专利名称：：一种干酪乳杆菌在抗氧化作用方面的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种分离自内蒙古民族传统乳制品_一酸马奶中的干酪乳杆菌aactoZ>"c///wscose/Zhang)菌株的制备以及该菌株在抗氧化产品方面的应用。技术背景氧化作用对于许多生命体来说是必须的，它产生的能量用于维持正常的生命活动，然而伴随着氧化作用的进行也会产生一些对生物分子有破坏作用的活性氧，这些活性氧不仅包括以氧为中心的自由基，如02—及OH，也包括一些氧的非自由基衍生物，如&02等，这些活性氧与生物体的衰老及疾病的产生有着密切的关联。体内自由基可引发生物膜中的不饱和脂肪酸的过氧化反应，生成过氧化脂质和丙二醛(Maleicdialdehyde，MDA)等产物。作为机体的抗氧化防御体系可以在一定程度上使这些活性氧失活并修复由其对生物分子产生的破坏。机体的抗氧化防御体系包括酶类及非酶类两大类，前者主要是指超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等；后者则是指一些小分子的有机物质，也称之为体内天然的抗氧化剂，如维生素E、维生素C、辅酶Q、半胱氨酸、谷胱甘肽及微量元素硒(Se)和尿酸(UA)等。然而，由于活性氧是机体不断产生的，所以防御体系并不能完全消除由于新陈代谢和在外界条件刺激下所产生的活性氧。近些年来，各种各样合成的或天然的抗氧化剂被用来帮助人体减轻氧化作用所带来的对机体的破坏，然而合成的抗氧化剂对健康的安全性及其长效性还有许多争议，因此，提供源于天然的抗氧化剂显得更加具有优越性和应用前景。随着人们对乳酸菌更多地认识，发现有些乳酸菌具有调节肠道菌群维持微生态平衡、改善肠道功能、具有降低血清胆固醇浓度、降血压、抗肿瘤、增强免疫力以及抗氧化等益生作用。通过研究人们发现，大多数乳酸菌是通过产生超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)来清除羟自由基和过氧化氢的，同时乳酸菌的无细胞提取物具有清除脂质过氧化物产物MDA的能力，从而起到抗氧化作用；因此，利用乳酸菌的抗氧化活性来达到清除体内有害的脂质过氧化物是一种将疾病的预防融于日常生活的简便而有效的方法。理想的微生态制剂的菌株，应具有以下几个特点(1)必须对宿主无害，不与病原微生物杂交；(2)对胆汁及强酸具有强耐受性；(3)发酵过程中能产生抑菌物质及乳酸等代谢产物；(4)在培养中及在体内容易增殖；(5)加工处理后尚有高生存率；(6)即使混合在饲料中，在室温条件下也能存活很久等。本发明人针对上述课题，以传统发酵乳制品一一酸马奶中分离的乳酸菌为目标菌群，经体外耐酸性试验和胆盐耐受性试验筛选出在肠道环境中生存能力较强的潜在益生菌，并进一步研究了其在抗氧化作用方面的功能和作用。
发明内容本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌菌株，所述干酪乳杆菌(Z^cto6""7/wc""/Zhang)菌株是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株；该菌株已于2006年4月21日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(地址为中国北京市海淀区中关村北一条13号，国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏，保藏号CGMCCNo.1697。本发明的另一目的在于所述干酪乳杆菌在抗氧化作用方面的应用，特别是在发酵乳制品中提高发酵乳的抗氧化作用的应用。本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种干酪乳杆菌，所述干酪乳杆菌aactoto"7/^Zhang)菌株是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCCNo.1697。所述干酪乳杆菌在抗氧化作用方面的应用。所述干酪乳杆菌在发酵乳制品中提高发酵乳的抗氧化作用的应用。图1为本发明乳酸菌的分离、纯化及保存操作流程图；图2为本发明在大鼠肝脏组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活力测定结果示意图；图3为本发明在大鼠红细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活力测定结果示意图；图4为本发明在大鼠肝脏组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定结果示意图；图5为本发明在大鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定结果示意图；图6为本发明在大鼠肝脏组织匀浆中丙二醛(MDA)浓度测定结果示意图；图7为本发明在大鼠血液中丙二醛(MDA)浓度测定结果示意图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，以下实施例仅具有说明性，本发明并不受这些实施例的限制。实施例1:一种干酪乳杆菌，所述干酪乳杆菌(丄acto6a"7/M"a^Zhang)菌株是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCCNo.1697。1.样品的采集和乳杆菌的分离鉴定样品为传统方法制作的酸马奶，样品采集于中国内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗。2.样品中乳杆菌的分离与纯化参见图1，本发明中干酪乳杆菌aacto6ac!7/wscasdZhang)的分离纯化过程如下以内蒙古传统功能性发酵乳一一酸马奶为乳杆菌分离样品，将牧民家庭自然发酵制作的酸马奶，在其发酵容器中充分搅拌后，用带有灭菌吸头的移液器，吸取2mL放入带有胶塞的灭菌小试管(15mmxl50mm)中封口，再吸取lmL放入带螺旋帽并装有灭菌CaC03粉的无菌、容积为2mL的采样瓶中，拧紧螺旋帽作为备用样品。将收集的样品放入冰盒内冷却，间隔一定时间更换冰袋，保持在较低温度下带回实验室并放置于4-C冰箱内，尽快将乳酸菌进行分离。将乳杆菌分离时，用灭菌吸管吸取lmL酸马奶样品接种于10mL灭菌石蕊牛乳培养基中，置于3(TC恒温箱内增菌培养至酸化凝固，在培养基颜色变为粉红时将其取出，用灭菌接种环划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基(日本荣研株式会社制品)上，再放入BBI^gaspak厌氧培养罐中，置于3(TC条件下，培养48h72h。待菌落形成后，用接种环或接种针挑取菌落，接种于TPY液体中，置于3(TC条件下，培养24h48h。待菌株生长良好后，再次划线接种于BL琼脂培养基中，置于30'C条件下，培养24h48h，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性的杆菌暂定为乳杆菌并进一步纯化培养，并采用冷藏、一85'C冻结保存或低温真空冷冻保存。将从酸马奶样品中分离的乳杆菌菌株，经生理生化学试验、乳酸旋光性测定等一系列试验分析鉴定，并将鉴定后的菌株分别制成供试菌液，吸取菌悬液10pL接种于5mLPH值为3.5的MRS液体培养基，置于37'C条件下进行24h培养；同时吸取菌悬液l.OmL与9.0mLPH值为3.0的人工胃液[制备法NaC10.2%、胃蛋白酶(pepsin,sigma)0.35%，用lmol/LHC1调整PH值为3.0后，过滤除菌备用]混合后，置于37-C条件下进行培养，分别在开始(Oh)和3h后取样用BCP琼脂培养基(日本荣研株式会社制品)测定活菌数，并计算菌株存活率。通过以上方法筛选出具有高耐酸性生长和耐胃酸的乳杆菌菌株，并进一步测定其在不同人工胃液和肠液中的存活能力以及通过体外耐胆盐试验和降低胆固醇试验，获得一株干酪乳杆菌aflcto&"7/附case/Zhang)菌株。乳杆菌的鉴定分离纯化的乳杆菌a"ctok^7/uscose/Zhang),经生理生化学特性分析和16SrDNA序列分析的方法鉴定，其微生物学特性如表1所示。表1iacfokzc/〃wscose/Zhang的生物学特性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明的干酪乳杆菌aacto6a"7/wZhang)除了具有一般乳杆菌所具备的对人体健康有益的作用外，该菌株还能用于抗氧化功能性产品的生产，例如具有抗氧化活性的各种乳制品的生产；它既可与其它原料以混合的形式存在于特定的产品中，也可以活菌制剂的形式生产。实施例2:—种如实施例l所述的干酪乳杆菌的应用，所述干酪乳杆菌在抗氧化作用方面的应用；尤其是在发酵乳制品中提高发酵乳的抗氧化作用的应用。本发明的干酪乳杆菌aacto6a"7/MZhang)的耐酸性及其人工胃肠液中的耐受性分析从酸马奶样品中分离鉴定的50株乳杆菌中，经过PH值为3.5的MRS液体培养基中生长试验及在PH值为3.0的人工胃液中的存活率测定，筛选得到1株耐酸性极强的乳杆菌，即干酪乳杆菌aacto^d//wscw"Zhang)。Zactok7c/〃wcose/Zhang菌株经过PH值为3.5的MRS液体培养基中生长试验及在PH值为3.0的人工胃液中的存活率测定，结果见表2。具体步骤将冷冻保存的乳杆菌接种于MRS液体培养基中，置于37"C条件下培养24h，经MRS培养液传代培养23次后，取5mL乳杆菌培养液，经3,000rpm离心lOmin，收集菌体，加入5mL灭菌生理盐水混匀制成菌悬液，吸取菌悬液10^iL接种于5mLPH值为3.5的MRS液体培养基中，置于37'C条件下培养24h，观察其生长情况。耐受PH值为3.0人工胃液[NaC10.2X、胃蛋白酶(p印sin，sigma)0.35%，用INHC1调整PH值为3.0后，过滤除菌备用]的乳杆菌菌株的筛选取上述方法中制备的l.OmL乳杆菌菌体悬液,与9.0mLPH值为3.0的人工胃液混合后，置于37'C条件下培养，分别在开始(0h)和3h后，取样用BCP琼脂培养基(PlateCountAgarwithBromCresolPurple)倾注培养，并测定活菌数。表2Zacto6acWwsmseZZhang在pH3.5及pH3.0人工胃液中生长情况<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表中菌数均为两次实验的平均值。结果显示，本发明的干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiZhang)具有较强的耐性和耐酸生长特性、能够耐受人工胃肠消化液，尤其在脱脂乳液中能够耐受PH值为2.0的人工胃液，能耐受的胆盐浓度达0.6%;由于本发明的干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiZhang)的这种特性，所述干酪乳杆菌在乳制品中的应用有其重要意义；乳酸菌产生的酸性代谢产物使肠道环境偏酸性，而一般消化酶的最适PH值为偏酸性(淀粉酶6.5、糖化酶4.4)，这样就有利于营养素的消化吸收，有机酸的产生还可加强肠道的蠕动和分泌，也可促进消化吸收养分，研究表明食用酸奶的人群对乳糖的利用率比食用含相同乳糖浓度的牛奶要高，从而减轻乳糖的不耐受症状。此外，乳酸菌的抗癌作用也有不少报道。更重要的是，由于对乳酸菌代谢和遗传特性了解的深入以及对其机理的认识，还有大量临床试验的结果证明将其作为保健辅佐剂，饲料添加剂的可行性，人们已经广泛接受了乳酸菌这类保健制品。另外，口服是益生菌进入肠道的主要途径，所以益生素在进入大肠之前必须经受胃中盐酸和小肠中高浓度胆盐的影响，只有在盐酸和胆盐中成活率高的菌株才可发挥作用；同时，产品中稳定的活菌数或者微生态制剂中活菌的数量是其发挥作用的关键，所以，活菌制剂的应用要求单位产品达到一定的活菌数，以符合有效治疗剂量标准。因此，该菌株适用于功能性发酵乳制品的生产、也可作为功能性食品添加剂或保健制剂应用于调节免疫功能的各个方面。应用实施例干酪乳杆菌aacto6a"7/wscose/Zhang)对大鼠肝脏组织及血液中抗氧化酶活性的影响1.实验方法1.1实验菌株制剂的制备将干酪乳杆菌aacto6ac/〃wscos"Zhang)(CGMCCNo.1697)接种于MRS培养液，在37。C条件下培养18h，经离心(3000r/min,lOmin)收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10%灭菌脱脂乳液，并调整其菌数为2.0X109cfu/mL(每毫升样品中含有的细菌群落总数)，混匀后用BCP琼脂培养基倾注培养，计活菌数确认，并将脱脂乳菌悬液分为两等份一份为活菌体脱脂乳液，另一份置于50~55°C条件下自体消化2h后转为在100。C条件下加热10min进行灭活，制成热致死菌体脱脂乳液；将活菌体脱脂乳悬液和热致死菌体悬浮液，按每日使用量分装于冷冻瓶中，置于-85。C的冰柜内保存备用。1.2实验动物体重约为100120g的5周龄雄性Wistar系大白鼠24只，由内蒙古大学实验动物中心提供；大鼠营养饲料，购于内蒙古大学实验动物研究中心饲料室。1.3实验主要试剂盒超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测试盒，丙二醛(MAD)测定试剂盒，以上测定所用试剂盒均由南京建成工程研究所提供。1.4实验动物及分组饲养方式将Wistar系大白鼠购进后，水和营养饲料自由采食饲喂至第7天。在第7天称体重，使每个实验组平均体重约相等。从第8天开始试验组，分别灌喂已制备好的活菌脱脂乳液和热致死菌脱脂乳液2mL/只，分组情况具体如表1所示。各试验组在正式试验后的第28天进行称体重和尾静脉采血，采血前停食过夜。测定大鼠肝脏组织匀浆、红细胞及肝脏匀浆SOD酶活力、肝脏及血清谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和肝脏及血液丙二醛(MAD)含量。表l动物试验分组情况<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1.5实验数据分析与统计应用SPSS12.0系统统计软件对各实验数据进行方差分析和显著性检验。2.结果与分析2.1大鼠肝脏组织匀浆和红细胞SOD活性的测定结果将LZhang分别以活菌制剂和热致死菌体制剂灌服大鼠后第28天，分别测定了其肝脏组织匀浆和红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性。灌服LZhang活菌体制剂的大鼠，其肝脏组织匀浆SOD活力与未灌服乳杆菌制剂的对照组比较明显提高，达到极显著性差异水平(P<0.01)，而热致死菌体组SOD活力虽高于对照组但未呈现显著性差异水平，结果如图2所示。测定红细胞中S0D活力的结果显示，厶case/Zhang活菌体制剂组高于对照组，但尚未达到显著性差异水平，热致死菌体组与对照组无差异，结果如图3所示。2.2大鼠肝脏组织匀浆和血清GSH-Px活力的测定结果给大鼠灌服A.cas"Zhang菌液的两个试验组大鼠肝脏谷胱苷肽过氧化物酶活力有一定的提高，但未达到显著性差异水平，参见图4。另外，灌服case/Zhang活菌液组大鼠血清GSH-Px活力极显著地高于对照组(P〈0.01)，其热致死菌体液组大鼠血清GSH-Px活力也显著提高(P〈0.05)，如图5所示。2.3大鼠肝脏组织匀浆和血液MDA含量测定结果从图6中可知，经灌服丄x"^/Zhang活菌体制剂的大鼠群肝脏组织中丙二醛(MDA)含量明显降低，与对照组比较达到极显著性差异水平(PO.Ol)。但是，热致死菌体制剂灌服大鼠群血液和肝脏组织中MDA含量与对照组无明显差异。由此可见，乳杆菌Z.MM/Zhang活菌制剂对大鼠肝脏组织中抗氧化酶活力有所提高，对降低脂质过氧化物具有一定的作用；但是，Zhang株菌活菌体制剂经热致死处理后丧失对大鼠抗氧化酶活力影响的作用。测定大鼠血液中丙二醛(MDA)浓度结果显示，Z.cfl化/Zhang活菌体制剂组低于对照组，但尚未达到显著性差异水平，热致死菌体组与对照组无差异，结果如图7所示。3.结论干酪乳杆菌丄.cos"Zhang(CGMCCNo.1697)活菌制剂灌服实验大鼠后，能够极显著地提高大鼠肝脏组织匀浆中SOD活力和血清中GSH-Px活力，并显著降低大鼠肝脏组织匀浆中丙二醛(MDA)浓度，从而能有效地起到抗氧化作用。权利要求1、一种干酪乳杆菌，其特征在于所述干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiZhang)菌株是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCCNo.1697。2、一种如权利要求l所述的干酪乳杆菌的应用，其特征在于所述干酪乳杆菌在抗氧化作用方面的应用。3、根据权利要求2所述的干酪乳杆菌的应用，其特征在于所述干酪乳杆菌在发酵乳制品中提高发酵乳的抗氧化作用的应用。全文摘要本发明涉及一种干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiZhang)菌株的制备以及该菌株在抗氧化产品方面的应用。所述干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiZhang)菌株是从内蒙古民族传统乳制品——酸马奶中的干酪乳杆菌分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCCNo.1697。本发明的干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiZhang)除了具有一般乳杆菌所具备的对人体健康有益的作用外，还能用于抗氧化功能性产品的生产，例如具有抗氧化活性的各种乳制品的生产；它既可与其它原料以混合的形式存在于特定的产品中，也可以活菌制剂的形式生产。文档编号C12R1/245GK101333505SQ20071010947公开日2008年12月31日申请日期2007年6月26日优先权日2007年6月26日发明者孟和毕力格,张和平,王俊国申请人:内蒙古农业大学