一种重组植物病毒的物理灭活方法

专利名称：一种重组植物病毒的物理灭活方法
技术领域：
本发明涉及一种重组植物病毒的物理灭活方法。
背景技术：
目前，重组植物病毒的灭活方法很多，包括加热法、巴斯德灭菌法、辐射法、光 化学法和紫外光照射法等，除了这些物理方法外，还有很多化学试剂作用的方法，这 些化学试剂包括碘、臭氧、表面活性剂、氮丙啶、甲醛、e-丙内酯和光敏复合物等， 但都存在适用范围的局限性，例如有些化学试剂属于致癌物质，对人体有害。紫外 线也具有一定灭活作用，它能导致病毒多核苷酸形成二聚体，从而抑制其复制。但经 紫外线照射的病毒具有在可见光照射下重新复性的可能。光化学灭活方法中，不同的 光敏剂具有不同的耙目标。如亚甲基蓝(methylene Wue,MB)和苯胺蓝(toluidineblue) 既可与病毒核酸作用，同时也可与病毒包膜上的脂质和蛋白质结合。所以这种方法可 能对重组病毒的外源小肽产生影响。而6()0^射线被认为可以灭活所有类型的病毒， 所以，植物病毒也不例外。但到目前为止，6GQ)y射线用于植物病毒的灭活还未有相 关报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种重组植物病毒的物理灭活方法，在对外源小肽不破坏 或破坏很小的前提下，解决潜在生物安全性隐患。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种重组植物病毒的物理灭活方法，其特征在于采用6()C0y射线对重组植物病毒
进行辐照灭活。
上述的重组植物病毒配制成浓度不大于20pg4d的病毒溶液，所用的6()0)丫射线的 辐照剂量范围为14kGy 30kGy，温度为4±0. 5°C。 上所述的重组植物病毒为重组烟草花叶病毒。
上述的重组烟草花叶病毒是采用外源展示法，将外源蛋白插入到烟草花叶病毒外 壳蛋白CP的羧基末端，与CP形成融合蛋白，而形成的重组烟草花叶病毒。
上述的重组烟草花叶病毒是在CP蛋白第152 158位氨基酸之间，插入外源小肽。 上述的灭活方法，在高效灭活重组病毒粒子的前提下，对重组病毒外源多肽的后
续利用无影响。


图l.不同剂量率，OY射线灭活后的TMVS1241稀释成lpg/nl的浓度，分别接种抗 性烟草，三天后接种叶片的症状。枯斑消失说明病毒已灭活。
图2.不同剂量率MCoY射线灭活后的TMVS1241与未灭活的TMVS1241接种抗性烟草 后，枯斑比例分析图。枯斑比值越小，说明病毒粒子的相对侵染力越小，病毒灭活效 果越好。
图3.不同剂量率，OY射线灭活的TMVS1241稀释成l pg尔l的浓度分别接种敏感烟
草，接种两周后烟草新叶的症状。花叶症状消失说明病毒己灭活。
图4.不同剂量率⑨CoY射线灭活的TMVS1241接种敏感烟草三周后，对新叶总RNA进
行RT-PCR检测，弓l物分别为Pst(-)和Acc2(+)。若检测不到重组病毒基因组条带，说
明病毒己灭活。
M:lKb DNA marker
lanel:正对照(以pTMV为模板)
lane 2:正对照(以pTMVS1241为模板)
lane3:负对照(以1120为模板)
lane 4:MOCK(健康烟草新叶)
lane 5:0kGy剂量辐照后TMVS1241
lane 6:4kGy剂量辐照后TMVS1241
lane 7:6kGy剂量辐照后TMVS1241
lane 8:8kGy剂量辐照后TMVS1241
lane 9:10kGy剂量辐照后TMVS1241
lane 10:12kGy剂量辐照后TMVS1241
lane 11:14kGy剂量辐照后TMVS1241
lane 12:16kGy剂量辐照后TMVS1241
lane 13:18kGy剂量辐照后TMVS1241
lane 14:20kGy剂量辐照后TMVS1241
lane 15:30kGy剂量辐照后TMVS1241
图5.不同剂量率^CoY射线灭活的TMVS1241接种敏感烟草三周后，对新叶总蛋白进 行SDS-PAGE检测。若检测不到病毒CP特征性条带，说明病毒已灭活。
M:MOCK (健康烟草) lane 1:野生型TMV lane 2:0kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 3:4kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 4:6kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 5:8kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 6:10kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 7:12kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 8:14kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 9:16kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 10:18kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 11:20kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 12:30kGy剂量辐照后TMVS1241 lane 13:TMVS1241
图6.盲传三代结果14、 16、 18、 20和30kGy五个剂量率灭活后的TMVS1241盲传三 代后，敏感烟草症状图。若无花叶症状，说明病毒已彻底灭活。 图7.重组病毒粒子灭活后，外源小肽稳定性及抗原性分析。
A:灭活后的病毒粒子SDS-PAGE分析。融合CP未出现降解条带，说明重组TMV 病毒表达的外源小肽的完整性未受影响。
B:灭活后的病毒粒子Western blot分析结果。融合CP未出现降解条带，说明重组
TMV病毒表达的外源小肽抗原性未受影响。
lanel: TMV-S1241感染敏感烟草后，新叶总蛋白
lane 2:未经任何辐照处理的TMVS1241
lane 3: 14kGy剂量辐照后的TMVS1241
lane 4: 16kGy剂量辐照后的TMVS1241
lane 5: 18kGy剂量辐照后的TMVS1241
lane 6: 20kGy剂量辐照后的TMVS1241
lane 7: 30kGy剂量辐照后的TMVS1241
同现有技术相比，本发明方法具有如下显而易见的优点①本发明方法灭活效果 明显，灭活效率高。②本发明使用的灭活方法对目的蛋白破坏作用很小，在对融合蛋
白不破坏或破坏很小，不影响目的蛋白抗原活性的前提下，可高效灭活重组粒子。③ 对重组病毒外源小肽的后续利用无影响。④本发明方法具有快捷、有效、低成本的特 点。⑤本发明方法操作简单，无后续残留及污染，对人体及环境均无害。
具体实施例方式
本发明中所说的敏感烟草为野生型TMV可系统感染的烟草品种7WcoZ/a"" to6acww cv. Samsunnn。抗性烟草为野生型TMV接种后引起枯斑的烟草品种iV/co"a"a totocwwcv. SamsunNN。下面实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一
本实施例采用的外源蛋白S1241是一段长为12个氨基酸的小肽，来自于SARS 病毒S蛋白中一段预测可能的抗原决定簇，即1241至1252位的12个氨基酸。将其 插入到TMV CP蛋白的第152 153位氨基酸之间，之后加入一个终止密码子TAG, 与CP形成融合蛋白，而形成重组烟草花叶病毒TMVS1241。插入的氨基酸序列及对其 进行编码的核苷酸序列具体如下
氨基酸序列DDSEPVLKGVKL 核苷酸序列5,-GACGACTCTGAGCCTGTTCTAAAGGGTGTTAAATTA-3，。
一、 重组病毒TMVS1241粒子的制备
1. 重组病毒TMVS1241的构建按李巧丽等所述方法构建(TMV recombinants encoding fused foreign transmembrane domains to the CP subunit caused local necrotic response on susceptible tobacco, Qiaoli Li, Mangmang Li, Lubin Jiang, Qingqi Zhang, Rentao Song, Zhengkai Xu(2006)， Virology 348:253 - 259
2. 重组烟草花叶病毒TMVS1241粒子的提取
重组病毒TMVS1241感染烟草2—4周后，收取叶片后低温研磨，低速离心去除 杂质，以PEG沉淀。沉淀溶解后再经低速离心，去除沉淀杂质，上清再以PEG重复 沉淀，即可获得高纯度的重组病毒粒子(参照D. NOORDAM(1973) Identification of plant virus.的方法)。
二、 ^CoY射线辐照处理TMVS1241病毒溶液
1.将提取的TMVS1241病毒溶液用水或病毒储存液(lOmM磷酸缓冲液，pH 7.0)
稀释为20 Ug/Ul;
2.用^CoY射线对上述TMVS1241病毒溶液进行辐照灭活实验，剂量率为2.7kGy/hr， 温度4'C。
(1) 6()0/射线分别设定不同的剂量点0、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20和 30kGy。
(2) 提取的病毒粒子TMVS1241浓度稀释成20ng^1。准备三组，每组11管。与相 应剂量点一一对应。
(3) 重组病毒TMVS1241每个剂量点辐照灭活。 实施例二重组病毒TMVS1241安全检测试验
1.在抗性烟草上检测重组病毒TMVS1241的浸染性
将上述不同剂量率MCoY射线灭活的TMVS1241稀释成l pg/W的浓度，混以少 量金刚砂，采用机械磨擦法接种抗性烟草，观察接种叶片出现枯斑症状的情况。实验 结果显示，当^CoY射线剂量率大于14kGy (包括14kGy)辐照的TMVS1241接种的 抗性烟草接种叶未出现枯斑，说明重组病毒不能够感染烟草，已成功灭活，见图l。
2. 通过枯斑法检验重组病毒TMVS1241灭活前后的相对侵染力
将灭活前后的病毒粒子稀释至相同浓度lpg4U。同一张抗性烟草叶片，半张接种 未灭活病毒粒子，另半张接种灭活后病毒粒子。等接种叶片出现枯斑后，统计灭活前 后重组TMV引起的枯斑数比值，枯斑比值越小，说明病毒粒子的相对侵染力越小， 病毒灭活效果越好。实验结果显示，当^CoY射线剂量大于14kGy (包括14kGy)，枯 斑数比值为0，说明重组病毒TMVS1241已经成功灭活，见图2及表1。
表l.不同剂量6()0) Y射线灭活的TMVS1241与未灭活的TMVS1241半叶法接种 抗性烟草后，枯斑比例数据分析表
不同剂量灭活后重1号2号3号4号5号6号枯斑比枯斑比
组TMV引起的枯斑植株植株植株植株植株植株例平均例标准
数/未灭活重组值差
TMV引起的枯斑数
4k/0k0.670.260.650.310.740.430.510.20
6k/0k0.360.400330.350.230.080.290.12
8k/0k0.270.310.200.140.250.200.230.06
10k/0k0.020.070.010.060.210.100.080.07
12k/0k0.010.020.020.010.030.030.020.01
14k/0k00000000
16k/0k00000000
18k/0k00000000
20k/0k00000000
30k/0k00000000
3. 在敏感烟草上检测重组病毒TMVS1241的浸染性
将上述不同剂量^Coy射线灭活的TMVS1241稀释成l pg"l的浓度，接种敏感烟 草。接种两周后，观察烟草新叶症状。实验结果显示，当^CoY射线剂量大于14kGy (包括14kGy)，灭活的TMVS1241接种的敏感烟草，两周后未出现任何症状，说明重 组病毒已灭活，不能够感染烟草，见图3。 4.利用反转录PCR(RT-PCR)检测重组病毒TMVS1241基因组。
灭活后TMVS1241接种敏感烟草两到三周后，提取新生叶总RNA。以引物Pst(-): 5' ACGTCTGC AGACTGGGCCCCTACCGGGGGTAA3 '反转录。以反转录产物为模板， 以引物Pst(-)和弓I物Acc2(+): 5 ，TAGAGTAGACGACGCAACGGTGGCCATAA3'进行 PCR扩增，退火温度55'C， 25个循环。产物应为517bp大小的片段。
实验结果显示，当6QCoY射线剂量点大于14kGy(包括14kGy)辐照的TMVS1241 接种的敏感烟草新叶未检测到重组病毒基因组的存在，说明重组病毒未感染烟草，己 成功灭活，见图4。
5. 利用SDS-PAGE方法，检测重组病毒的融合CP蛋白。
灭活后TMVS1241接种敏感烟草两到三周后，提取新生叶片总蛋白，进行变性蛋 白电泳(SDS-PAGE)，经考马斯亮蓝染色后检测。实验结果如图5所示，当^CoY射线 剂量率大于14kGy (包括14kGy)灭活的TMVS1241接种的敏感烟草新叶，未检测到 病毒CP蛋白的存在，说明重组病毒未感染烟草，已成功灭活。
6. 盲传三代实验
对第一代(剂量为14、 16、 18、 20和30kGy)灭活病毒接种后，未出现症状的敏 感烟草顶端新生叶，取出部分组织研磨成汁，汁液经105 — 106倍稀释后用于感染第二 组健康烟草。两周后，均未出现症状，与健康烟草无异。继传第三代，同样未出现花 叶症状，见图6。通过RT-PCR，未检测到病毒基因组的存在；同时蛋白水平上 SDS-PAGE的检测，也未发现重组病毒融合CP蛋白的存在。说明重组病毒已彻底灭活。
实施例三重组病毒SDS-PAGE及Western blot分析
灭活后TMVS1241的总蛋白进行SDS-PAGE电泳。结果如图7A所示，6QCoy射 线灭活后，重组病毒的融合CP未出现降解条带，说明重组TMV病毒表达的外源小 肽的稳定性与完整性未受影响，有利于外源多肽的后期利用。。
以抗外源小肽S1241的兔血清为一抗，碱性磷酸酯酶偶联的羊抗兔IgG为二抗， 进行蛋白免疫杂交(Westernblot)。结果如图7B所示，融合CP仍然可以杂交成功， 且未出现降解条带，说明重组TMV病毒表达的外源小肽不但结构完整，同时仍具有 很好的抗原活性，这对用作疫苗生产之用的一些重组病毒来说尤为重要。
从安全检测试验结果可以得出，重组病毒TMVS1241在经过^CoY射线辐照时，辐 照剂量越大，灭活效率越高。浓度为20pg^1的TMVS1241在辐照剂量为14kGy时， 就已得到了高效灭活，不再具有侵染能力。盲传结果进一步证明，在该辐照剂量照射 下，病毒已完全灭活。同时Westernblot杂交实验结果也显示，以外源小肽S1241特异 性抗体与经灭活处理的TMVS1241粒子进行免疫杂交后，外源小肽S1241不但结构完 整，而且仍具有抗原活性，所以灭活后的重组病毒TMVS1241不仅可以安全的应用于 外源小肽的生产，同时这使得利用外源小肽进一步制备的疫苗，在生物工程方面能得 到更为安全的应用。
这种方法可以广泛应用到以植物病毒TMV为载体生产外源小肽，以及疫苗安全 性生产中，有效解决其潜在的生物安全性隐患。
序列表
<110>上海大学
<120>—种重组植物病毒的物理灭活方法 <160> 2 <210> 1
<211> 29 <212> DNA
<213>人工序列(artificial) <220>
<221 > misc一feature <223> 引物 <400> 1
TAGAGTAGAC GACGCAACGG TGGCCATAA 29
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213>人工序列(artificial) <220>
<221> misc一feature <223> 引物
<400> 2
ACGTCTGCAG ACTGGGCCCC TACCGGGGGT AA 3权利要求
1.一种重组植物病毒的物理灭活方法，其特征在于采用60Coγ射线对重组植物病毒进行辐照灭活。
2. 根据权利要求1所述的一种重组植物病毒的物理灭活方法，其特征在于所述的重组植物病毒配制成浓度不大于20吗4U的病毒溶液，所用的6QCoy射线的辐照剂量 范围为14kGy 30kGy，温度为4±0. 5°C。
3. 根据权利要求1或2所述的一种重组植物病毒的物理灭活方法，其特征在于所述 的重组植物病毒为重组烟草花叶病毒。
4. 根据权利要求3所述的一种重组植物病毒的物理灭活方法，其特征在于所述的重组烟草花叶病毒是采用外源展示法，将外源蛋白插入到烟草花叶病毒外壳蛋白 CP的羧基末端，与CP形成融合蛋白，而形成的重组烟草花叶病毒。
5. 根据权利要求4所述的一种重组植物病毒的物理灭活方法，其特征在于所述的重 组烟草花叶病毒是在CP蛋白第152 158位氨基酸之间，插入外源小肽。
6. 根据权利要求1所述的灭活方法，在高效灭活重组病毒粒子的前提下，对重组病 毒外源多肽的后续利用无影响。
全文摘要
本发明涉及一种重组植物病毒的高效物理灭活方法。本发明采用⁶⁰Coγ射线辐照处理重组病毒粒子。本发明的方法操作简单，经济快捷，重复性好，灭活病毒的范围广，在高效灭活重组病毒粒子的前提下，对重组病毒外源多肽的后续利用无影响。
文档编号C12N13/00GK101104846SQ20071010931
公开日2008年1月16日 申请日期2007年5月24日 优先权日2006年5月26日
发明者宋任涛, 慈云青, 朱广文, 平 李, 许政暟 申请人:上海大学