细胞暴露于所述药剂；和(b)测量所述暴露细胞内氯离子转运的程度，其中与表达所述蛋白质但不暴露于所述药剂的对照细胞相比，氯离子转运程度的改变表明药剂能够调变所述蛋白质的活性。2.权利要求1的方法，其中所述与SEQIDN0:1具有至少90%的氨基酸序列相同性的蛋白质是由SEQIDNO:3或5的氨基酸序列表示的蛋白质。3.权利要求1的方法，其中表达所述蛋白质的细胞通过以编码所述蛋白质的核酸转染细胞而制备。4.权利要求3的方法，其中所述核酸由SEQIDNO:2或4的核苷酸序列组成。5.权利要求1的方法，其中所述细胞是真核细胞。6.权利要求5的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。7.权利要求6的方法，其中所述细胞选自人胚肾(HEK)细胞、HEK293细胞(ATCCCRL1573)、3T3-L1细胞(ATCCCL173)、C6细胞(ATCCCCL107)、中国仓鼠卵巢(CH0)细胞(ATCCCCL61)、CH0-K1细胞(ATCCCCL61)、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3(ATCCCRL1658)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、C0S-1细胞(ATCCCRL1650)、C0S-7细胞(ATCCCRL1651)、HaCaT细胞、HeLa细胞(ATCCCCL2)、HeLaS3细胞(ATCCCCL2.2)、H印G2细胞(ATCCHB8065)、HL-60细胞(ATCCCCL240)、HUV-EC-C细胞(ATCCCRL1730)、Jurkat细胞(ATCCTIB152)、K-562细胞(ATCCCCL243)、L6细胞(ATCCCRL1458)、MCF7细胞(ATCCHTP22)、MDCK细胞(ATCCCCL34)、NIH/3T3细胞(ATCCCRL1658)、RAW264.7细胞(ATCCTIB71)、RBL-1细胞(ATCCCRL1378)、SH-SY5Y细胞(ATCCCRL2266)、U_937细胞(ATCCCRL1593.2)和类似的真核组织培养细胞系。8.权利要求1的方法，其中所述药剂选自化学化合物、天然产物、寡核苷酸、肽和抗体。9.权利要求1的方法，其中所述药剂升高或降低氯离子转运程度。10.鉴定抑制蛋白质活性的药剂的方法，其中所述蛋白质由SEQIDN0:1的氨基酸序列表示或与SEQIDNO:1具有至少90%的氨基酸序列相同性并转运氯离子通过细胞膜，所述方法包括(a)将表达所述蛋白质和G蛋白偶联受体(GPCR)的细胞暴露于所述药剂；(b)给所得细胞施加GPCR配体；和(c)测量所述暴露细胞内氯离子转运的程度，其中与表达所述蛋白质和GPCR但不暴露于所述药剂的对照细胞相比，氯离子转运程度的降低表明药剂能够抑制所述蛋白质的活性。11.权利要求10的方法，其中与SEQIDNO:1具有至少90%的氨基酸序列相同性的蛋白质是由SEQIDNO:3或5的氨基酸序列表示的蛋白质。12.权利要求10的方法，其中表达所述蛋白质和GPCR的细胞通过分别以编码所述蛋白质的核酸和编码GPCR的核酸转染细胞而制备。13.权利要求12的方法，其中所述核酸由SEQIDNO:2或4的核苷酸序列组成。14.权利要求10的方法，其中所述细胞是真核细胞。15.权利要求14的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。16.权利要求15的方法，其中所述细胞选自人胚肾(HEK)细胞、HEK293细胞(ATCCCRL1573)、3T3-L1细胞(ATCCCL173)、C6细胞(ATCCCCL107)、中国仓鼠卵巢(CH0)细胞(ATCCCCL61)、CH0-K1细胞(ATCCCCL61)、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3(ATCCCRL1658)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、C0S-1细胞(ATCCCRL1650)、C0S-7细胞(ATCCCRL1651)、HaCaT细胞、HeLa细胞(ATCCCCL2)、HeLaS3细胞(ATCCCCL2.2),HepG2细胞(ATCCHB8065)、HL-60细胞(ATCCCCL240)、HUV-EC-C细胞(ATCCCRL1730)、Jurkat细胞(ATCCTIB152)、K-562细胞(ATCCCCL243)、L6细胞(ATCCCRL1458)、MCF7细胞(ATCCHTP22)、MDCK细胞(ATCCCCL34)、NIH/3T3细胞(ATCCCRL1658)、RAW264.7细胞(ATCCTIB71)、RBL-1细胞(ATCCCRL1378)、SH-SY5Y细胞(ATCCCRL2266)、U-937细胞(ATCCCRL1593.2)和类似的真核组织培养细胞系。17.权利要求10的方法，其中所述药剂选自化学化合物、天然产物、寡核苷酸、肽和抗体。全文摘要本发明提供鉴定调变蛋白质活性的药剂的方法，其中所述蛋白质由SEQIDNO1的氨基酸序列表示或与SEQIDNO1具有至少90％的氨基酸序列相同性并转运氯离子通过细胞膜，所述方法包括(a)将表达所述蛋白质的细胞暴露于所述药剂；和(b)测量所述暴露细胞内氯离子转运的程度，其中与表达所述蛋白质但不暴露于所述药剂的对照细胞相比，氯离子转运程度的改变表明药剂能够调变所述蛋白质的活性。通过本方法所鉴定的药剂可用于预防或治疗由钙活化型氯通道功能异常所导致的各种疾病。文档编号C12N15/06GK101868539SQ200880111888公开日2010年10月20日申请日期2008年10月17日优先权日2007年10月18日发明者具在妍,卓民镐,吴禹泽,张溶祐,曹始永,梁泳德,赵荷媛,郑然守申请人:Seoul大学校产学协力团