一种病毒灭活去除纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤制备收率高、效价稳定、低病毒的乌司他丁的制备方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物。
【背景技术】
[0002]乌司他丁(ULinastatin)系从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种酸性糖蛋白，是一种广谱的蛋白酶抑制剂，主要在肝脏中合成，由肾脏代谢随尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。乌司他丁由143个氨基酸组成，相对分子质量约37000~43000，属于蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α -糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用，还具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放、抑制心肌抑制因子(MDF)产生、清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。乌司他丁还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常和肾功能降低，防止手术刺激引起的对内脏器官与细胞的损伤以及改善休克时的循环状态等。
[0003]1909年欧洲首先报道人体尿液存在着胰蛋白酶抑制剂，随后人们发现，当人体受到感染、发热、肿瘤、妊娠、休克、手术、给予糖皮质激素等刺激时，人体尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先开发上市，在日本已作为急性胰腺炎、急性循环衰竭的治疗药物被广泛应用于临床。
[0004]本发明人自2008年开始对UTI的生产工艺进行试验研究，采用现代蛋白质高端生化分离技术进行生产，使UTI的总收率提高到70%以上，总效价不低于5000iu/mg，柱效提高约50%。近期我们组织相关人员进行科研攻关，最终采用低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤来纯化乌司他丁，病毒去除率不低于41og，生产工艺稳定，质量可控。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种病毒灭活去除纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物，是为了攻克高岭土吸附、耐酸性混合模式吸附等传统方法提取乌司他丁收率过低、效价不高不稳定、病毒指标不明的缺点，采用低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤来纯化乌司他丁，从而提高了乌司他丁的收率，保证了效价的稳定及用药安全性。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现:
一种病毒灭活去除纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物，其特征在于:选用采用低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤来纯化乌司他丁，可以使总收率提高到70%以上，总效价不低于5000iu/mg，柱效提高约50%，病毒去除率不低于41og。
[0007]该技术方案中，其技术特征还在于所述方法包括如下步骤:
1)乌司他丁粗加工
称取IT pH小于6.5的澄清尿液，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质吸附完全后用氨水洗脱，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得乌司他丁粗品。
[0008]2)吸附柱层析(以0.25L DEAE树脂柱为例)
2.1)将柱中的DEAE树脂用纯化水反冲下来，装入桶中，用纯化水浸没搅匀，静置，反复多次，纯化水浸没过夜；
2.2)将DEAE树脂滤干，用少量纯化水洗涤，再次滤干后装入桶中，用0.5 mol/L盐酸浸没，搅拌，过滤，用纯化水洗至中性，再用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡，搅拌，过滤，再用纯化水洗至中性；
2.3)将上述经处理过的DEAE树脂加洗脱液A反复平衡到pH6.5后，再用洗脱液A浸泡待用；
2.4)将上述平衡好的树脂装入柱内，柱装好后，再用洗脱液A走柱；
2.5)称取乌司他丁粗品1kg，用洗脱液A溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液，在60 °C水浴搅拌加热10小时；
2.6)将上述离心液流经平衡好的DEAE树脂柱，流速控制在120~130mL/min左右；
2.7)用洗脱液B溶液洗脱，流速控制在120~130mL/min，得洗脱液；
2.8)将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约1.65L。
[0009]3)亲和层析(以0.25L柱体为例)
3.1)用洗脱液C平衡亲和层析柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在120~130mL/min ；
3.2)上样结束后，用洗脱液C洗脱，流速120~130mL/min左右，收集洗脱液；
3.3)柱中的亲和树脂经洗脱液C洗脱后，用洗脱液D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在120~130mL/min，密封待用；
3.4)洗脱液经超滤膜超滤至一定体积，超滤液中加入一定量磷酸氢二钠溶液，继续超滤至同一体积，然后再加入等量磷酸氢二钠溶液，再经超滤膜超滤至相同体积。
[0010]4)沉淀
超滤液中按1:6的比例加入-20°C以下、95%以上的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。
[0011]5)病毒灭活去除
将上述沉淀物用无水乙醇溶解，用稀盐酸调节PH3?6，在18?25°C条件下培育15?30天，切向流超滤，离心。
[0012]6)冻干
将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得乌司他丁。
[0013]经核算，所得乌司他丁总收率高达70%以上，按中国药典所示方法测定，总效价高达5000iu/mg以上，柱效提高约50%，病毒去除率不低于41og。。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
选用病毒灭活去除法纯化乌司他丁，可以更有效的去除乌司他丁中的多种杂蛋白及病毒，并且使其理化性质和生物活性保持稳定，从而使产品的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是，通过工艺的不断改进和完善，使得乌司他丁总收率达到70%以上，总效价不低于5000iu/mg，柱效提高约50%，病毒去除率不低于41og，节约了成本，提高了用药安全性，创造了巨大的经济效益和社会效益。
[0015]
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，而不以任何方式限制。
[0017]实施例1
1)乌司他丁粗加工
称取IT pH 6.0的澄清尿液，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质吸附完全后用氨水洗脱，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得乌司他丁粗品。
[0018]2)吸附柱层析(以0.25L DEAE树脂柱为例)
2.1)将柱中的DEAE树脂用纯化水反冲下来，装入桶中，用纯化水浸没搅匀，静置1小时，倾去上清液及细小颗粒，反复三次，纯化水浸没过夜；
2.2)将DEAE树脂滤干，用少量纯化水洗涤，再次滤干后装入桶中，用0.5 mol/L盐酸浸没，搅拌1小时，过滤，用纯化水洗至中性，再用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡，搅拌1小时，过滤，再用纯化水洗至中性；
2.3)将上述经处理过的DEAE树脂加洗脱液A反复平衡到pH6.5后，再用洗脱液A浸泡待用；
2.4)将上述平衡好的树脂装入柱内，柱装好后，再用洗脱液A走柱；
2.5)称取乌司他丁粗品1kg，用洗脱液A溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液，在60 °C水浴搅拌加热10小时；
2.6)将上述离心液流经平衡好的DEAE树脂柱，流速控制在125mL/min左右；
2.7)用37L的洗脱液B溶液洗脱，流速控制在120mL/min，得洗脱液；
2.8)将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约1.85L。
[0019]3)亲和层析(以0.25L柱体为例)
3.1)用3.5L的洗脱液C平衡亲和层析柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在125mL/min ；
3.2)上样结束后，用12L的洗脱液C洗脱，流速125mL/min左右，收集洗脱液；
3.3)柱中的亲和树脂经洗脱液C洗脱后，用8.0L的洗脱液D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在125mL/min，密封待用；
3.4)洗脱液经超滤膜超滤至190mL，超滤液中加入磷酸氢二钠溶液850mL，继续超滤至190mL，然后再加入850mL磷酸氢二钠溶液，再经超滤膜超滤至190mL。
[0020]4)沉淀