在蛋白纯化过程中灭活病毒的方法

在蛋白纯化过程中灭活病毒的方法
【专利摘要】本发明涉及新的和改良的在蛋白纯化过程期间完成病毒灭活的方法。
【专利说明】在蛋白纯化过程中灭活病毒的方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2012年6月29日提交的美国临时专利申请No. 61/666, 145的优先权， 该申请的完整内容整体援引加入本文。

【技术领域】
[0003] 本发明提供用于在蛋白纯化过程中灭活病毒的在线（in-line)方法。

【背景技术】
[0004] 大规模和经济纯化治疗性蛋白，特别是单克隆抗体对于生物技术工业是日益重要 的问题。通常，蛋白通过细胞培养，利用改造为产生所关注的蛋白如单克隆抗体的哺乳动物 或细菌细胞系产生。然而，一旦产生，必须分离蛋白与各种杂质，如宿主细胞蛋白（HCP)、内 毒素、病毒、DNA等。
[0005] 在典型的纯化过程中，一旦在细胞培养中表达所关注的蛋白，则将细胞培养进料 进行澄清步骤以除去细胞碎片。然后将包含所关注蛋白的澄清细胞培养进料进行一个或多 个色谱步骤，其可以包括亲和色谱步骤或阳离子交换色谱步骤。为了确保所关注蛋白的安 全性，特别是在治疗性候选物的情况下，必须在纯化过程中灭活可能存在于包含所关注蛋 白的样品中的任何病毒。通常，病毒灭活在色谱步骤之后进行（例如，亲和色谱之后或阳离 子交换色谱之后）。通常，在大规模方法中，在色谱步骤之后，在大罐或存储罐中收集包含所 关注蛋白的洗脱混合物，然后进行病毒灭活步骤/过程，进行延长的时间段同时混合，这可 以持续数小时至一天或者更长，以实现可能存在于洗脱混合物中的任何病毒的完全灭活。
[0006] 本领域中已知一些病毒灭活技术，包括温度、pH、辐射和暴露于某些化学物质。


【发明内容】

[0007] 本发明提供在蛋白纯化过程中灭活病毒的方法，所述方法相对于目前工业上在蛋 白纯化期间使用的方法具有若干优势。特别地，本文所述的方法在蛋白纯化过程中无需 使用大罐或存储罐来进行病毒灭活步骤，减少病毒灭活所需的整体时间以及在蛋白纯化 过程中运行病毒灭活操作所需的整体物理空间，这又减少整个纯化过程的整体占用空间 (footprint)〇
[0008] 在一些实施方案中，本发明提供一种用于在纯化过程中灭活样品中的一种或多种 病毒的方法，其中所述方法包括在所述样品从第一单元操作流向第二单元操作时，连续地 将所述样品与一种或多种病毒灭活剂混合。
[0009] 在一些实施方案中，所述第一单元操作包括结合和洗脱色谱，并且所述第二单元 操作包括流过（flow-through)纯化过程。示例性结合和洗脱色谱单元操作包括但不限于 A蛋白亲和色谱。
[0010] 在一些实施方案中，所述流过纯化过程包括两种或更多种选自以下的基质：活性 炭、阴离子交换色谱介质、阳离子交换色谱介质和病毒过滤介质。
[0011] 在一些实施方案中，所述样品包含A蛋白洗脱物，所述洗脱物包含靶分子。示例性 的革巴分子包括例如抗体。
[0012] 在一些实施方案中，利用一个或多个在线静态混合器将所述样品与一种或多种病 毒灭活剂混合。在其他实施方案中，利用一个或多个缓冲罐将所述样品与一种或多种病毒 灭活剂混合。当时使用静态混合器时，样品流在层流范围。
[0013] 在一些实施方案中，一种或多种病毒灭活剂选自酸、盐、溶剂和去污剂。
[0014] 在一些实施方案中，本发明提供一种在A蛋白洗脱物中灭活一种或多种病毒的方 法，其中所述方法包括利用在线静态混合器将所述洗脱物与一种或多种病毒灭活剂混合， 其中在小于10分钟或小于5分钟或小于2分钟或小于1分钟内完成完全的病毒灭活。
[0015] 在其他实施方案中，本发明提供一种在A蛋白洗脱物中灭活一种或多种病毒的方 法，其中所述方法包括利用缓冲罐将所述洗脱物与一种或多种病毒灭活剂混合，其中在小 于1小时或小于30分钟内完成完全的病毒灭活。
[0016] 在一些实施方案中，本发明提供一种用于灭活一种或多种病毒的方法，所述方法 包括（a)将包含靶蛋白（如抗体）的样品进行A蛋白亲和色谱过程，从而获得洗脱物；和 (b)将所述洗脱物连续转移至在线静态混合器以将所述洗脱物与一种或多种病毒灭活剂混 合等于或小于10分钟的时间段，从而灭活一种或多种病毒。
[0017] 在一些实施方案中，进行本文所述的病毒灭活方法的A蛋白洗脱物在以分批模式 进行的A蛋白亲和色谱过程后获得。在其他实施方案中，A蛋白亲和色谱过程以连续模式 进行。在一些实施方案中，连续模式包括连续多柱色谱过程。
[0018] 在一些实施方案中，一种或多种病毒灭活剂酸用于进行溶液改变。
[0019] 在一些实施方案中，在病毒灭活后，将洗脱物连续转移至流过纯化过程步骤，从而 来自静态混合器的产出直接流入流过纯化步骤，其可以包括使用两种或更多种选自以下的 基质：活性炭、阴离子交换介质、阳离子交换介质和病毒过滤介质。
[0020] 在其他实施方案中，在病毒灭活后，在进行下一单元操作或过程步骤之前，例如流 过纯化过程步骤或阳离子结合和洗脱色谱步骤，将洗脱物在混合或存储罐中存储延长的时 间段（例如，12-24小时或过夜）。
[0021] 在本文所述的一些实施方案中，本文所述的病毒灭活方法是更大的蛋白纯化过程 的一部分，所述纯化过程可以包括若干步骤，包括但不限于例如在生物反应器中培养表达 蛋白的细胞；将细胞培养物进行澄清，其可以使用沉淀、离心和/或深层过滤中的一种或多 种；将澄清的细胞培养物转移至结合和洗脱色谱捕获步骤（例如A蛋白亲和色谱）；将A蛋 白洗脱物进行本文所述的病毒灭活方法；将病毒灭活的产物进行流过纯化过程，其使用两 种或更多种选自以下的介质：活性炭、阴离子交换色谱介质、阳离子交换色谱介质和病毒过 滤介质；以及利用渗滤/浓缩和无菌过滤在流过过程中配制来自流过纯化步骤的蛋白。这 些过程的额外细节可以参见例如同时提交的共同待决申请no. P12/107,其整体内容援引加 入本文。
[0022] 在一些实施方案中，如上文所述，流体样品连续地从一个步骤至下一个步骤流过 整个过程。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1是使用两个在线静态混合器的病毒灭活的实验设定的流程示意图。所示的设 定包括（a)用于样品进料的蠕动泵，（b)用于递送酸和碱的两个注射泵，（c)两个在线pH探 针，以及（d)两个静态混合器。基于要实现期望pH所需的酸/碱的量以分批模式预定流速。 通过在每个静态混合器之后和在PH探针之前具有合适直径和长度的管来改变病毒灭活的 停留时间。

【具体实施方式】
[0024] 生物制药要求灭活或除去病毒（来自源自动物的成分，包括哺乳动物细胞）以保 证药物安全并满足食品和药品监督管理局（FDA)所列的标准。典型的过程包括一些病毒清 理步骤，其累积地提供必需的保护。
[0025] 工业中使用的一些方法包括将包含靶蛋白的溶液滴定至低pH，以便引起任何包装 的病毒和病毒组分的破坏。一般来说，包含靶蛋白的样品必须在这些条件下保持延长的时 间，因为病毒灭活需要时间，而且更重要的是确保均匀混合以有效病毒灭活。因此，在大规 模方法的情况下，包含靶蛋白的样品必须在低PH下温育延长的时间，以便常用混合促进有 效的病毒灭活。参见例如，Shukla et al.，J. Chromatography B·，848 (2007) 28-39,其描述 利用将蛋白样品在低pH下温育合适的时间来进行病毒灭活。
[0026] 建立pH条件作为足以引起灭活的低pH值与避免靶蛋白变性的足够高的值之 间的平衡。此外，必须将样品暴露一定量的时间以引起病毒活性值的足够减少，通常 2-6LRV(参见例如，Miesegaes et al.，"Analysis of viral clearance unit operations for monoclonal antibodies,，'Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, pg 238-246(2010))〇
[0027] 据认为对于病毒灭活重要的3个参数是pH值、暴露时间和温度，假设存在均匀混 合。在大规模方法的情况下，由于大体积以及额外的参数，例如混合速率和质量转移，混合 提出了挑战，也变得重要。
[0028] 在包含Fc区的蛋白（例如，单克隆抗体）的情况下，通常在从结合和洗脱色谱加 工步骤（例如，A蛋白亲和色谱或阳离子交换色谱）洗脱之后进行病毒灭活，因为洗脱混合 物的pH更接近病毒灭活的可取pH。例如，在现在工业中使用的方法中，A蛋白色谱洗脱混 合物通常具有3. 5-4. 0范围中的pH，而阳离子交换结合和洗脱色谱洗脱混合物通常具有约 5. 0 的 pH。
[0029] 在现在工业中使用的大多数方法中，将包含靶蛋白的洗脱混合物调整至病毒灭活 期望的PH并维持一段时间，已显示pH和时间的组合导致病毒灭活。较长的时间对于病毒 灭活更有效，特别是在大规模方法的情况下，但是，还已知较长时间引起蛋白破坏。延长暴 露于低PH可以导致沉淀和形成聚集体，这是不期望的，并且常需要使用深层滤器和/或无 菌滤器以去除这类沉淀和聚集体。
[0030] 除了低pH诱导的产物质量问题，在汇集罐（pool tank)中搅拌也可以引起聚集。 适当混合是必要的，以便使蛋白混合物（pool)均质化，并且当需要用酸/碱或缓冲液处 理蛋白溶液以调整pH和/或电导率时在制备期间特别重要（参见例如，Vdzquez-Rey et al.，"Aggregates in monoclonal antibody manufacturing processes, biotechnology and Bioengineering, Vol 108, Issue 7, pages 1494 - 1508(2011))。
[0031] 一些研究已证实由于单独搅拌的剪切可能不引起蛋白聚集，但是可能通 过在气-液界面的存在下搅拌而促进（参见，例如，Mahler et al.，"Protein aggregation:Pathways, induction factors and analysis, ^J. Pharm. Sci. 98(9) :2909 -2934 (2009), Harrison et al. , "Stability of a single-chain Fv antibody fragment when exposed to a high shear environment combined with air - liquid interfaces, " Biotechnol. Bioeng. 59:517 - 519 (1998))。例如，上述研究已证实在未完全 装满的容器中搅拌蛋白时单链Fv抗体片段丧失活性的结果。此外，这些研究证实在发酵液 中消泡剂的存在下，在发酵液中蛋白活性未丧失。但是，添加消泡剂可能不是理想的解决方 案，特别是因为它会为纯化方法增加额外的纯化步骤和加工时间。
[0032] 本发明提供新的和改良的在蛋白纯化过程中灭活病毒（在本文中也称作"VI"）的 方法，其减少病毒灭活的总时间、成本以及与蛋白纯化过程相关的总物理空间。
[0033] 本文所述的方法能够以连续方式完成病毒灭活，相对于最常规的方法，这显著减 少与病毒灭活相关的时间，转而减少总纯化过程的时间。
[0034] 在本文所述的一些实施方案中，本发明的方法采用一个或多个在线静态混合器来 完成病毒灭活。在其他实施方案中，本发明的方法采用一个或多个缓冲罐来完成病毒灭活。 本文所述的方法促使整个纯化过程以连续方式运行，即包含靶蛋白的样品可以连续地从一 个加工步骤（或单元操作）流至下一个加工步骤（或单元操作），不需要在加工步骤之后停 止样品的流动。因此，在本发明的一些实施方案中，利用静态混合器可以使来自上游结合和 洗脱色谱加工步骤（例如，A蛋白亲和色谱或阳离子交换色谱）的洗脱混合物进行在线病 毒灭活，并且样品连续地流入下一加工步骤（例如，流过纯化加工步骤）。因此，不像常规方 法，在移至纯化过程中的下一加工步骤之前，洗脱混合物不必与病毒灭活剂在汇集罐或容 器中混合或温育延长的时间。
[0035] 值得注意的是，已描述静态混合器用于在其暴露于辐射时混合样品以灭活病原体 (参见例如，美国公开第20040131497号和PCT公开第W02002092806号），或者利用静态混 合器混合血液样品与病毒灭活剂（参见例如，PCT公开第W02004058046号）；但是，看来本 领域没有在蛋白纯化过程期间，在样品从一个单元操作流至另一个单元操作时使用静态混 合器完成病毒灭活的教导或提示。
[0036] 本文所述的方法提供优于现在工业中使用的常规方法的几个优势，一些在下文中 描述。
[0037] 本文所述的病毒灭活方法能够在比最常规的方法更少的时间内实现更有效的包 含靶蛋白的样品与合适的病毒灭活剂（例如，低pH)的混合。
[0038] 由于较短的加工时间，最小化任何潜在的对靶蛋白质量的不利影响。例如，已证实 延长暴露于低PH条件可以导致影响靶蛋白的质量，例如通过引起蛋白聚集以及其他有害 变化（参见例如，Wang et al. "Antibody structure, instability and formulation,，'J. Pharm. Sci. Vol. 96, pg. 1-26 (2007))。通过具有较短的暴露于可能对产物质量有害的条件 的时间，可以最小化或避免对产物质量的任何损伤。
[0039] 本发明至少部分基于令人惊讶和出人意料的观察，甚至当样品的流动在层流范围 中（例如，缓慢流速）时，仍可以完成有效混合以及有效病毒灭活。具体地，在本文所述的 一些方法的情况下，因为使用在线静态混合器，可以控制样品的流速，从而将流速置于层流 范围中。这允许与较高流速相比更可预测的灭活，这有助于紊流并导致较窄的最佳操作窗 口。这个结果是出人意料的，因为一般来说，需要较高的流速以完成有效混合。
[0040] 在层流范围中操作的过程可以更好地控制，因为混合不依赖于紊流的存在。例如， 如果上游流动条件要求流速减少，则在线混合过程可能落在紊流区域（regime)外并丧失 一些混合效率。但是，如果效率受整个流动范围中存在的层流影响，则效率不会受到影响。
[0041] 本文所述的方法还提供更多对过程参数的控制。换句话说，因为本文所述的方法 提供更多对PH条件的控制，所以它们提供更多对整个过程的控制，并且一般使得能够进行 更稳健的过程。
[0042] 除了上述一些优势，本文所述的方法还导致过程的较小物理空间，例如，通过不需 要使用汇集罐用于病毒灭活。一般来说，对更灵活的制备方法有不断增长的需求，所述方法 通过减少过程的总物理空间（即，占地面积）来提高效率。本文所述的方法通过用比汇集 罐小得多的在线静态混合器或缓冲罐代替通常用于病毒灭活的大汇集罐，能够减少纯化方 法的总空间。
[0043] 本文所述的方法使得消除纯化方法中的整个单元操作。例如，如上文所述，一般来 说，在大汇集罐中进行病毒灭活。在大多数常规方法中，将来自上游结合和洗脱色谱步骤 的洗脱物收集在常常没有任何混合能力的汇集罐中。因此，必须将样品（即，洗脱混合物） 转移至具有混合能力的适当汇集罐。然后将PH调整至期望的值，随后在期望的pH值下温 育1-2小时或更长。混合之后，必须将pH再次调整至适合下一加工步骤的pH，其通常是比 用于病毒灭活更高的pH。在使样品进行随后的步骤之前，一个（无菌）或两个（深层和无 菌）过滤步骤还可以用来从病毒灭活样品去除任何混浊。通常，这些步骤中的每一个可以 进行一天，并且构成整个分离单元操作。
[0044] 在一些实施方案中，较短的暴露导致较少或没有混浊，因此不需要随后的过滤步 骤。本文所述的方法通过消除包括使用汇集罐用于病毒灭活的整个单元操作，显著简化常 规纯化方法。
[0045] 本文所述的方法提供更容易的可扩展性。扩大分批汇集罐系统包括增加稳定时 间以及基于深层混合系统（例如，叶轮）的混合效率。例如，如果汇集罐体积增加10倍， 则混合效率必须增加10倍以保持相同的混合时间。同样，混合时间应当最小化以保护蛋 白，同时应当最大化以完成一定的LRV灭活。在许多情况下，因为叶轮大小和可用电机RPM 的限制，混合器不可以放大至相等的混合效率。本发明显著增加混合效率并提供基于称为 Reynolds数（Re)的无量纲数的可扩展性，其取决于包括在线静态混合器的管道或连接管 的面积、流速、液体密度和粘度。Reynolds数定义为密度X静态混合器直径X流速比粘度的 比例。可以通过增加静态混合器的混合元件的数量来提高混合效率。更好的可扩展性和更 多的预测性能将过程参数减少至仅PH和时间，并且消除对混合成功效率的依赖性。
[0046] 如本文所述，在线静态混合允许在非常短的时间内改变溶液，从而消除许多稳定 时间。这允许压缩整个过程，并且导致为了放大和设计目的合理的工作体积。通过T-阀或 歧管系统将病毒灭活流体引入主流可以改变样品流体的特性。一旦流体处于新的期望条件 中，可以通过增加管的长度或直径或这两者来增加在静态混合器之后的管中的停留时间， 保证需要的在灭活pH下的停留时间。在需要的停留时间结束时，可以进行第二修改以使流 体回到对于蛋白和下一加工步骤期望的条件。
[0047] 如本文更详细描述的，本文所述的病毒灭活方法促进以连续方式运行的纯化方 法。
[0048] 为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。额外的定义在整个详细说明 书中示出。
[0049] I.定义
[0050] 如本文所用，术语"静态混合器"指用于混合两种流体材料的装置，所述流体材料 通常为液体（例如，包含靶蛋白的样品或者来自结合和洗脱色谱加工步骤的洗脱物）。所述 装置通常包括圆柱形（管）外罩中包含的混合器元件（也称作非移动元件）。总系统设计 并入将两个液流递送入静态混合器的方法。当流通过混合器时，静态混合器的非移动元件 连续混合材料。完全混合取决于许多变量，包括流体的特性、管的内径、混合器元件的数量 和它们的设计。在本文所述的各种实施方案，在线使用静态混合器。
[0051] 术语"在线"或"在线操作"指移动液体样品通过管或一些其他导管而不在容器中 储存的过程。因此，在本发明的一些实施方案中，在管中的"在线操作"中使用静态混合器， 通过所述管，包含靶蛋白的液体样品从一个加工步骤移动至另一个加工步骤。
[0052] 术语"病毒灭活"或"VI"指以这样的方式处理包含一种或多种病毒的样品：所述 一种或多种病毒不再能复制或被失活。病毒灭活可以通过物理方式完成，例如加热、紫外 线、超声振动，或者利用化学方式，例如PH改变或添加化学物质。病毒灭活通常是在大多数 蛋白纯化方法中使用的加工步骤，特别是在纯化治疗性蛋白的情况下。在本文所述的方法 中，利用一个或多个在线静态混合器或缓冲罐进行VI。应当理解，利用本领域已知的标准测 定和本文所述的那些测定不能检测样品中的一种或多种病毒是在用一种或多种病毒灭活 剂处理样品之后，所述一种或多种病毒完全灭活的指示。
[0053] 术语"病毒灭活剂（virus inactivating agent) "或"病毒灭活剂（virus inactivating agent) "指能够使得一种或多种病毒失活或不能复制的任何物理或化学方 式。在本文所述的方法中使用时，病毒灭活剂可以包括溶液条件改变（例如，pH、电导率、温 度等）或者添加溶剂/去污剂、盐、聚合物、小分子、药物分子或任何其他合适的实体等，其 与样品中的一种或多种病毒相互作用，或者物理方式（例如，暴露于UV、震动等），从而暴露 于病毒灭活剂使得一种或多种病毒失活或不能复制。在一具体实施方案中，病毒灭活剂为 PH改变，其中利用在线静态混合器或缓冲罐将病毒灭活剂与包含靶分子的样品（例如，来 自A蛋白结合和洗脱色谱步骤的洗脱物）混合。
[0054] 术语"病毒去除"指处理包含病毒的溶液，从而从所述溶液去除病毒。病毒去除可 以通过筛分（例如利用具有适当孔径的纳米滤膜）或通过吸附（例如利用具有与病毒相反 电荷的介质的色谱装置）来进行。
[0055] 术语"紊流"指流体的移动，其中流体中的潜流表现紊乱，以不规则模式移动，但整 体流动是在一个方向。紊流在高速移动的非粘性流体中常见。
[0056] 术语"层流"指平滑、有序的流体移动，其中没有紊流，并且任何给定潜流或多或少 与任何其他附近的潜流平行移动。层流在粘性流体中常见，特别是低速移动的那些粘性流 体。在本文所述方法的一些实施方案中，采用层流。
[0057] 如本文所用，术语"汇集罐"指任何容器、器皿、贮液器、罐或袋，其在加工步骤之间 使用，并且具有的大小/体积使得能够收集来自加工步骤的整个体积的产出。汇集罐可以 用于盛放或储存或操作来自加工步骤的整个体积的产出的溶液条件。在本发明的各种实施 方案中，本文所述的方法避免需要使用一个或多个汇集罐。
[0058] 在一些实施方案中，本文所述的方法可以使用一个或多个缓冲罐。
[0059] 如本文所用，术语"缓冲罐"指在加工步骤之间使用的任何容器或器皿或袋；其中 来自加工步骤的产出流过缓冲罐至纯化方法中的下一加工步骤。因此，缓冲罐不同于汇集 罐，其并不意图盛放或收集来自加工步骤的整个体积的产出；而是取而代之使得来自一个 加工步骤的产出能够连续流至下一步。在一些实施方案中，在本文所述方法的两个加工步 骤之间使用的缓冲罐的体积不超过来自加工步骤的产出的整个体积的25%。在另一实施 方案中，缓冲罐的体积不超过来自加工步骤的产出的整个体积的10%。在一些其他实施方 案中，缓冲罐的体积少于生物反应器中细胞培养物的整个体积的35 %、或者少于30 %、或 者少于25%、或者少于20%、或者少于15%、或者少于10%，所述生物反应器中的细胞培养 物构成纯化靶分子的起始材料。在一些实施方案中，如本文所述，病毒灭活通过缓冲罐来完 成，其中缓冲罐用于混合合适的病毒灭活剂与包含靶蛋白的样品（例如，来自A蛋白结合和 洗脱色谱步骤的洗脱物）。
[0060] 术语"连接的方法"指用于纯化靶分子的方法，其中所述方法包括两个或更多个加 工步骤（或单元操作），互相直接流体连通，从而流体材料在过程中连续流过加工步骤（或 单元操作），并且在方法的普通操作期间同时与两个或更多个单元操作接触。应当理解，有 时方法中的至少一个加工步骤（或单元操作）可以通过屏障如处于关闭位置的阀暂时从其 他加工步骤（或单元操作）分离。这种单独单元操作的暂时分离可以是必需的，例如在加 工启动或关闭期间或者在去除/置换单独单元操作期间。
[0061] 术语"A蛋白"和"ProA"在本文中可交换使用，并且涵盖从其天然来源回收的A蛋 白，合成制备的A蛋白（例如，通过肽合成或通过重组技术），以及保留结合具有CH 2/CH3区 如Fc区的蛋白的能力的变体。A蛋白可以商购自Repligen, Pharmacia和Fermatech。一 般将A蛋白固定在固相支持材料上。术语"ProA"还指亲和色谱树脂或柱，其包含共价连接 A蛋白的色谱固体支持基质。在一具体实施方案中，在本发明的方法中使用的A蛋白是碱稳 定形式的A蛋白。在一具体实施方案中，A蛋白包括一个或多个A蛋白结构域或者其功能变 体或片段，如2009年12月18日提交的美国专利申请第US 12/653,888号和2012年6月 6日提交的第13/489, 999号所述，两者援引加入本文，其涉及野生型多聚体形式的B、Z或C 结构域或者A蛋白的一个或多个结构域的多聚体变体（例如，B、Z或C结构域五聚体），每 个结构域具有N-端的3或4个氨基酸截短，其中结构域可以额外地包括突变以减少或消除 Fab结合。
[0062] 用于本发明的方法的A蛋白的功能衍生物、片段或变体的特征在于对小鼠 IgG2a 或人IgGl的Fe区至少K = KT8M的结合常数，并且优选K = 1(Γ9Μ。在本发明的上下文中， 获得这样的结合常数值的相互作用称为"高亲和结合"。优选地，这样的A蛋白的功能衍生 物或变体包含至少一部分野生型A蛋白的功能IgG结合结构域，选自具有保留的IgG结合 功能性的天然结构域E、D、A、B、C或其工程化突变体。
[0063] 在本发明的各种实施方案中，将A蛋白固定在固体支持物上。
[0064] 在本文中可交换使用的术语"固体支持物"、"固相"、"基质"和"色谱基质" 一般指 任何种类的固体吸附剂、树脂或其他固相（例如，膜、无纺布、整体柱等），其在分离过程中 作为吸附剂以分离靶分子（例如，包含Fe区的蛋白如免疫球蛋白）与混合物中存在的其他 分子。通常，作为在移动相的影响下，混合物中不同分子迁移通过基质的速率差异的结果， 靶分子与其他分子分离。可以将由树脂颗粒组成的基质放入柱或柱筒中。用于形成基质的 材料的实例包括多糖（例如琼脂糖和纤维素）；以及其他机械稳定的基质如二氧化硅（例 如可控多孔玻璃）、聚（苯乙烯二乙烯基）苯、聚丙烯酰胺、陶瓷颗粒以及任何上述材料的 衍生物。通常基质携带一种或多种类型的配体。但是存在其中基质单独为色谱介质的实例 (例如，活性炭、羟基磷灰石、二氧化硅等）。
[0065] "配体"是连接至色谱基质并决定基质的结合特性的官能团。"配体"的实例包括但 不限于离子交换基团、疏水相互作用基团、亲水相互作用基团、嗜硫相互作用基团、金属亲 和基团、亲和基团、生物亲和基团以及混合模式基团（上述基团的组合）。在本文中可以使 用的一些配体包括但不限于强阳离子交换基团，如磺丙基、磺酸；强阴离子交换基团，如三 甲基氯化铵；弱阳离子交换基团，如羧酸；弱阴离子交换基团，如N 5N二乙基氨基或DEAE ;疏 水相互作用基团，如苯基、丁基、丙基、己基；以及未和基团，如A蛋白、G蛋白和L蛋白。在 本发明的各种实施方案中，配体为A蛋白或者其变体或片段。
[0066] 如本文所用，术语"色谱"指任何种类的技术，其分离所关注的产物（例如，治疗性 蛋白或抗体）与生物制药制品中的污染物和/或蛋白聚集体。
[0067] 术语"亲和色谱"指蛋白分离技术，其中使靶蛋白（例如，所关注的包含Fe区的蛋 白或抗体）特异性地结合至配体（例如，A蛋白），通常将所述配体固定在固体支持物上（在 本文中，固定在固体支持物上的配体称作"色谱基质"）。靶蛋白一般在色谱步骤期间保留 其对配体的特异性结合亲和性，而混合物中的其他溶质和/或蛋白不明显地或特异性地结 合至配体。靶蛋白结合至固定的配体允许包括污染蛋白或蛋白杂质（例如，HCP)在内的杂 质通过色谱基质，而靶蛋白仍特异性地结合至固体支持材料上固定的配体；但是，通常观察 到一些污染蛋白非特异性地结合到基质上。通常用合适的洗涤缓冲液将色谱介质洗涤一次 或多次，以便在从基质洗脱结合的蛋白之前去除非特异性结合的蛋白（例如，HCP)和其他 杂质。随后利用合适的洗脱缓冲液从基质洗脱所关注的特异性结合的蛋白，所述洗脱缓冲 液促进所关注的蛋白从基质分离。在本发明的实施方案中，从这样的方法消除一个或多个 中间洗涤步骤，不降低洗脱的靶蛋白的纯度。换句话说，在本发明的一些实施方案中，允许 所关注的蛋白结合至包含A蛋白的色谱基质，随后将其洗脱，不需要一个或多个中间洗涤 步骤；但是在A蛋白洗脱混合物中所关注的蛋白的纯度不受影响。在其他实施方案中，与正 常使用一定数量的洗涤步骤以达到A蛋白洗脱混合物中一定水平的所关注的蛋白的纯度 的方法相比，减少中间洗涤步骤的数量。在本发明的各种实施方案中，虽然消除或减少中间 洗涤步骤的数量，但是A蛋白洗脱混合物中宿主细胞蛋白的水平降低。
[0068] 在本文中可交换使用时，术语"离子交换"和"离子交换色谱"指这样的色谱方法， 其中混合物中所关注的溶质或分析物与连接（例如通过共价连接）至固相离子交换材料 的带电荷的化合物相互作用，从而所关注的溶质或分析物非特异性地与带电荷的化合物相 互作用，与混合物中的溶质杂质或污染物相比多或少。混合物中的污染溶质比所关注的溶 质更快或更慢从离子交换材料的柱洗脱，或者相对于所关注的溶质结合至树脂或从树脂排 除。"离子交换色谱"包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式离子交换色谱。例如，阳离子 交换色谱可以结合靶分子（例如，包含Fe区的靶蛋白），然后洗脱（阳离子交换结合和洗 脱色谱或"CIEX"），或者可以主要结合杂质，而靶分子"流过"柱（阳离子交换流过色谱或 "FT-CIEX"）。在阴离子交换色谱的情况下，固相材料可以结合靶分子（例如，包含Fc区的 靶蛋白），然后洗脱，或者可以主要结合杂质，而靶分子"流过"柱。
[0069] 术语"离子交换基质"指带负电荷（即，阳离子交换树脂）或带正电荷（即，阴离 子交换树脂）的色谱基质。电荷可以通过例如共价连接将一种或多种带电荷的配体连接至 基质来提供。可选地或额外地，电荷可以是基质的固有特性（例如，在二氧化硅的情况下， 其具有总体负电荷）。
[0070] "阳离子交换基质"指带负电荷的色谱基质，并且其具有游离的阳离子用于与基质 接触的水溶液中的阳离子交换。连接至固相以形成阳离子交换基质的带负电荷的配体可以 是例如羧酸盐或磺酸盐。可商购的阳离子交换树脂包括羧基-甲基-纤维素、固定在琼脂糖 上的磺丙基（SP)(例如，来自 GE Healthcare 的 SP-SEPHAROSE FAST FLOW?或SP-SEPHAR0SE HIGH PERFORMANCE?)以及固定在琼脂糖上的磺酰基（例如来自GE Healthcare的 S-SEPHAROSE FAST FLOW?)。额外的实例包括Fractogel? EMD S03、Fract〇gel? EMD SE Highcap、Eshmun〇? S 和Fractogel? EMD C00(EMD Millipore)。
[0071] "混合模式离子交换基质"或"混合模式基质"指用阳离子和/或阴离子和疏 水部分共价修饰的色谱基质。可商购的混合模式离子交换树脂是BAKERB0ND ABX?(J. T. Baker，Phillipsburg，N. J.)，其包含弱阳离子交换基团、低浓度的阴离子交换基团以及 连接至硅胶固相支持基质的疏水配体。混合模式阳离子交换材料通常具有阳离子交换和疏 水部分。合适的混合模式阳离子交换材料为Capto? MMC (GE Healthcare)和EshmuilO? HCX(Merck Millipore)。混合模式阴离子交换材料通常具有阴离子交换和疏水部分。合适 的混合模式阴离子交换材料为CaptO? Adhere (GE Healthcare)。
[0072] 在本文中术语"阴离子交换基质"指带正电荷的色谱基质，例如具有连接至它的 一种或多种带正电荷的配体，如季氨基。可商购的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素 、QAE SEPHADEX? 和 FAST Q SEPHAR0SE? (GE Healthcare)。额外的实例包括 Fractogel? EMD TMAE、Fractogel? EMD TMAE highcap、Rshmnrm(R) Q 和 Fractogel? IiVID DEAE (Merck Millipore)〇
[0073] 在本文中可交换使用的术语"流过方法"、"流过模式"和"流过色谱"指产物分离技 术，其中生物制药制品中包含的至少一种所关注的产物与一种或多种杂质预期流过材料， 所述材料通常结合一种或多种杂质，其中所关注的产物通常流过。
[0074] 在本文中可交换使用的术语"结合和洗脱方法"、"结合和洗脱模式"以及"结合和 洗脱色谱"指产物分离技术，其中使生物制药制品中包含的至少一种所关注的产物连同一 种或多种杂质与固体支持物在促进所关注的产物结合至固体支持物的条件下接触。随后从 固体支持物洗脱所关注的产物。在本文所述方法的一些实施方案中，使具有连接至固体支 持物的A蛋白的固体支持物与包含所关注的产物以及一种或多种杂质的样品在合适的条 件下接触，所述条件促进所关注的产物结合至固体支持物上的A蛋白，其中预期所述一种 或多种杂质不特异性地结合至固体支持物。随后从包含A蛋白的固体支持物洗脱产物，尝 试分离所关注的产物与一种或多种杂质。在本文所述的方法中，洗脱之后，如本文所述，利 用一个或多个静态混合器和缓冲罐使A蛋白洗脱混合物进行病毒灭活，其中病毒灭活可以 在几分钟至约一小时内完成，相比之下常规方法中病毒灭活常需要几小时。
[0075] 在本文中可交换使用的术语"污染物"、"杂质"和"碎片"指任何外源或不期望的 分子，包括生物大分子如DNA、RNA，一种或多种宿主细胞蛋白，内毒素，脂质，聚集体以及一 种或多种添加剂，其可以存在于包含所关注的产物的样品中，所关注的产物分离自一种或 多种外源或不期望的分子。此外，这样的污染物可以包括用于分离方法之前进行的步骤的 任何试剂。
[0076] 在本文中可交换使用的术语"中国仓鼠卵巢细胞蛋白"和"CHOP"指源自中国仓鼠 卵巢（"CH0"）细胞培养物的宿主细胞蛋白（"HCP"）的混合物。HCP或CHOP-般作为杂 质存在于包含所关注的蛋白如CHO细胞中表达的抗体或包含Fc的蛋白的细胞培养基或裂 解物中（例如，收获的细胞培养液（"HCCF")）。包含所关注的蛋白的混合物中存在的CHOP 的量提供所关注的蛋白的纯度的量度。HCP或CHOP包括但不限于宿主细胞如CHO宿主细胞 表达的所关注的蛋白。通常，蛋白混合物中CHOP的量以相对于混合物中所关注的蛋白的量 的百万分比表示。应当理解当宿主细胞为另一细胞类型时，例如除CHO之外的哺乳动物细 胞、大肠杆菌（E. coli)、酵母、昆虫细胞或植物细胞，HCP指在宿主细胞的裂解物中发现的 除靶蛋白之外的蛋白。
[0077] 术语"百万分数"或"ppm"在本文中可交换地用来指通过本发明的方法纯化的靶 蛋白的纯度的度量。单位ppm指以纳克/毫克计的HCP或CHOP的量每以毫克/毫升计的 所关注的蛋白（即，CHOP ppm = (CHOP ng/mL)/(所关注的蛋白mg/mL)，其中蛋白在溶液 中）。
[0078] 如本文所用，术语"澄清（clarify) "、"澄清（clarification) "和"澄清步骤"指用 于去除悬浮的颗粒和或胶体的加工步骤，从而减少包含靶分子的溶液的浊度，如测量的以 NTU(比浊法浊度单位）计的。澄清可以通过各种方式实现，包括离心或过滤。离心可以以 分批或连续模式进行，而过滤可以以正常流动（例如深层过滤）或切向流模式进行。在现 在工业中使用的方法中，离心之后通常是深层滤器，深层滤器旨在去除离心尚未去除的不 溶性杂质。此外，可以使用增加澄清效率的方法，例如沉淀。杂质的沉淀可以通过各种方式 进行，例如通过絮凝、PH调节（酸沉淀）、温度变化、由于刺激响应性聚合物或小分子导致的 相改变或者这些方法的任何组合。在本文所述的一些实施方案中，澄清包括离心、过滤、深 层过滤和沉淀中的两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中，本文所述的方法和系统 避免需要离心。
[0079] 在本文中可交换使用的术语"纯化"、"分离（separating) "或"分离（isolating) " 指增加来自包含所关注的蛋白以及一种或多种杂质的组合物或样品的所关注的多肽或蛋 白或者靶蛋白的纯度。通常，通过从组合物去除（完全或部分）至少一种杂质来增加所关 注的蛋白的纯度。"纯化步骤"可以是导致"均质"组合物或样品的总纯化方法的一部分，其 在本文中用来指在包含所关注的蛋白的组合物中包含少于IOOppm HCP的组合物或样品，或 者少于90ppm、少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、少 于20ppm、少于10ppm、少于5ppm或少于3ppm的HCP。
[0080] 在本发明的一些实施方案中，所关注的产物为免疫球蛋白。
[0081] 术语"免疫球蛋白"、"Ig"或"抗体"（在本文中可交换使用）指具有由两条重链和 两条轻链组成的基本4-多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其具有特异 性结合抗原的能力。术语"单链免疫球蛋白"或"单链抗体"（在本文中可交换使用）指具有 由一条重链和一条轻链组成的基本2-多肽链结构的蛋白，例如通过链间肽接头稳定所述 链，其具有特异性结合抗原的能力。术语"结构域"指包含例如通过β_折叠和/或链内二 硫键稳定的肽环（例如，包含3-4个肽环）的重链或轻链多肽的球状区域。基于在"恒定" 结构域的情况下在各种类别成员的结构域内相对缺少序列变化，或者在"可变"结构域的情 况下在各种类别成员的结构域内的显著变化，结构域在本文中进一步称为"恒定"或"可变" 的。抗体或多肽"结构域"在本领域中常可交换地称为抗体或多肽"区"。抗体轻链的"恒 定"结构域可交换地称为"轻链恒定区"、"轻链恒定结构域"、"CL"区或"CL"结构域。抗体 重链的"恒定"结构域可交换地称为"重链恒定区"、"重链恒定结构域"、"CH"区或"CH"结构 域。抗体轻链的"可变"结构域可交换地称为"轻链可变区"、"轻链可变结构域"、"VL"区或 "VL"结构域。抗体重链的"可变"结构域可交换地称为"重链可变区"、"重链可变结构域"、 "VH"区或"VH"结构域。
[0082] 免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以以单体或聚合物形式存 在，例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗 体。术语"片段"指包含比完整或完全抗体或抗体链少的氨基酸残基的部分（part)或部分 (portion)抗体或抗体链。可以通过化学或酶促处理完整或完全抗体或抗体链来获得片段。 还可以通过重组方式获得片段。示例性片段包括Fab、Fab'、F (ab'）2、Fc和/或Fv片段。 [0083] 术语"抗原结合片段"指结合抗原或与完整抗体（即，与它们来源的完整抗体） 竞争抗原结合（即，特异性结合）的免疫球蛋白或抗体的多肽部分。结合片段可以通过重 组DNA技术或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来制备。结合片段包括Fab、Fab'、 F(ab'）2、Fv、单链和单链抗体。
[0084] 根据本文所述方法纯化的所关注的蛋白是包含CH2/CH3区并因此适合通过A蛋白 色谱纯化的蛋白。在本文中使用的术语"CH2/CH3区"指与A蛋白相互作用的免疫球蛋白分 子的Fc区中的那些氨基酸残基。C H2/CH3区或包含Fc区的蛋白的实例包括抗体、免疫粘附 素以及包含与CH2/C H3区或Fc区融合或缀合的所关注的蛋白的融合蛋白。
[0085] 在一具体实施方案中，本发明的方法用于纯化抗体片段，其为包含Fc区的片段。
[0086] 术语"Fc区"和"包含Fc区的蛋白"表示所述蛋白包含免疫球蛋白的重链和/或 轻链恒定区或结构域（如先前定义的CH和CL区）。包含"Fc区"的蛋白可以具有免疫球 蛋白恒定结构域的效应子功能。"Fc区"如C H2/CH3区可以选择性地结合至亲和配体如A蛋 白或其功能变体。在一些实施方案中，包含Fc区的蛋白特异性地结合A蛋白或者其功能衍 生物、变体或片段。在其他实施方案中，包含Fc区的蛋白特异性地结合G蛋白或L蛋白，或 者它们的功能衍生物、变体或片段。
[0087] 一般来说，免疫球蛋白或抗体针对所关注的"抗原"。优选地，抗原是生物学上重要 的多肽，并且向患有疾病或病症的哺乳动物给药抗体可以在该哺乳动物中导致治疗益处。
[0088] 如本文所用，术语"单克隆抗体"指获得自一群基本上均质的抗体的抗体，即 该群包含的各个抗体除了少量可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度 特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇（表位）的不同抗 体的常规（多克隆）抗体制品相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰 语"单克隆"表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理解为要求 通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.，Nature256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方 法制备（参见例如，美国专利第4, 816, 567号）。"单克隆抗体"还可以分离自噬菌体抗 体文库，使用 Clackson et al·，Nature 352:624-628(1991)和 Marks et al.，J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)所述的技术。
[0089] 单克隆抗体还可以包括"嵌合"抗体（免疫球蛋白），其中部分重链和/或轻链与 来源于特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源， 而链的剩余部分与来源于另一物种的抗体或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应 序列相同或者同源；以及这类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性（美国专利 第 4, 816, 567 号；和 Morrison et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
[0090] 当在本文中使用时，术语"高变区"指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区 包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基（即轻链可变结构域中的残基24-34 (LI)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)以及重链可变结构域中的 31-35 (HI)、50-65(H2)和 95-102 (H3); Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))和 / 或来自"高 变环"的那些残基（即轻链可变结构域中的残基26-32仏1)、50-52仏2)和91-96仏3)以 及重链可变结构域中的 26-32(Η1)、53-55(Η2)和 96-101(H3) ;Chothia and Lesk J.Mol. Biol. 196:901-917(1987))。"框架"或"FR残基"是除如本文所定义的高变区残基以外的 那些可变结构域残基。
[0091] 非人（例如，小鼠）抗体的"人源化"形式为嵌合抗体，其包含来源于非人免疫球蛋 白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白（受体抗体），其中受体的高变区残基 被具有期望的特异性、亲和性和能力（capacity)的非人物种（供体抗体）如小鼠、大鼠、兔 或非人灵长类的高变区残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区（FR)残基被相 应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进 行这些修饰以进一步精制抗体的性能。一般来说，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、 通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变 环，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体可以包含至 少一部分免疫球蛋白恒定区（Fe)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones et al.，Nature321:522-525(1986) ;Riechmann et al·，Nature 332:323-329(1988);和 Presta，Curr. 0ρ· Struct. Biol. 2:593-596(1992)。
[0092] "缓冲液"是通过其酸-碱缀合组分的作用抗pH变化的溶液。可以例如根据期望 的缓冲液pH米用的各种缓冲液描述于Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems,Gueffroy, D. , ed. Calbiochem Corporation(1975)〇 缓冲液的非限制性实例包括MES、M0PS、M0PS0、TriS、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀 酸盐和铵盐，以及这些缓冲液的组合。
[0093] 如本文所用，术语"溶液"、"组合物"或"样品"指所关注的分子或靶蛋白（例如， 包含Fc区的蛋白如抗体）以及一种或多种杂质的混合物。在一些实施方案中，在进行本文 所述的病毒灭活方法之前，使样品进行澄清步骤和A蛋白亲和色谱步骤。在一些实施方案 中，样品包含细胞培养物进料，例如来自CHO细胞培养物的进料，在病毒灭活之前使其进行 澄清和A蛋白色谱步骤。
[0094] 如本文所用，术语"非哺乳动物表达系统"指用来产生治疗性蛋白的所有宿主细胞 或生物体，其中所述宿主细胞或生物体是非人来源的。非哺乳动物表达系统的实例为大肠 杆菌和毕赤酵母（Pichia pastoris)。
[0095] 如本文所用，术语"洗脱物"或"洗脱混合物"指包含例如结合和洗脱色谱之后通过 洗脱获得的所关注的分子的溶液（例如，利用A蛋白亲和色谱基质）。可以使洗脱物进行一 个或多个额外的纯化步骤。在本发明的一些实施方案中，获得洗脱混合物，其包含靶蛋白， 例如包含Fc区的蛋白，其中如本文所述，使洗脱混合物进行病毒灭活。
[0096] 术语"电导率"指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离 子转运流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液会具有较高的电导率。测量电 导率的单位为毫西门子（milliSeimens)每厘米（mS/cm或mS)，并且可以利用可商购的电导 率计（例如，由Orion销售）进行测量。溶液的电导率可以通过改变其中离子的浓度来改 变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐（例如NaCl或KC1)的浓度以获得期望 的电导率。在一些实施方案中，修改各种缓冲液的盐浓度以获得期望的电导率。
[0097] 多肽的"pi"或"等电点"指多肽的正电荷平衡其负电荷的pH。pi可以计算自多 肽连接的糖的氨基酸残基或唾液酸残基的净电荷，或者可以通过等电聚焦来确定。
[0098] 在本文中可交换使用的术语"加工步骤"或"单元操作"指在纯化过程中使用一种 或多种方法或装置以实现某种结果。可以用于纯化过程的加工步骤或单元操作的实例包括 但不限于澄清、结合和洗脱色谱、病毒灭活、流过纯化以及配制。应当理解每个加工步骤或 单元操作可以采用一个以上的步骤或方法或装置以实现该加工步骤或单元操作的预期结 果。
[0099] 如本文所用，术语"连续方法"指纯化靶分子的方法，其包括两个或更多个加工步 骤（或单元操作），从而来自一个加工步骤的产出直接流入方法中的下一加工步骤，没有中 断，并且其中两个或更多个加工步骤可以在它们的至少一部分持续时间中同时进行。换句 话说，在连续方法的情况下，不必在下一加工步骤开始之前完成加工步骤，但是一部分样品 通常移动通过加工步骤。
[0100] 在一些实施方案中，连接不同的加工步骤以连续方式进行操作。在一些实施方案 中，如本文所述，病毒灭活方法构成连续纯化方法中的加工步骤，其中样品连续地从A蛋白 亲和色谱步骤流至病毒灭活步骤至所述方法中的下一步，其通常为流过纯化加工步骤。 [0101] 在一些实施方案中，病毒灭活加工步骤连续进行，即来自先前的结合和洗脱色谱 步骤（即，A蛋白亲和色谱）的洗脱物连续地流入病毒灭活步骤，所述病毒灭活步骤采用一 个或多个静态混合器和/或缓冲罐，之后可以将病毒灭活的洗脱物收集在储存容器中直至 进行下一加工步骤。
[0102] II.示例件病毒灭活剂
[0103] 病毒灭活使得病毒失活或者不能复制或感染，这非常重要，特别是在靶分子旨在 用于治疗用途的情况下。因此，通常在蛋白纯化过程期间使用病毒灭活，特别是在蛋白旨在 用于治疗用途时。
[0104] 许多病毒包含可以通过化学改变灭活的脂质或蛋白包衣。不是简单地使病毒失 活，一些病毒灭活方法能够使病毒完全变性。一些更广泛使用的病毒灭活方法包括例如使 用以下一种或多种：溶剂/去污剂灭活（例如用Triton X 100);巴氏灭菌（加热）；酸性 PH灭活；以及紫外线（UV)灭活。还可以组合这些方法中的两种或更多种；例如，在升高的 温度下进行酸性PH灭活。
[0105] 用于生物技术产物的几种病毒灭活剂是本领域已知的。参见例如，Gail Sofer, "Virus Inactivation in the 1990s-and into the 21st Century, Part 4,Culture Media,Biotechnology Products,and Vaccines, ^Biopharm International, January 2003, pp. 50-57)，其中一些在下文中描述。
[0106] 已证实低pH灭活异嗜性小鼠白血病病毒（XMuLV)。在一研究中，据发现pH 3. 5-4.0在18-26°C下有效，并且对于pH 3. 7直至pH 4.1，在灭活动力学中观察到非常少的 差异。但是，在2-8°C下，与pH 3. 7的约30分钟相比，pH 4. 1灭活较慢且需要长达1小时。 此外，对纯化的不同靶分子观察到可变性。例如，一种靶分子使用的灭活时间为60分钟，而 对于另一种其为120分钟，此外，在一种靶分子的情况下，病毒XMuLV甚至在120分钟之后 仍未完全灭活。蛋白浓度也影响灭活动力学。在仅缓冲液中，XMuLV在120分钟内灭活；添 加蛋白阻止用相同的pH、温度和暴露时间完全灭活。看来灭活溶液的离子强度减轻增加蛋 白浓度的影响。
[0107] 在另一研究中，在Sp2/0或NSO小鼠细胞系中产生的8种不同单克隆抗体（Ms) 的情况下，研究低pH用于XMuLV和伪狂犬病毒（PRV)病毒的灭活。所用的pH值范围为 3. 14-3. 62,导致约5至6以上的LRV (即在样品中不可以测量到病毒）。这些数据用来支持 一般的病毒灭活方法。大部分但并不全是MAb的13种产物的不同研究说明pH 3. 6-4. 0在 5-60分钟内灭活几种不同病毒的能力。
[0108] 已发现辛酸盐在MAb制备过程中灭活脂质包裹的病毒。将包含假单胞菌 (Pseudomonas)外毒素 A-单克隆抗体缀合物和假单胞菌单克隆IgM的收获细胞培养液各自 掺入假单胞菌。单纯疱疹病毒-I (HSV-I)和水泡性口炎病毒（VSV)在20°C下于少于60分 钟内完全灭活。但是，在5°C下，120分钟之后显示VSV仅部分灭活。辛酸盐的非离子化形 式在广泛pH范围中维持，并且非离子化形式在0. 001-0. 07重量％的浓度下在病毒灭活中 有效。VSV和痘苗病毒在pH 6. 3下灭活比HSV-I慢。
[0109] 去污剂也已用作病毒灭活剂。Triton X-100(0. 5%，4°C )在4小时内完全灭活 呼吸道合胞病毒（RSV)和弗里德小鼠白血病病毒（FrMuLV)，不影响许多Mb的结合能力。 LoglO减少值对于FrMuLV为>3. 8,而对于RSV为>5. 4。其他数据已证实MuLV不被0. 1-1 % Tween灭活。
[0110] 溶剂/去污剂（S/D)常用于血浆蛋白的病毒灭活。S/D还用于制备重组蛋白和MAb 期间有包膜病毒的灭活。例如，在制备B-结构域缺失的重组因子VIII期间，S/D用于病毒 灭活。虽然可能没有病毒与用于制备的CHO细胞系相关，但是可以在阳离子交换步骤之后 添加 S/D。以0. 3% TNBP和1% Triton X-100的浓度为目标至少30分钟。已证实S/D处 理完全且快速地灭活测试的全部有包膜病毒，包括副流感-3病毒（PI-3)、XMuLV、传染性牛 鼻气管炎病毒（IBR)和恶性卡他热病毒（MCF)。（参见，Sofer et al.，Id.)
[0111] 已建议将β-丙内酯用于裸DNA疫苗的病毒灭活。据发现对于在4°C下16-小时 处理，β -丙内酯的初始浓度应当不超过0. 25%以防止丧失基因表达。
[0112] 在本发明的一些实施方案中，病毒灭活采用将包含靶蛋白的样品暴露于酸性或低 pH。因此，在本文所述的一些实施方案中，病毒灭活利用静态混合器将来自结合和洗脱色谱 步骤的产出或洗脱物（其为病毒灭活的上游）在线暴露于酸性pH。用于病毒灭活的pH通 常低于5.0,或者为3.0-4. 0。在一些实施方案中，pH为3. 6或更低。当使用在线静态混合 器罐时，用于病毒灭活的持续时间为10分钟或更少，或者5分钟或更少，或者2分钟或更 少，或者1分钟或更少。在其他实施方案中，在结合和洗脱色谱步骤与流过加工步骤之间使 用缓冲罐。当使用缓冲罐时，病毒灭活的持续时间通常为1小时或更少，或者30分钟或更 少。在使用在线静态混合器或缓冲罐的情况下，病毒灭活使得所述方法能够连续运行，而不 必在汇集罐中收集样品用于病毒灭活。
[0113] III.示例件病毒和确定病毒灭活
[0114] 可以通过两种主要机制"清除"病毒：去除（例如通过过滤或色谱）或灭活（例如 低pH、去污剂或辐照）。生物制药病毒清除的监管建议可以在FDA和EMEA发布的几个文件 中找到。
[0115] 利用单独单元操作的缩小版本评价方法的病毒清除能力。向代表性加工进料的样 品"掺入"已知量的病毒以模拟病毒污染，并且测量通过操作去除或灭活的病毒的量。建议 用于掺入的病毒的应当"尽可能高以确定制备步骤充分灭活/去除病毒的能力"。但是，病 毒掺入体积不必很大而显著改变制备材料的组成；一般认为10%掺入体积是最大可接受 的掺入。
[0116] 一般利用定量感染性病毒颗粒的测定从纯化过程中单独单元操作之前和之后采 集的样品测量病毒。以获得的Log ltl减少（log减少值或LRV)的报道的清除。当单元操作 实现在加工材料中未检测到病毒这种程度的清除时，利用根据起始进料中的病毒滴度和采 样的最终材料的量的计算确定最小LRV。结果，通过使用允许高水平的掺入挑战的高滴度 病毒储液以及增加测定灵敏度的大体积病毒测定，可以提高高度有效的清除步骤可以声称 的LRV。相反地，当进料材料为细胞毒性或干扰检测细胞的病毒感染时，可以降低可证实的 LRV，因为这可能需要样品稀释，这降低测定灵敏度。
[0117] 本领域已知几种方法测定病毒感染性。组织培养感染剂量50%测定是计数样品中 感染性病毒颗粒的数量的一种这样的方法。TCID 5tl是在50%接种的培养物中会产生细胞病 理效应的病原体（病毒）的量。TCID5tl值与样品中感染性病毒粒子的数量成比例，但不相 同。利用这种方法确定的滴度通常报道为TCID 5(l/mL。
[0118] 当通过测定根本未检测到病毒时，利用最低检测限（LOD)计算确定样品的最大可 能滴度。这个计算考虑测定的灵敏度，并且报道在测定未检测到任何病毒时样品中可以有 的最多病毒。这些计算的结果是报道为X"的滴度，表示样品中的实际滴度为X或更低 (95%置信度）。这种LOD计算仅取决于测试的样品的量以及测定之前对样品进行的任何 预稀释。当滴度报道为"彡X"时，相应的Log减少值（LRV)报道为"彡Y"，表示所得的LRV 为Y或更高。
[0119] 设计病毒清除验证研究以评价MAb纯化方法去除或灭活许多不同种类的病毒的 能力。FDA推荐使用涵盖大和小颗粒、DNA和RNA基因组的几种模式病毒，以及化学敏感和 抗脂质包膜和非包膜的毒株。基本原理是证实强劲清除适当多样化组的病毒提供未检测 的、未知的病毒污染物也会减少至最低水平的保证。符合这些准则的4种病毒在表1中示 出，其总结了适合MAb方法病毒清除验证的模式病毒组的特性（改编自ICH Q5A)。
[0120] 表 I
[0121]

【权利要求】
1. 一种灭活样品中的一种或多种病毒的方法，其中所述方法包括在纯化靶分子的过程 期间，在所述样品从第一单元操作流至第二单元操作时，连续地将所述样品与一种或多种 病毒灭活剂混合。
2. 权利要求1的方法，其中所述第一单元操作包括结合和洗脱色谱，并且所述第二单 元操作包括流过纯化方法。
3. 权利要求2的方法，其中所述结合和洗脱色谱包括A蛋白亲和色谱。
4. 权利要求2的方法，其中所述流过纯化方法包含两种或更多种选自以下的基质：活 性炭、阴离子交换色谱介质、阳离子交换色谱介质和病毒过滤介质。
5. 权利要求1的方法，其中所述样品包含A蛋白洗脱物。
6. 权利要求1的方法，其中所述靶分子为抗体或包含Fc区的蛋白。
7. 权利要求1的方法，其中利用一个或多个在线静态混合器将所述样品与一种或多种 病毒灭活剂混合。
8. 权利要求1的方法，其中利用一个或多个缓冲罐将所述样品与一种或多种病毒灭活 剂混合。
9. 权利要求1的方法，其中所述一种或多种病毒灭活剂选自酸、盐、溶剂和去污剂。
10. 权利要求7的方法，其中所述样品的流动在层流范围中。
11. 一种灭活A蛋白洗脱物中的一种或多种病毒的方法，所述方法包括利用一个或多 个在线静态混合器将所述洗脱物与一种或多种病毒灭活剂混合，其中在少于10分钟或少 于5分钟或少于2分钟或少于1分钟内实现完全的病毒灭活。
12. -种灭活A蛋白洗脱物中的一种或多种病毒的方法，所述方法包括利用缓冲罐将 所述洗脱物与一种或多种病毒灭活剂混合，其中在少于1小时或少于30分钟内实现完全的 病毒灭活。
13. -种灭活一种或多种病毒的方法，所述方法包括： (a) 使包含靶蛋白的样品进行A蛋白亲和色谱方法，从而获得洗脱物；以及 (b) 将所述洗脱物连续地转移至在线静态混合器以将一种或多种病毒灭活剂与所述洗 脱物混合等于或少于10分钟的一段时间， 从而灭活一种或多种病毒。
14. 权利要求13的方法，其中所述A蛋白亲和色谱方法以分批模式进行。
15. 权利要求13的方法，其中所述A蛋白亲和色谱方法以连续模式进行。
16. 权利要求15的方法，其中所述方法包括连续多柱色谱。
17. 权利要求13的方法，其中所述一种或多种病毒灭活剂为酸。
18. 权利要求13的方法，其中所述靶蛋白为抗体。
19. 权利要求13的方法，其还包括将来自步骤（b)的产出连续转入流过纯化加工步骤 的步骤。
20. 权利要求19的方法，其中所述流过纯化步骤包含两种或更多种选自以下的基质： 活性炭、阴离子交换介质、阳离子交换介质和病毒滤器。
【文档编号】C12N7/04GK104411820SQ201380034780
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年6月13日 优先权日:2012年6月29日
【发明者】A·克赛诺普洛斯 申请人:Emd密理博公司