高转导效率的rAAV载体、组合物及其使用方法
【专利摘要】本发明提供了AAV衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含对VP3区中表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基之一或其组合的修饰。本发明还提供了含有本发明之AAV衣壳蛋白的rAAV病毒体以及编码本发明之AAV衣壳蛋白的核酸分子和rAAV载体。有利地，与野生型rAAV载体和病毒体相比，本发明的rAAV载体和病毒体具有提高的转导多种目的细胞、组织和器官的效率。
【专利说明】高转导效率的rAAV载体、组合物及其使用方法
[0001] 发明的背景
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2013年3月15日提交的美国专利申请No. 13/840,224(未决）和于 2012年5月15日提交的美国临时专利申请No. 61/647, 318 (未决）的优先权权益。本申请 还涉及于2009年12月31日提交的美国专利申请No. 12/595/196(于2013年5月21日授 权为U. S. 8, 445, 267)、于2008年4月8日提交的国际专利申请No. PCT/US2008/059647 (进 入国家）、于2007年4月9日提交的美国临时专利申请No. 60/910, 798 (期满）、于2013年 3月29日提交的美国专利申请No. 13/854, 011 (未决）和于2013年4月2日提交的美国专 利申请No. 13/855, 640 (未决）。上述各申请各自的内容均在此通过专门引用以其整体并 入。
[0004] 关于联邦政府资助的研宄或开发的声明
[0005] 不适用。
[0006] 发明的【技术领域】
[0007] 通过使用病毒来递送治疗性遗传物质，在基因治疗领域中已取得了重大进步。由 于其低免疫原性以及能够有效地转导非分裂细胞，腺相关病毒（adeno-associated virus， AAV)作为用于基因治疗的高效病毒载体已引起了相当大的关注。已显示，AAV感染多种类 型的细胞和组织，并且在过去十年内，使这种病毒系统适用于人基因治疗已经取得了显著 进展。
[0008] 在其正常"野生型"形式中，重组AAV (rAAV) DNA以长度约为4600个核苷酸（nt)的 单链分子被包装进病毒衣壳中。通过病毒感染细胞后，细胞的分子机制将单DNA链转化成 双链形式。
[0009] AAV具有很多特性，这些特性有利于将其用作基因递送载体：1)野生型病毒不与 任何病理性人状况（condition)相关；2)重组形式不含天然病毒编码序列；以及3)在很多 应用中已经观察到持久的转基因表达。基因治疗的主要障碍之一（即诱导针对载体来源的 和转基因来源之表位的细胞免疫应答中的免疫竞争），可通过复制缺乏和缺乏由重组AAV 表达的病毒蛋白质来克服。
[0010] 重组腺相关病毒载体的转导效率在体外和体内的不同细胞和组织中变化很大。已 进行了系统性研宄来阐明AAV生活周期中的基本阶段。例如，据记载，被表皮生长因子受体 蛋白酪氨酸激酶（EGFR-PTK)在酪氨酸残基处磷酸化的细胞蛋白质FKBP52在体外和体内均 抑制AAV第二链DNA合成，从而抑制转基因表达。还已证明，EGFR-PTK信号转导调节泛素/ 蛋白酶体途径介导的细胞内运输以及FKBP52介导的AAV载体第二链DNA的合成。在这些 研宄中，抑制EGFR-PTK信号转导导致AAV衣壳蛋白的泛素化降低，其转而通过限制蛋白酶 体介导的AAV载体的降解来促进核转运，表明EGFR-PTK介导的AAV衣壳上酪氨酸残基的磷 酸化。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明提供了 AAV衣壳蛋白，其包含对VP3区中表面暴露之赖氨酸、丝氨酸、苏氨 酸和/或酪氨酸残基之一或其组合的修饰。本发明还提供了包含本发明之AAV衣壳蛋白的 rAAV病毒体以及编码本发明之AAV衣壳蛋白的核酸分子和rAAV载体。有利地，与野生型 rAAV载体和病毒体相比，本发明的rAAV载体和病毒体具有提高的转导多种目的细胞、组织 和器官的效率。
[0013] 在一个实施方案中，本发明提供了含有编码AAV衣壳蛋白之核苷酸序列的核酸分 子，其中所述AAV衣壳蛋白的VP3区包含对应于野生型AAV衣壳蛋白[例如，SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9或SEQ ID N0:10;在一个实施方案中，优选野生型AAV2的衣壳蛋白 (SEQ ID NO :2)]之VP3区中的赖氨酸残基位置上的非赖氨酸残基，其中野生型AAV蛋白质 之 VP3 区中的赖氨酸残基是 K258、K321，K459、K490、K507、K527、K572、K532、K544、K549、 K556、K649、K655、K665和K706中的一个或更多个，或其任意组合。
[0014] 在一个实施方案中，对对应于野生型AAV2衣壳序列之K532的表面暴露的赖氨酸 残基进行修饰。在一个实施方案中，将AAV衣壳中表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸（E) 或精氨酸（R)。在一些特定实施方案中，将对应于野生型AAV2衣壳序列之K532的表面暴露 的赖氨酸残基变更为精氨酸（K532R)。
[0015] 在某些实施方案中，对对应于野生型AAV2衣壳序列之K490、K544、K549和K556的 一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基进行修饰。在某些特定实施方案中，将对应于野生型 AAV2衣壳序列之Κ490、Κ544、Κ549和Κ556的一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基变更为 谷氨酸（E)。
[0016] 在一个实施方案中，本发明提供了 AAV2载体，其中将对应于野生型AAV2衣壳之 Κ544和Κ556残基的表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸（E)。
[0017] 在某些实施方案中，对对应于野生型AAV8衣壳序列之Κ530、Κ547和Κ569的一个 或更多个表面暴露的赖氨酸残基进行修饰。在某些特定实施方案中，将对应于野生型AAV2 衣壳序列之Κ530、Κ547和Κ569的一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸（E)。
[0018] 在一个实施方案中，对AAV衣壳之表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨 酸残基的组合进行修饰，其中修饰发生在对应于野生型AAV衣壳序列[例如，SEQ ID NO: 1-10中的一个或更多个；并且在一个特定实施方案中，为野生型AAV2的衣壳蛋白序列（SEQ IDNO :2)]之
[0019] (Y444F+Y500F+Y730F+T49IV)
[0020] (Y444F+Y500F+Y730F+T49IV+T550V)
[0021] (Y444F+Y500F+Y730F+T49IV+T659V)
[0022] (T491V+T550V+T659V)
[0023] (Y440F+Y500F+Y730F)
[0024] (Y444F+Y500F+Y730F+T491V+S662V)，和 / 或
[0025] (Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T550V+T659V)的位置上。
[0026] 在一些相关实施方案中，本发明提供了使用本文公开的载体和组合物的方法，并 且还提供了使用所公开的病毒载体构建体转导一种或更多种目的细胞、一种或更多种目的 组织和/或一种或更多种目的器官，特别是哺乳动物的细胞、组织和/或器官的方法。在总 体和通常的含意上，这些方法一般包括至少以下步骤：以足以用病毒载体转化至少第一细 胞或第一细胞群的量和时间向合适的目的宿主细胞中引入至少第一组合物，所述组合物包 含有效量的本发明的rAAV载体和/或感染性AAV病毒颗粒或重组AAV病毒体，或者本质上 由或者由本发明的rAAV载体和/或感染性AAV病毒颗粒或重组AAV病毒体组成。在一些 特定实施方案中，本发明的载体、病毒体或感染性病毒颗粒优选用作用于将一个或更多个 核酸片段引入选择的目的宿主细胞中的载体。优选地，宿主细胞为哺乳动物宿主细胞，其中 特别优选人宿主细胞作为本文所述重组载体和病毒体的靶标。在某些实施方案中，这样的 载体还包含一个或更多个编码所选治疗剂和/或诊断剂的分离的DNA片段，其包括，例如包 含能够在已经被一种或更多种本文所描述并提供的载体、病毒或感染性病毒体转化的哺乳 动物宿主细胞中表达之一个或更多个目的基因的一个或更多个多核苷酸。
[0027] 在一个方面，本发明还提供了含有重组腺相关病毒（AAV)载体、病毒体、病毒颗粒 的组合物及其药物制剂，其可用在递送编码一种或更多种有益或治疗产品的遗传物质至哺 乳动物细胞和组织的方法中。特别地，通过其在治疗、预防和/或改善一种或更多种哺乳动 物疾病之症状中的使用，本发明的组合物和方法在本领域中提供了显著进步。可预期，通过 提供用于治疗多种不同疾病、病症（disorder)和功能障碍（dysfunction)之新的改进的病 毒载体构建体，人基因治疗将特别受益于本教导。
[0028] 在另一方面，本发明涉及经修饰的rAAV载体，其编码一种或更多种用于预防、治 疗和/或改善被递送了载体构建体的哺乳动物中之一种或更多种病症的哺乳动物治疗剂。 特别地，本发明提供了基于rAAV的表达构建体，其编码一种或更多种用于治疗、预防和/ 或改善哺乳动物疾病、功能障碍、损伤和/或病症之一种或更多种症状的哺乳动物治疗剂 (包括，但不局限于，例如，蛋白质、多肽、肽、酶、抗体、抗原结合片段及其变体和/或活性片 段）。
[0029] 在另一实施方案中，本发明涉及经遗传修饰的rAAV载体，其包含编码一种或更多 种治疗剂的至少第一核酸片段，所述治疗剂改变、抑制、降低、防止、消除或削弱细胞中一种 或更多种内源性生物过程的活性。在一些特定实施方案中，这些治疗剂可为选择性抑制或 降低一种或更多种代谢过程、功能障碍、病症或疾病之影响的那些治疗剂。在某些实施方案 中，缺陷可由需要治疗之哺乳动物的损伤或创伤导致。在另一些实施方案中，缺陷可由过表 达内源生物化合物导致，而在又一些实施方案中，缺陷还可由一种或更多种内源生物化合 物的低表达或甚至缺乏而导致。
[0030] 当考虑使用这些载体将一种或更多种外源蛋白质、多肽、肽、核酶、SiRNA和/或反 义寡核苷酸引入转染有所述载体的特定细胞中时，可采用本文公开的经修饰AAV载体如下 进行：将有效地位于至少第一异源启动子下游并受其控制的至少第一外源多核苷酸（所述 启动子在包含所述载体的细胞中表达所述多核苷酸）并入到载体中以产生编码的治疗剂， 包括，例如肽、蛋白质、多肽、抗体、核酶、siRNA和反义寡核苷酸或多核苷酸。这些构建体 可采用一种或更多种异源启动子以表达目的治疗剂。这些启动子可以是组成型、诱导型或 者甚至细胞或组织特异性的。示例性的启动子包括，但不限于，CMV启动子、β-肌动蛋白 启动子、杂合CMV启动子、杂合β -肌动蛋白启动子、EFl启动子、Ula启动子、Ulb启动子、 四环素诱导型启动子（Tet-inducible promoter)、VP16_LexA启动子、联合特异性启动子 (joint-specific promoter)和人特异性启动子。
[0031] 本发明经遗传修饰的rAAV载体或表达系统还可进一步包含第二核酸片段，其包 含一个或更多个增强子、调控元件、转录元件或者本质上由或由一个或更多个增强子、调控 元件、转录元件组成，以改变或影响rAAV载体中克隆的异源基因的转录。例如，本发明的 rAAV载体还可包含第二核酸片段，其包含至少第一 CMV增强子、合成增强子或者细胞或组 织特异性的增强子或者本质上由或由至少第一 CMV增强子、合成增强子或者细胞或组织特 异性的增强子组成。所述第二核酸片段还可进一步包含一个或更多个内含子序列、转录后 调控元件等或者本质上由或由一个或更多个内含子序列、转录后调控元件等组成。本发明 的载体和表达系统还可任选地进一步包含第三核酸片段，其包含一个或更多个多接头或多 限制性位点/克隆区或者本质上由或由一个或更多个多接头或多限制性位点/克隆区组 成，从而有利于在适当的限制性位点将一个或更多个所选的遗传元件、多核苷酸等插入到 rAAV载体中。
[0032] 在本发明的一些方面中，包含在本文公开的一种或更多种改进的rAAV载体中的 外源多核苷酸优选来源于哺乳动物，其中特别优选编码来源于人、灵长类动物、鼠、猪、牛、 绵羊、猫、犬、马、epine、山羊或狼之多肽和肽的多核苷酸。
[0033] 如上所述，外源多核苷酸优选编码一种或更多种蛋白质、多肽、肽、酶、抗体、 SiRNA、核酶或反义多核苷酸、寡核苷酸、PNA分子或这些治疗剂中两种或更多种的组合。事 实上，在需要时，内源多核苷酸可编码两种或更多种这样的分子，或多种这样的分子。当需 要进行联合基因治疗时，可由单个rAAV表达系统产生两种或更多种不同的分子，或者可利 用两种或更多种独特的rAAV表达系统转染选择的宿主细胞，各表达系统中均可包含一种 或更多种不同的编码治疗剂的多核苷酸。
[0034] 在另一些实施方案中，本发明还提供了包含在感染性腺相关病毒颗粒或病毒体或 多种这样的颗粒中的遗传修饰的rAAV载体，对于治疗性和/或预防性基因治疗方案，这些 遗传修饰的rAAV载体本身还可包含在一种或更多种稀释剂、缓冲剂、生理溶液或药物载剂 中，从而被配制成用于向例如人的哺乳动物施用。这些载体、病毒颗粒、病毒体以及它们中 的多种还可在赋形剂制剂中提供，从而使其可用于向选择的家畜、野生的或驯养的动物、伴 侣动物（包括宠物等）以及非人灵长类动物、动物园或其他类型的圈养个体等兽医施用，其 中当向这样的动物施用后，显示这些载体和相关基因治疗的使用产生了有益效果。
[0035] 本发明还涉及包含至少一种所公开的rAAV载体、病毒颗粒或病毒体的宿主细胞。 这些宿主细胞特别为哺乳动物宿主细胞，其中尤其非常优选人宿主细胞，这些宿主细胞可 以是分离的细胞或组织培养物。在经遗传修饰的动物模型的情况下，经转化的宿主细胞甚 至可包含在非人动物自身的体内。
[0036] 在某些实施方案中，还预期产生包含一种或更多种所公开的rAAV载体的重组非 人宿主细胞和/或分离的重组人宿主细胞可用于多种诊断和实验室方案，包括，例如，用于 产生大量本文所述之rAAV载体的方法。特别预期，与现有的方法，特别是包括需要具有非 常高的效价的病毒原液以用作基因治疗工具的方法相比，这些病毒产生方法有所改善。本 发明人预期，本方法一个非常显著的优点是在哺乳动物转导方案中能够利用具有较低效价 的病毒颗粒，并且还能使转染率保持在适当水平。
[0037] 包含一种或更多种所公开的rAAV载体、表达系统、感染性AAV颗粒或宿主细胞的 组合物也形成了本发明的一部分，特别是还包含至少第一可药用赋形剂的用于治疗以及用 于制备用于治疗一种或更多种哺乳动物疾病、病症、功能障碍或创伤之药物的那些组合物。 这些药物组合物还可任选地包含一种或更多种稀释剂、缓冲剂、脂质体、脂类，脂类复合物； 或者，酪氨酸修饰的rAAV载体可包含在微球体或纳米颗粒中。特别优选适于肌内、静脉内 或直接注射入人或其他哺乳动物的器官或组织或者多个细胞或组织中的药物制剂，然而， 本文公开的组合物还可用于向哺乳动物体的离散区域（discreet area)施用，包括，例如， 适用于直接注射入体内的一种或更多种器官、组织或细胞类型的制剂。这些注射部位包括， 但不局限于，脑、关节或关节囊、滑膜或亚滑膜（subsynovium)组织、腱、韧带、软骨、骨、哺 乳动物关节的关节周围肌肉或关节间隙，以及向患者体内的器官（例如心脏、肝、肺、胰腺、 肠、脑、膀胱、肾或其它部位）直接施用，包括，例如，经由腹内、胸内、血管内或脑室内递送 引入病毒载体。
[0038] 本发明的另一些方面涉及包含一种或更多种本文公开的rAAV载体或者本质上由 或由一种或更多种本文公开的rAAV载体组成的重组腺相关病毒病毒体颗粒、组合物和宿 主细胞，例如，旨在通过合适的方法，例如，肌内、静脉内、关节内或直接注射入选择的哺乳 动物的一种或更多种细胞、组织或器官来向哺乳动物施用之载体的药物制剂。通常，这些组 合物可利用下文所述的可药用赋形剂来配制，并且可包含一种或更多种脂质体、脂质、脂质 复合物、微球体或纳米颗粒制剂以有助于向选择的需要治疗的器官、组织和细胞施用。
[0039] 药盒也代表本公开的优选方面，所述药盒包含一种或更多种公开的rAAV载体、病 毒体、病毒颗粒、转化的宿主细胞或包含它们的药物组合物，以及在治疗、诊断或临床实施 方案中使用药盒的说明书。所述药盒还可包含一种或更多种试剂、限制性酶、肽、治疗剂、药 物化合物或用于递送组合物至宿主细胞，或至动物的装置（例如，注射器、可注射物等）。这 些药盒可以是用于治疗、预防或改善疾病、缺乏（deficiency)、功能障碍和/或损伤之症状 的治疗药盒，并且可包含一种或更多种经修饰的rAAV载体构建体、表达系统、病毒颗粒或 多种这样的颗粒以及在治疗和/或诊断医疗方案中使用所述药盒的说明书。这些药盒还可 用于大规模生产方法中以产生大量用于商业销售或通过其他人使用的病毒载体本身（在 其中含或不含其编码的治疗剂的情况下），所述其他人包括，例如，病毒学家、医疗专业人员 等。
[0040] 本发明的另一重要方面涉及本文所述并公开的rAAV载体、病毒体、表达系统、组 合物和宿主细胞在制备用于预防、治疗或改善动物（例如脊椎哺乳动物）中多种疾病、功能 障碍或缺乏之症状的药物中的使用方法。这些方法一般包括以足以预防、治疗或减轻患病 动物中疾病、功能障碍或缺乏的症状的量和时间向有此需要的哺乳动物或人施用一种或更 多种公开的载体、病毒体、病毒颗粒、宿主细胞、组合物或它们中的多种。方法还可涵盖在诊 断之后，或在症状发作前，预防性治疗怀疑患有这些病症的动物，或向具有发生这些病症之 风险的那些动物施用这样的组合物。
[0041] 如上所述，外源多核苷酸将优选编码一种或更多种蛋白质、多肽、肽、核酶或反义 寡核苷酸或其组合。事实上，在需要时，外源多核苷酸可编码两种或更多种这样的分子，或 多种这样的分子。当需要进行联合基因治疗时，可由单个rAAV表达系统产生两种或更多种 不同的分子，或者可利用两种或更多种独特的rAAV表达系统转染选择的宿主细胞，各表达 系统中均提供编码至少两种不同所述分子的独特异源多核苷酸。
[0042] 在另一些实施方案中，本发明还涉及其包含在感染性腺相关病毒颗粒中、包含在 一种或更多种药物载剂中并且可被配制成用于向哺乳动物（例如人）施用以用于治疗性和 /或预防性基因治疗方案的公开的rAAV载体。这些载体还可包含在可用于向选择的家畜、 驯养动物、宠物等兽医施用的药物制剂中。
[0043] 本发明还涉及包含公开的rAAV载体和表达系统的宿主细胞，特别是哺乳动物宿 主细胞，其中特别优选人宿主细胞。
[0044] 包含一种或更多种公开的rAAV载体、表达系统、感染性AAV颗粒、宿主细胞的组合 物也形成了本发明的一部分，特别是还包含用于制备药物的以及用于涉及治疗性施用这些 rAAV载体之方法的至少第一可药用赋形剂的那些组合物。这些药物组合物还可任选地包含 脂质体、脂质、脂质复合物；或者，rAAV载体可包含在微球体或纳米颗粒中。特别优选适用 于肌内、静脉内或直接注射入人的器官或组织的药物制剂。
[0045] 本发明的另一些方面涉及包含一种或更多种本文公开的AAV载体的重组腺相关 病毒病毒体颗粒、组合物和宿主细胞，例如，意图通过合适的手段，例如，经肌内、静脉内或 直接注射入选择的哺乳动物的细胞、组织或器官来向哺乳动物施用之载体的药物制剂。通 常，这些组合物可利用下文所述的可药用赋形剂来配制，并且可包含一种或更多种脂质体、 脂质、脂质复合物、微球体或纳米颗粒制剂以有助于向选择的需要治疗的器官、组织和细胞 施用。
[0046] 药盒也代表本公开的优选方面，所述药盒包含一种或更多种公开的载体、病毒体、 宿主细胞、病毒颗粒、或组合物；以及（ii)在治疗、诊断或临床实施方案中使用药盒的说明 书。这样的药盒还可包含一种或更多种试剂、限制性酶、肽、治疗剂、药物化合物或用于递送 组合物至宿主细胞，或至动物的装置，例如，注射器、可注射物等。这些药盒可以是用于治疗 或改善特定疾病之症状的治疗药盒，并且通常包含本文所述的一种或更多种经修饰的AAV 载体构建体、表达系统、病毒颗粒或治疗组合物，以及使用所述药盒的说明书。
[0047] 本发明的另一重要方面涉及本文所述并公开的载体、病毒体、表达系统、组合物和 宿主细胞在制备用于治疗或改善哺乳动物中多种多肽缺乏症状之药物中的使用方法。这些 方法一般包括以足以治疗或改善患病动物中所述缺乏之症状的量和时间向有此需要的哺 乳动物或人施用一种或更多种所公开的载体、病毒体、宿主细胞或组合物。所述方法还可涵 盖在诊断之后，或在症状发作前，预防性治疗怀疑患有这些病症的动物，或向具有发生这些 病症之风险的那些动物施用这样的组合物。
[0048] 序列说明
[0049] SEQ ID NO :1是野生型腺相关病毒血清型I (AAVl)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
[0050] SEQ ID NO :2是野生型腺相关病毒血清型2 (AAV2)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
[0051] SEQ ID NO :3是野生型腺相关病毒血清型3 (AAV3)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
[0052] SEQ ID NO :4是野生型腺相关病毒血清型4 (AAV4)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
[0053] SEQ ID NO :5是野生型腺相关病毒血清型5 (AAV5)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
[0054] SEQ ID NO :6是野生型腺相关病毒血清型6 (AAV6)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
[0055] SEQ ID NO :7是野生型腺相关病毒血清型7 (AAV7)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
[0056] SEQ ID NO :8是野生型腺相关病毒血清型8 (AAV8)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
[0057] SEQ ID NO :9是野生型腺相关病毒血清型9 (AAV9)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
[0058] SEQ ID NO : 10是野生型腺相关病毒血清型IO(AAVlO)的衣壳蛋白的氨基酸序列；
[0059] SEQ ID NO : 11是根据本发明使用的寡核苷酸引物序列；以及
[0060] SEQ ID NO :12是根据本发明使用的寡核苷酸引物序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0061] 图1示出了哺乳动物宿主细胞内AAV2运输的示例性图解模型；
[0062] 图 2A-1、图 2A-2、图 2A-3、图 2B-1、图 2B-2、图 2B-3、图 2C-1、图 2C-2、图 23-3、图 2D-1、图2D-2和图2D-3示出了野生型AAV1-10衣壳的氨基酸比对。图2A-1和图2A-2示 出了野生型AAV1-10血清型衣壳的氨基酸比对（从SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :10)。图 2B-1、图2B-2和图2B-3示出了野生型AAV1-12衣壳中保守的表面暴露的赖氨酸残基以及 氨基酸修饰的一些实施方案。AAV1-12中保守的赖氨酸残基以粗体示出。图2C-1至图2C-3 示出了野生型AAV1-10血清型衣壳的氨基酸比对，以及AAV1-10血清型衣壳中保守的表面 暴露的酪氨酸残基（保守的表面暴露的残基以粗体示出）。图2D-1至图2D-3示出了野生 型AAV1-10血清型衣壳的氨基酸比对，以及AAV1-10血清型衣壳中保守的表面暴露的丝氨 酸和苏氨酸残基（保守的表面暴露的残基以粗体示出）；
[0063] 图3A和图3B示出了多种激酶抑制剂对HEK293细胞中ssAAV和scAAV介导的EGFP 表达的影响。在感染前，用抑制剂预处理细胞1小时，然后以IXlO3Vgs/细胞转导。图3A: 感染后48小时，通过荧光显微术检测转基因表达。图3B :如本文中所述分析来自三个视野 的图像。相对于野生型AAV2, * P < 0. 005、* * P < 0. 001 ;
[0064] 图4A和图4B示出了用单个定点的AAV2衣壳突变体转导293细胞后，对EGFP表 达的分析。用缬氨酸（V)替换AAV2衣壳中15个表面暴露的丝氨酸（S)中的每一个，并评 价其介导转基因表达的效率。图4A :在以I X IO3Vgs/细胞的MOI感染后48小时时的EGFP 表达分析。图4B :定量各丝氨酸突变体AAV2载体的转导效率。相对于野生型AAV2, * P < 0· 005、* * P < 0· 001 ;
[0065] 图5示出了多种丝氨酸-缬氨酸突变体AAV2载体相对于野生型（WT) AAV2载体的 包装和转导效率。简言之，对于每个突变体AAV载体至少进行两次载体包装和感染性测定。 通过定量PCR分析确定包装效率。通过荧光强度估计转导效率。*在测试MOI下未检测到 荧光；
[0066] 图6A和图6B不出了对用不同氨基酸替换AAV2衣壳中662位上的丝氨酸在介导 转基因表达中之影响的评价。利用不同氨基酸产生了下列8个丝氨酸突变体：S662 -缬 氨酸（V)、S662 -丙氨酸（A)、S662 -天冬酰胺（N)、S662 -天冬氨酸（D)、S662 -组氨酸 (H)、S662 -异亮氨酸（I)、S662 -亮氨酸（L)和S662 -苯丙氨酸（F)，并对其在293细胞 中的转导效率进行分析。图6A :在以I X IO3Vgs/细胞的MOI感染293细胞后48小时时的 EGFP表达分析。图6B :定量各丝氨酸突变体AAV2载体的转导效率。相对于野生型AAV2， * P < 0· 005、* * P < 0· 001 ;
[0067] 图7图示了根据本发明的一个方面的示例性丝氨酸突变体载体的包装和转导效 率，其相对于野生型（WT) AAV2载体已经由不同氨基酸替换。如上所述进行包装和感染性测 定。V =结I氨酸；A =丙氨酸；D =天冬氨酸；F =苯丙氨酸；H =组氨酸；N =天冬酰胺；L = 亮氨酸；和I =异亮氨酸；
[0068] 图8A和图8B示出了对多种细胞类型中AAV2-S662V载体之转导效率与p38MAPK 活性相关性的分析。图8A :定量WT-和S662V-AAV2载体在293、HeLa、N1H3T3、H2. 35和 moDC中的转导效率。图8B :WeStern印迹分析来自不同细胞系的裂解物以分析p-p38MAPK 表达水平。测量总P38MAPK和GAPDH水平，并将其作为上样对照。相对于野生型AAV2, * P < 0· 005、* * P < 0· 001 ;
[0069] 图9A、图9B和图9C证明根据本发明的一个方面的来自单核细胞的树突细胞 (moDC)中AAV载体介导的转基因表达。图9A示出了 JNK和P38MAPK抑制剂以及662位 丝氨酸残基的定点替换对EGFP表达的影响。图9B提供了感染并开始成熟后48小时时 图9A中数据的定量。图9C示出了对用根据本发明的一种特定载体AAV2-S662V以MOI为 5 X IO4Vgs/细胞感染的moDC中共刺激标志物（例如⑶80、⑶83、⑶86)之表达的代表性分 析。将用细胞因子刺激并本文所述产生的iDC (未成熟树突细胞）和mDC (成熟树突细胞） 分别用作阴性和阳性对照。示出了一个代表性实例。相对于野生型AAV2, * P < 0. 005、* ★ P < 0· OOlo
[0070] 图10图示了 hTERT-特异性细胞毒性T-淋巴细胞（CTL)对K562细胞之杀伤活性 的分析。CTL在用编码截短的人端粒酶（hTERT)的AAV2-S662V载体转导moDC后产生。用 经AAV2-S662V-EGFP载体转导的moDC来产生非特异性CTL。用绿色荧光膜染色剂3, 3-双 十八烷基氧杂羰花青（DiOC 18(3))预染色，将IX IO5个靶K562细胞与不同比率的CTL过 夜共培养（在该说明性实例中为80 : 1、50 : 1、20 : 1、10 : 1和5 : 1)。添加可渗透膜 的核酸复染剂碘化丙啶以标记质膜受到损害的细胞。通过流式细胞术分析杀伤的双染阳性 细胞的百分数；
[0071] 图IlA和图IlB证明在根据本发明的一个方面制备的示例性scAAV载体中，表面 暴露之丝氨酸残基的定点诱变提高了 293细胞的转导效率；
[0072] 图12A和图12B揭示在根据本发明的一个方面制备的示例性scAAV载体中，表面 暴露之苏氨酸残基的定点诱变提高了 293细胞的转导效率；
[0073] 图13A和图13B说明，当根据本文所述的方法制备和使用特定的示例性scAAV 载体时，表面暴露之丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基示例性组合的定点诱变也显著提高 H2. 35细胞的转导效率；
[0074] 图14A、图14B、图14C、图14D和图14E证明小鼠体内AAV载体诱导的先天性免疫 应答。图14A示出对先天性免疫介质（mediator)进行基因表达谱分析，并示出了在2小时 时间点比较含有Bayll的AAV载体（阴影或空心柱）与不含Bayll的AAV载体（黑色或灰 色柱）的基因表达之倍数变化的数据。最小阈值提高倍数（水平黑色线）是2. 5。图14B 示出了在有或无预先施用Bayll的情况下，模拟注射或注射scAAV载体9小时后对来自小 鼠的肝勾衆的Western印迹分析。通过使用抗p52抗体分析样品以检测响应于AAV暴露的 NF-kB信号转导。使用抗β-肌动蛋白抗体作为上样对照。图14C示出了在不存在或存 在NF- κ B抑制剂的情况下，对示例性AAV载体的体液应答。在有或无预先施用Bayll的情 况下，在注射scAAV载体后第10天确定小鼠外周血液中的抗-AAV2IgG2a水平（每组η = 4)。图14D示出了在通过尾静脉各自注射I X IO11Vgs的WT-scAAV-EGFP或TM-scAAV-EFGP 载体/动物后10天，鼠肝细胞中的转基因表达。图14E图示了对来自图14D所示研宄之代 表性数据的定量分析。
[0075] 图15A、图15B、图15C和图15D图示了 T47D和T47D+hHGFR细胞中AAV3介导的 转基因表达。图15A :在相同条件下，利用多个指定的感染复数的scAAV3-CBAp-EGFP载体 感染相等数目的T47D和T47D+hHGFR细胞。感染后72小时通过荧光显微术确定转基因表 达。图15B :在不存在或存在5 μ g/L hHGF的情况下，用2, OOOvgs/细胞的scAAV3载体转 导T47D+hHGFR细胞。如上所述确定转基因表达。图15C:示出了 HGFR激酶特异性抑制剂 BMS-777607(BMS)对AAV3介导的转基因表达的影响。用BMS模拟处理或预处理T47D和 T47D+hHGFR细胞2小时。制备全细胞裂解物，并使用多种指定的第一抗体在Western印迹上 进行分析，使用β-肌动蛋白作为上样对照。图15D:示出了 WT以及单、双和三酪氨酸突变 体AAV3载体的转导效率。在相同条件下，用WT或多种指定的Y-F突变体scAAV3-CBAp-EGFP 载体转导Huh7细胞；
[0076] 图 16 示出了对 AAV2-K544E、AAV2-K556E、AAV2-K544/566E 和 AAV2-Y444/500/730F 之转基因表达的量化；
[0077] 图17A、图17B、图17C、图17D和图17E图示了 WT-和赖氨酸-突变体scAAV8载体 在体内原代肝细胞中的转导效率（C57BL/6小鼠 ；IX 101(lSCAAV-2-CBAp-FluC载体；经尾静 脉注射；2周）（实验2);
[0078] 图18表示对根据本发明的一个方面的AAV8-K530E、AAV8-K547E和AAV8-K569E之 转基因表达的量化；
[0079] 图19A和图19B示出了 WT-和赖氨酸-突变体scAAV2载体在体内原代肝细胞中 的转导效率（C57BL/6小鼠 ；IX 101(lSCAAV-2-CBAp-EGFP载体；经尾静脉注射；2周）；
[0080] 图20A和图20B示出了根据本发明的一个方面的WT-和示例性赖氨酸-或酪氨 酸替换的突变体scAAV2载体在涉及体内原代肝细胞之研宄中的转导效率（C57BL/6小鼠； I X IowScAAVj-CBAp-Fluc载体；经尾静脉注射；2周）；
[0081] 图21A、图21B、图21C、图21D、图21E、图21F、图21G、图21H和图211示出了根据 本发明的一个方面的含有WT-和示例性赖氨酸突变体之衣壳的SCAAV2载体在体外HeLa细 胞中的转导效率（2, OOOvgs/细胞；48小时）；
[0082] 图22A、图22B、图22C、图22D、图22E、图22F、图22G、图22H和图221示出根据本 发明的一个方面的表面暴露的丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基之组合的定点诱变提高了 scAAV载体转导来自单核细胞之树突细胞的效率；
[0083] 图23A、图23B、图23C、图23D、图23E和图23F示出了根据本文所公开方法制备之 示例性AAV2赖氨酸突变体在体外HeLa和HEK 293细胞中的转导效率（MOI 2000)。基因表 达的相对提高倍数作为插图（insert)示出；
[0084] 图24示出了 WT-和示例性赖氨酸突变之表达衣壳的scAAV8载体在鼠体内肝细胞 中的转导效率（C57BL/6小鼠 ；IX 101(lSCAAV-2-CBAp-FluC载体；经尾静脉注射；2周）（实 验1);以及
[0085] 图25示出了通过表达特定赖氨酸替换的衣壳蛋白突变体之示例性AAV8载体的转 基因表达的量化。示出了代表性构建体AAV8-K530E、AAV8-K547E和AAV8-K569E。
【具体实施方式】
[0086] 本发明提供了包含VP3区中表面暴露之赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基 之一或其组合的修饰的AAV衣壳蛋白。本发明还提供了包含本文公开的一种或更多种AAV 衣壳蛋白突变的rAAV病毒体以及编码本发明之AAV衣壳蛋白的核酸分子和rAAV载体。有 利地，与野生型rAAV载体和病毒体相比，本发明的rAAV载体和病毒体具有提高的多种目的 细胞、组织和器官的转导效率，和/或降低了对所述载体的宿主免疫应答。
[0087] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码AAV衣壳蛋白之核苷酸序列的核酸分 子，其中AAV衣壳蛋白的VP3区包含对应于野生型AAV衣壳蛋白[例如，SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9或SEQ ID NO : 10 ;在一个特定示例性实施方案中，为野生型AAV2衣壳 蛋白（SEQ ID NO :2)]之VP3区中一个或更多个赖氨酸残基的一个或更多个位置上的非赖 氨酸残基，其中野生型AAV之VP3区中的一个或更多个赖氨酸残基选自图2A和图2B中所 示的一个或更多个赖氨酸残基。
[0088] 在一个特定实施方案中，对对应于野生型AAV衣壳蛋白[例如，SEQ ID NO :1-10 ; 在一个实施方案中，为野生型AAV2衣壳蛋白（SEQ ID N0:2)]之选自K258、K321、K459、 Κ490、Κ507、Κ527、Κ572、Κ532、Κ544、Κ549、Κ556、Κ649、Κ655、Κ665 和 Κ706 的一个或更多个 赖氨酸残基的一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基进行修饰。
[0089] 在一个实施方案中，对对应于野生型AAV2衣壳序列之Κ532的表面暴露的赖氨酸 残基进行修饰。在一个实施方案中，将AAV衣壳之表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸（E) 或精氨酸（R)。在一个特定实施方案中，将对应于野生型AAV2衣壳序列之Κ532的表面暴露 的赖氨酸残基变更为精氨酸（K532R)。
[0090] 在某些实施方案中，对对应于野生型AAV2衣壳序列之Κ490、Κ544、Κ549和Κ556的 一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基进行修饰。在某些特定实施方案中，将对应于野生型 AAV2衣壳序列之Κ490、Κ544、Κ549和Κ556的一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基变更为 谷氨酸（E)。
[0091] 在一个实施方案中，本发明提供了 AAV2载体，其中将对应于野生型AAV2衣壳之 Κ544和Κ556残基的表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸（E)。
[0092] 在某些实施方案中，对对应于野生型AAV8衣壳序列之Κ530、Κ547和Κ569的一个 或更多个表面暴露的赖氨酸残基进行修饰。在某些特定实施方案中，将对应于野生型AAV2 衣壳序列之Κ530、Κ547和Κ569的一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸（E) 或精氨酸（R)。
[0093] 此外，本发明提供了转导目的细胞、组织和/或器官的方法，包括向细胞中引入包 含有效量的本发明之rAAV载体和/或病毒体的组合物。
[0094] AAV衣壳上表面暴露之赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基的磷酸化可导致 载体的泛素化/蛋白酶体降解。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶参与广泛的多种细胞过程，包括 细胞分化、转录调控和发育。病毒衣壳上表面暴露之丝氨酸和/或苏氨酸残基的磷酸化诱 导载体发生蛋白酶体介导的载体降解，并降低载体转导效率。细胞表皮生长因子受体蛋白 酪氨酸激酶（EGFR-PTK)也在表面酪氨酸残基处使衣壳磷酸化，并由此对通过重组AAV2载 体的核转运以及随后的转基因表达产生不利影响。
[0095] 鉴定AAV衣壳上表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基（图2A、图 2B、图2C和图2D)。例如，野生型AAV2衣壳蛋白的VP3区包含多个表面暴露的赖氨酸（K) 残基（K258、K321、K459、K490、K507、K527、K572、K532、K544、K549、K556、K649、K655、K665、 1(706)、表面暴露的丝氨酸（5)残基（5261、5264、5267、5276、5384、5458、5468、5492、5498、 5578、5658、5662、5668、5707、5721)、表面暴露的苏氨酸（1')残基〇'251、了329、了330、了454、 T455、T503、T550、T592、T581、T597、T491、T671、T659、T660、T701、T713、T716)以及表面 暴露的酪氨酸残基（Y252、Y272、Y444、Y500、Y700、Y704、Y730)。如图 2A、图 2B、图 2C 和图 2D所示，衣壳的这些表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基在AAV1-12中高 度保守。
[0096] 对表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基进行定点诱变，结果显示 表面暴露的残基之一或组合的修饰或替换可使得AAV载体能够避开泛素化和蛋白酶体介 导的降解步骤，从而产生具有较高转导效率的新AAV载体。AAV衣壳上表面暴露的酪氨酸 残基的替换使得载体能够避开泛素化，从而抑制蛋白酶体介导的降解。尽管磷酸化的AAV 载体可与其未磷酸化的对应物一样有效地进入细胞，但是其转导效率显著下降。由于单链 AAV(ssAAV)和自身互补的AAV(rAAV)载体两者的转导效率均下降，所以该下降并非归因于 受损的病毒第二链DNA合成。
[0097] 与野生型（WT)AAV载体相比，包含表面暴露的酪氨酸残基中之点突变的重组AAV 载体在较低剂量下具有较高的转导效率。
[0098] 此外，根据本发明，⑴与WT AAV2载体相比，用缬氨酸（V)残基定点诱变AAV2衣 壳上15个表面暴露的丝氨酸（S)残基导致S458V、S492V和S662V突变体载体的转导效率提 高；（ii) S662V突变体载体有效地转导原代人单核细胞来源的树突细胞（moDC)，该细胞类 型不易通过常规的AAV载体进行转导；（iii) S662V突变体对moDC的高效转导未诱导这些 细胞中的任何表型变化；以及（iv)携带截短的人端粒酶（hTERT)基因的重组S662V-rAAV 载体转导的DC导致迅速的特异性的T细胞克隆增殖并产生稳健（robust)的CTL，其导致 K562细胞的特异性细胞裂解。上述结果证明本发明之丝氨酸修饰的rAAV2载体导致moDC 的高效率转导。
[0099] 在肿瘤免疫治疗背景下，T细胞激活的时间以及CD8T细胞应答的效力和寿命是确 定治疗效果的关键因素。根据本发明，丝氨酸突变体AAV2载体转导moDC的效率提高导致 T细胞优良的致敏（superior priming)。使用人端粒酶作为特异性靶标，因为临床研宄已 经表明对很多癌症患者来说，人端粒酶是广泛表达之排斥抗原的引人注目的候选。此外， S662V突变体载体的转导效率还可通过用JNK和p38MAPK的特异性抑制剂预处理细胞来增 强，表明AAV2衣壳上一个或更多个表面暴露的苏氨酸（T)残基最可能被这些激酶磷酸化。
[0100] 重组AAV载体和病毒体
[0101] 本发明的一个方面提供了包含VP3区中表面暴露之赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或 酪氨酸残基之一或其组合的修饰的AAV衣壳蛋白。本发明还提供了包含本发明之AAV衣壳 蛋白的rAAV病毒体以及编码本发明之AAV衣壳蛋白的核酸分子和rAAV载体。有利地，与 野生型rAAV载体和病毒体相比，本发明的rAAV载体和病毒体具有提高的多种目的细胞、组 织和器官的转导效率。
[0102] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码AAV衣壳蛋白之核苷酸序列的核酸分 子，其中AAV衣壳蛋白的VP3区中包含表面暴露之赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残 基之一或其组合的修饰。有利地，表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基的 修饰防止或降低了 AAV载体的泛素化水平，从而防止或降低蛋白酶体介导的降解的水平。 此外，根据本发明，表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基的修饰提高了转 导效率。
[0103] 在一个实施方案中，含有编码AAV衣壳蛋白之核苷酸序列的核酸分子，其中AAV衣 壳蛋白的VP3区包含下列特征之一或其组合：
[0104] (a)
[0105] (i)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中赖氨酸残基的一个或更多个位置 上的非赖氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的赖氨酸残基选自K258、K321、K459、 K490、K507、K527、K572、K532、K544、K549、K556、K649、K655、K665 和 K706，其中所述非赖氨 酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0106] (ii)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中赖氨酸残基的一个或更多个位置 上的经化学修饰的赖氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的赖氨酸残基选自K258、 K321、K459、K490、K507、K527、K572、K532、K544、K549、K556、K665、K649、K655 和 K706,其 中所述经化学修饰的赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0107] (iii)在对应于野生型MV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV8的衣壳蛋白（SEQ ID NO :8))之VP3区中赖氨酸残基的一个或更多个位置上 的非赖氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的赖氨酸残基选自K530、K547和K569， 其中所述非赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0108] (iv)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV8的衣壳蛋白（SEQ ID NO :8))之VP3区中赖氨酸残基的一个或更多个位置上 的经化学修饰的赖氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的赖氨酸残基选自K530、K547 和Κ569,其中所述经化学修饰的赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0109] (b)
[0110] (i)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中丝氨酸残基的一个或更多个位置 上的非丝氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的丝氨酸残基选自S261、S264、S267、 S276、S384、S458、S468、S492、S498、S578、S658、S662、S668、S707 和 S721，其中所述非丝氨 酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0111] (ii)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中丝氨酸残基的一个或更多个位置 上的经化学修饰的丝氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的丝氨酸残基选自S261、 S264、S267、S276、S384、S458、S468、S492、S498、S578、S658、S662、S668、S707 和 S721，其 中所述经化学修饰的丝氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0112] (c)
[0113] (i)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中苏氨酸残基的一个或更多个位置 上的非苏氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的苏氨酸残基选自T251、T329、T330、 T454、T455、T503、T550、T592、T581、T597、T491、T671、T659、T660、T701、T713 和 T716,其 中所述非苏氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0114] (ii)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中苏氨酸残基的一个或更多个位置 上的经化学修饰的苏氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的苏氨酸残基选自T251、 T329、T330、T454、T455、T503、T550、T592、T581、T597、T491、T671、T659、T660、T701、T713 和T716,其中所述经化学修饰的苏氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0115] (d)
[0116] (i)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中酪氨酸残基的一个或更多个位置 上的非酪氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的酪氨酸残基选自Y252、Y272、Y444、 Y500、Y700、Y704和Y730,其中所述非酪氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化； 和/或
[0117] (ii)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中酪氨酸残基的一个或更多个位置 上的经化学修饰的酪氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的酪氨酸残基选自Y252、 Y272、Y444、Y500、Y700、Y704和Y730,其中所述经化学修饰的酪氨酸残基不导致AAV载体 的磷酸化和/或泛素化。
[0118] 在另一实施方案中，本发明提供了含有编码AAV衣壳蛋白之核苷酸序列的核酸分 子，其中对VP3区中的一个或更多个表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基 进行如下修饰：
[0119] (a)
[0120] (i)对VP3区中的至少一个赖氨酸残基进行化学修饰或将其变更为非赖氨酸残 基，其中经修饰的残基对应于野生型AAV衣壳序列[例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方 案中，为野生型 AAV2 的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2)]的 K258、K321、K459、K490、K507、K527、 Κ572、Κ532、Κ544、Κ549、Κ556、Κ649、Κ655或Κ706,其中所述非赖氨酸残基或所述经化学修 饰的赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0121] (ii)
[0122] 对VP3区中的至少一个赖氨酸残基进行化学修饰或将其变更为非赖氨酸残基，其 中经修饰的残基对应于野生型AAV衣壳序列[例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方案中， 为野生型AAV8的衣壳蛋白（SEQ ID N0:8)]的K530、K547或K569,其中所述非赖氨酸残基 或所述经化学修饰的赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0123] (b)对VP3区中的至少一个丝氨酸残基进行化学修饰或将其变更为非丝氨酸残 基，其中经修饰的残基对应于野生型AAV衣壳序列[例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方 案中，为野生型 AAV2 的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2)]的 S261、S264、S267、S276、S384、S458、 S468、S492、S498、S578、S658、S662、S668、S707或S721，其中所述非丝氨酸残基或所述经 化学修饰的丝氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0124] (c)对VP3区中的至少一个苏氨酸残基进行化学修饰或将其变更为非苏氨酸残 基，其中经修饰的残基对应于野生型AAV衣壳序列[例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方 案中，为野生型 AAV2 的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2)]的 T251、T329、T330、T454、T455、T503、 Τ550、Τ592、Τ581、Τ597、Τ491、Τ671、Τ659、Τ660、Τ701、Τ713 或 Τ716,其中所述非苏氨酸残 基或所述经化学修饰的苏氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；以及
[0125] (d)对VP3区中的至少一个酪氨酸残基进行化学修饰或将其变更为非酪氨酸残 基，其中经修饰的残基对应于野生型AAV衣壳序列[例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方 案中，为野生型 AAV2 的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2)]的 ￥252、￥272、￥444、￥500、￥700、￥704 或 Y730,其中所述非酪氨酸残基或所述经化学修饰的酪氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和 /或泛素化。
[0126] 本发明还提供了具有一个或更多个表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪 氨酸残基修饰的AAV P3衣壳蛋白。在一个实施方案中，本发明提供了包含下列特征之一或 其组合的AAV VP3衣壳蛋白：
[0127] (a)
[0128] (i)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中赖氨酸残基的一个或更多个位置 上的非赖氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的赖氨酸残基选自K258、K321、K459、 K490、K507、K527、K572、K532、K544、K549、K556、K649、K655、K665 和 K706，其中所述非赖氨 酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0129] (ii)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中赖氨酸残基的一个或更多个位置 上的经化学修饰的赖氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的赖氨酸残基选自K258、 K321、K459、K490、K507、K527、K572、K532、K544、K549、K556、K649、K655、K665 和 K706,其 中所述经化学修饰的赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0130] (iii)在对应于野生型MV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV8的衣壳蛋白（SEQ ID NO :8))之VP3区中赖氨酸残基的一个或更多个位置上 的非赖氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的赖氨酸残基选自K530、K547和K569， 其中所述非赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0131] (iv)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV8的衣壳蛋白（SEQ ID NO :8))之VP3区中赖氨酸残基的一个或更多个位置上 的经化学修饰的赖氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的赖氨酸残基选自K530、K547 和Κ569,其中所述经化学修饰的赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0132] (b)
[0133] (i)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中丝氨酸残基的一个或更多个位置 上的非丝氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的丝氨酸残基选自S261、S264、S267、 S276、S384、S458、S468、S492、S498、S578、S658、S662、S668、S707 和 S721，其中所述非丝氨 酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0134] (ii)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中丝氨酸残基的一个或更多个位置 上的经化学修饰的丝氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的丝氨酸残基选自S261、 S264、S267、S276、S384、S458、S468、S492、S498、S578、S658、S662、S668、S707 和 S721，其 中所述经化学修饰的丝氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0135] (c)
[0136] (i)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中苏氨酸残基的一个或更多个位置 上的非苏氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的苏氨酸残基选自T251、T329、T330、 T454、T455、T503、T550、T592、T581、T597、T491、T671、T659、T660、T701、T713 和 T716,其 中所述非苏氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0137] (ii)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中苏氨酸残基的一个或更多个位置 上的经化学修饰的苏氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的苏氨酸残基选自T251、 T329、T330、T454、T455、T503、T550、T592、T581、T597、T491、T671、T659、T660、T701、T713 和T716,其中所述经化学修饰的苏氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0138] (d)
[0139] (i)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中酪氨酸残基的一个或更多个位置 上的非酪氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的酪氨酸残基选自Y252、Y272、Y444、 Y500、Y700、Y704和Y730,其中所述非酪氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化； 和/或
[0140] (ii)在对应于野生型AAV衣壳蛋白（例如，SEQ ID NO :1-10 ;在一个实施方案中， 为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2))之VP3区中酪氨酸残基的一个或更多个位置 上的经化学修饰的酪氨酸残基，其中所述野生型AAV之VP3区中的酪氨酸残基选自Y252、 Y272、Y444、Y500、Y700、Y704和Y730,其中所述经化学修饰的酪氨酸残基不导致AAV载体 的磷酸化和/或泛素化。
[0141] 在另一实施方案中，本发明提供了 AAV衣壳蛋白，其中对VP3区中的一个或更多个 表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基进行如下修饰：
[0142] (a)
[0143] (i)对VP3区中的至少一个赖氨酸残基进行化学修饰或将其变更为非赖氨酸残 基，其中经修饰的残基对应于野生型AAV衣壳序列（例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方 案中，为野生型 AAV2 的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2))的 K258、K321、K459、K490、K507、K527、 Κ572、Κ532、Κ544、Κ549、Κ556、Κ649、Κ655、Κ665或Κ706,其中所述非赖氨酸残基或所述经 化学修饰的赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；和/或
[0144] (ii)对VP3区中的至少一个赖氨酸残基进行化学修饰或将其变更为非赖氨酸残 基，其中经修饰的残基对应于野生型AAV衣壳序列（例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方 案中，为野生型AAV8的衣壳蛋白（SEQ ID N0:8))的K530、K547或K569,其中所述非赖氨 酸残基或所述经化学修饰的赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0145] (b)对VP3区中的至少一个丝氨酸残基进行化学修饰或将其变更为非丝氨酸残 基，其中经修饰的残基对应于野生型AAV衣壳序列（例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方 案中，为野生型 AAV2 的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2))的 S261、S264、S267、S276、S384、S458、 S468、S492、S498、S578、S658、S662、S668、S707或S721，其中所述非丝氨酸残基或所述经 化学修饰的丝氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0146] (c)对VP3区中的至少一个苏氨酸残基进行化学修饰或将其变更为非苏氨酸残 基，其中经修饰的残基对应于野生型AAV衣壳序列（例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方 案中，为野生型 AAV2 的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2))的 T251、T329、T330、T454、T455、T503、 Τ550、Τ592、Τ581、Τ597、Τ491、Τ671、Τ659、Τ660、Τ701、Τ713 或 Τ716,其中所述非苏氨酸残 基或所述经化学修饰的苏氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；以及
[0147] (d)对VP3区中的至少一个酪氨酸残基进行化学修饰或将其变更为非酪氨酸残 基，其中经修饰的残基对应于野生型AAV衣壳序列（例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方 案中，为野生型 AAV2 的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2))的 ￥252、￥272、￥444、￥500、￥700、￥704 或 Y730,其中所述非酪氨酸残基或所述经化学修饰的酪氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和 /或泛素化。如图2A、图2B、图2C和图2D所示，位于衣壳蛋白之VP3区中的表面暴露的赖 氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基在多种AAV血清型中高度保守（AAVl至12)。在一 个实施方案中，含有编码AAV衣壳蛋白之核苷酸序列的核酸分子，其中AAV血清型选自AAVl 至12。在某些实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白具有选自SEQ ID NO :1-10的氨基酸序列。
[0148] 在一个特定实施方案中，核酸分子含有编码AAV2衣壳蛋白的核苷酸序列。腺相关 病毒2 (AAV2)为非致病性人细小病毒。已显示，重组AAV2载体转导体外和体内的广泛多种 细胞和组织，并且目前应用于I/II期临床试验中用于多种疾病的基因治疗，例如囊性纤维 化、α-l抗胰蛋白酶缺乏症、帕金森症、巴腾病（Batter^ s disease)和肌营养不良。
[0149] 在一个实施方案中，本发明提供了 AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白含有野生 型AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)，不同之处在于，野生型AAV2衣壳的一个或 更多个氨基酸残基经如下修饰：
[0150] (a)将野生型 AAV2 衣壳序列之选自 K258、K321、K459、K490、K507、K527、K572、 K532、K544、K549、K556、K649、K655、K665和K706的至少一个赖氨酸残基变更为非赖氨酸 残基，或对所述赖氨酸残基进行化学修饰，使得所述非赖氨酸残基或所述经化学修饰的赖 氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0151] (b)将野生型 AAV2 衣壳序列之选自 S261、S264、S267、S276、S384、S458、S468、 S492、S498、S578、S658、S662、S668、S707和S721的至少一个丝氨酸残基变更为非丝氨酸 残基，或对所述丝氨酸残基进行化学修饰，使得所述非丝氨酸残基或所述经化学修饰的丝 氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0152] (c)将野生型 AAV2 衣壳序列之选自 T251、T329、T330、T454、T455、T503、T550、 T592、T581、T597、T491、T671、T659、T660、T701、T713 和 T716 的至少一个苏氨酸残基变更 为非苏氨酸残基，或对所述苏氨酸残基进行化学修饰，使得所述非苏氨酸残基或所述经化 学修饰的苏氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化；
[0153] (d)将野生型 AAV2 衣壳序列之选自 Y252、Y272、Y444、Y500、Y700、Y704 和 Y730 的 至少一个酪氨酸残基变更为非酪氨酸残基，或对所述酪氨酸残基进行化学修饰，使得所述 非酪氨酸残基或所述经化学修饰的酪氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化。在 一个实施方案中，将对应于选自野生型AAV衣壳序列（例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施 方案中，为野生型 AAV2 的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2))之 K532、K459、K490、K544、K549、K556、 Κ527、Κ490、Κ143或Κ137的赖氨酸残基的表面暴露的赖氨酸残基变更为非赖氨酸残基和/ 或对其进行化学修饰，使得所述非赖氨酸残基或所述经修饰的赖氨酸残基不导致AAV载体 的磷酸化和/或泛素化。
[0154] 在另一实施方案中，本发明提供了 AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白含有野生 型AAV8衣壳蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO:8)，不同之处在于，对应于野生型AAV8衣壳之 K530、K547和K569的一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基被变更为非赖氨酸残基（例如， 谷氨酸（Ε)、精氨酸（R))和/或对其进行化学修饰，其中所述非赖氨酸残基或所述经修饰 的赖氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化。在某些实施方案中，将AAV序列之 表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸（E)、精氨酸（R)、丝氨酸（S)或异亮氨酸（I)以避免 AAV载体的磷酸化和/或泛素化。
[0155] 本发明还提供了含有编码本发明AAV衣壳蛋白（例如，VP3)之核苷酸序列的核酸 分子。
[0156] 在一个特定实施方案中，对对应于野生型AAV2衣壳序列之Κ352的表面暴露的赖 氨酸残基进行修饰。在一个实施方案中，将AAV衣壳之表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨 酸（E)或精氨酸（R)。在一个特定实施方案中，将对应于野生型AAV2衣壳序列之Κ532的表 面暴露的赖氨酸残基变更为精氨酸（K532R)。
[0157] 在一个实施方案中，如图2Β所示，对AAV衣壳之对应于野生型AAV2衣壳序列的赖 氨酸位置的至少一个表面暴露的赖氨酸残基进行修饰。
[0158] 在一个实施方案中，将对应于野生型AAV衣壳序列（例如，SEQ ID NO :1-10;在一 个实施方案中，为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2))之选自S662、S261、S468、S458、 S276、S658、S384或S492的丝氨酸残基的至少一个表面暴露的丝氨酸残基变更为非丝氨酸 残基和/或对其进行化学修饰，使得所述非丝氨酸残基或所述经修饰的丝氨酸残基不导致 AAV载体的磷酸化和/或泛素化。
[0159] 在一个特定实施方案中，对对应于野生型AAV2衣壳序列之S662的表面暴露的丝 氨酸残基进行修饰。在一个实施方案中，将AAV衣壳之表面暴露的丝氨酸残基变更为缬氨 酸（V)、天冬氨酸（D)或组氨酸（H)。在一个特定实施方案中，将对应于野生型AAV2衣壳序 列之S662的表面暴露的丝氨酸残基变更为缬氨酸（S662V)。
[0160] 在一个实施方案中，将对应于野生型AAV衣壳序列[例如，SEQ ID NOd-IO ;在一 个特定实施方案中，为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID N0:2)]之选自T455、T491、T550、 Τ659或Τ671的苏氨酸残基的表面暴露的苏氨酸残基变更为非苏氨酸残基和/或对其进行 化学修饰，使得所述非苏氨酸残基或所述经修饰的苏氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和 /或泛素化。
[0161] 在一个特定实施方案中，对对应于野生型AAV2衣壳序列之Τ491的表面暴露的苏 氨酸残基进行修饰。在一个实施方案中，将AAV衣壳之表面暴露的苏氨酸残基变更为缬氨 酸（V)。在一个特定实施方案中，将对应于野生型AAV2衣壳序列之Τ491的表面暴露的苏氨 酸残基变更为缬氨酸（T491V)。
[0162] 在一个实施方案中，AAV载体包含在对应于野生型AAV衣壳序列[例如，SEQ ID NO :1-10;在一个特定实施方案中，为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2)]之 (T550V+T659V+T491V)位置上的表面暴露的苏氨酸残基的修饰。在一个实施方案中，将对应 于野生型AAV衣壳序列（例如，SEQ ID NO :1-10;在一个实施方案中，为野生型AAV2的衣 壳蛋白（SEQ ID N0:2))之选自 ￥252、￥272、￥444、￥500、￥704、￥720、￥730 或￥673 的酪氨 酸残基的表面暴露的酪氨酸残基变更为非酪氨酸残基和/或对其进行化学修饰，使得所述 非酪氨酸残基或所述经修饰的酪氨酸残基不导致AAV载体的磷酸化和/或泛素化。
[0163] 在一个实施方案中，将AAV衣壳之表面暴露的酪氨酸残基变更为苯丙氨酸（F)。 在一个实施方案中，AAV载体包含对应于野生型AAV衣壳序列[例如，SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :10;并且在一个特定实施方案中，为野生型AAV2的衣壳蛋白（SEQ ID NO :2)]之 (Y730F+Y500F+Y444F)位置上的表面暴露的酪氨酸残基的修饰。
[0164] 在一个实施方案中，对AAV衣壳之表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或 酪氨酸残基的组合进行修饰，其中所述修饰发生在对应于野生型AAV衣壳序列[例 如，SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :10;在一个实施方案中，为野生型AAV2的衣壳蛋白 (SEQ ID N0:2)]之（Y444F+Y500F+Y730F+T491V)、（Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T550V)、 (Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T659V), (T491V+T550V+T659V), (Y440F+Y500F+Y730F) (Y444F+Y500F+Y730F+T491V+S662V)和 /或（Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T550V+T659V)的 位置上。还提供了由本发明的核酸分子编码的AAV衣壳蛋白。
[0165] 在一个实施方案中，本发明提供了含有编码本发明AAV衣壳蛋白之核酸序列的重 组腺相关病毒（rAAV)载体。在另一实施方案中，本发明提供了含有本发明之AAV衣壳蛋白 的rAAV病毒体。在一个实施方案中，与野生型rAAV载体和病毒体相比，所述rAAV载体和 病毒体增强了转导效率。在另一实施方案中，所述rAAV载体和病毒体能够有效转导目的细 胞、组织和/或器官。
[0166] 在一个实施方案中，rAAV载体还含有与启动子或任选的其它调控元件有效连接的 转基因（也称为异源核酸分子）。在一个实施方案中，转基因编码目的治疗剂。
[0167] 示例性启动子包括一种或更多种异源的组织特异性的组成型或诱导型启动子，包 括，但不限于，选自以下的启动子：巨细胞病毒（CMV)启动子、结蛋白（DES)、β-肌动蛋白启 动子、胰岛素启动子、稀醇化酶启动子、BDNF启动子，NGF启动子、EGF启动子、生长因子启动 子、轴突特异性启动子、树突特异性启动子、脑特异性启动子、海马特异性启动子、肾特异性 启动子、抑弹性蛋白酶蛋白（elafin)启动子、细胞因子启动子、干扰素启动子、生长因子启 动子、α -1抗胰蛋白酶启动子、脑特异性启动子、神经细胞特异性启动子、中枢神经系统细 胞特异性启动子、外周神经系统细胞特异性启动子、白细胞介素启动子、丝氨酸蛋白酶抑制 蛋白（serpin)启动子、杂合CMV启动子、杂合β-肌动蛋白启动子、EFl启动子、Ula启动 子、Ulb启动子、四环素诱导型启动子和VP16-LexA启动子。在一些示例性实施方案中，启 动子为哺乳动物或鸟类肌动蛋白启动子。
[0168] 示例性增强子序列包括，但不限于，一种或更多种选自以下的增强子：CMV增强 子、合成增强子、肝特异性增强子、血管特异性增强子、脑特异性增强子、神经细胞特异性增 强子、肺特异性增强子、肌肉特异性增强子、肾特异性增强子、胰腺特异性增强子和胰岛细 胞特异性增强子。
[0169] 示例性治疗剂包括，但不限于，选自以下的药剂：多肽、肽、抗体、抗原结合片段、核 酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸和反义多核苷酸。
[0170] 在一些示例性实施方案中，本发明的rAAV载体编码选自以下的治疗性蛋白质或 多肽：肾上腺素能激动剂、抗凋亡因子、凋亡抑制剂、细胞因子受体、细胞因子、细胞毒素、红 细胞生成剂、谷氨酸脱羧酶、糖蛋白类、生长因子、生长因子受体、激素、激素受体、干扰素、 白细胞介素、白细胞介素受体、激酶、激酶抑制剂、神经生长因子、导蛋白（netrin)、神经活 性肽、神经活性肽受体、神经原性因子、神经原性因子受体、神经毡蛋白、神经营养因子、神 经营养蛋白、神经营养蛋白受体、N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂、丛蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制 剂、蛋白质脱羧酶、蛋白激酶、蛋白激酶抑制剂、蛋白水解蛋白、蛋白水解蛋白抑制剂、脑信 号蛋白（semaphorin)、脑信号蛋白受体、血清素转运蛋白、血清素摄取抑制剂、血清素受体、 丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白受体和肿瘤抑制剂。
[0171] 在某些应用中，经修饰的高转导效率载体可包含编码选自以下多肽的核酸片段： BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、GM-CSF、促性腺激素、IFN、IFG-I、M-CSF、NGF、PDGF、PEDF、 TGF、TGF-B2、TNF、VEGF、催乳素、促生长素、XIAPl、IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-10 (187A)、病毒 IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、 IL-17和IL-18。这些治疗剂可来源于人、鼠、鸟类、猪、牛、绵羊、猫、犬、马、印ine、山羊、狼 或灵长类动物。
[0172] 根据本发明使用的重组AAV载体包括单链（ss)或自身互补（sc)的AAV载体。
[0173] 本发明的rAAV载体还可包含在分离的哺乳动物宿主细胞中，所述宿主细胞包括 例如，人、灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊和狼宿主细胞。rAAV载体可 包含在分离的哺乳动物细胞中，所述宿主细胞例如，人内皮细胞、上皮细胞、血管细胞、肝细 胞、肺细胞、心脏细胞、胰腺细胞、肠细胞、肾细胞、心肌细胞（cardiac cell)、癌细胞或肿瘤 细胞、肌肉细胞、骨细胞、神经细胞、血细胞或脑细胞。
[0174] 治疗用途
[0175] 本发明的另一方面涉及本发明的rAAV载体和病毒体用于有效转导目的细胞、组 织和/或器官，和/或用于基因治疗中的用途。
[0176] 在一个实施方案中，本发明提供了转导目的细胞、组织和/或器官的方法，其包括 向细胞中引入包含有效量的本发明之rAAV载体和/或病毒体的组合物。
[0177] 在某些实施方案中，本发明的rAAV载体和病毒体用于转导哺乳动物宿主细胞，包 括例如，人、灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊和狼宿主细胞。在某些实施 方案中，本发明的rAAV载体和病毒体用于转导内皮细胞、上皮细胞、血管细胞、肝细胞、肺 细胞、心脏细胞、胰腺细胞、肠细胞、肾细胞、肌肉细胞、骨细胞、树突细胞、心肌细胞、神经细 胞、血细胞、脑细胞、成纤维细胞或癌细胞。
[0178] 在一个实施方案中，使用本发明之rAAV载体和/或病毒体转导对象的细胞、组织 和/或器官。
[0179] 本文所用的术语"对象"描述可向其提供利用根据本发明之组合物的治疗的生物 体，包括哺乳动物，例如灵长类动物。可从所公开的治疗方法受益的哺乳动物物种包括，但 不限于，猿、黑猩猩、猩猩、人类、猴、驯养动物（例如狗和猫）、家畜（例如马、牛、猪、绵羊、山 羊和鸡）以及其它动物（例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠）。
[0180] 此外，本发明提供了治疗疾病的方法，其中所述方法包括向有此治疗需要的对象 施用有效量的含有本发明之rAAV载体和/或病毒体的组合物。
[0181] 本文所用的术语"治疗"或其任何语法变化包括但不限于，减缓疾病或病症的症 状；和/或减少、压制、抑制、减轻、改善或影响疾病或病症的进展、严重程度和/或范围。
[0182] 本文所用的术语"有效量"指能够治疗或改善疾病或病症或者其他能够产生预期 治疗效果的量。
[0183] 本发明还提供了本文公开的组合物在制备用于治疗、预防或改善疾病、病症、功能 障碍、损伤或创伤之症状的药物中的用途，包括，但不限于，治疗、防止和/或预防疾病、病 症或功能障碍，和/或改善这些疾病、病症或功能障碍的一种或更多种症状。基于rAAV病 毒的基因治疗可特别用于的示例性病症包括，但不限于，癌症、糖尿病、自身免疫性疾病、肾 病、心血管疾病、胰腺疾病、肠疾病、肝病、神经系统疾病、神经肌肉病症、神经运动缺陷、神 经骨骼肌损伤、神经失能、感觉神经功能障碍、中风、α -亚1-抗胰蛋白酶（AAT)缺乏症、巴 腾病、局部缺血、进食障碍（eating disorder)、阿尔茨海默病（Alzheimei^ s disease)、亨 廷顿病（Huntington' s disease)、帕金森病（Parkinson' s disease)、骨豁疾病和肺病。
[0184] 本发明还提供了治疗或改善哺乳动物中这些疾病、损伤、病症或功能障碍之症状 的方法。这些方法一般至少包括以足以治疗或改善哺乳动物中这些疾病、损伤、病症或功能 障碍之症状的量和时间向有此需要的哺乳动物施用一种或更多种本发明的rAAV载体和病 毒体的步骤。
[0185] 这些治疗方案特别考虑用于人治疗中，通过肌内、静脉内、皮下、胸内、腹膜内或通 过直接注射入接受护理之对象的器官或组织中来施用一种或更多种组合物。
[0186] 本发明还提供了以有效地向患者提供治疗有效量之期望的治疗剂的量和时间向 有此需要的哺乳动物提供治疗有效量之本发明的rAAV组合物的方法，所述治疗剂由rAAV 载体中包含的一个或更多个核酸片段编码。优选地，所述治疗剂选自多肽、肽、抗体、抗原结 合片段、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸和反义多核苷酸。
[0187] 药物组合物
[0188] 本发明还提供了治疗或药物组合物，所述组合物包含以与可治疗用或可药用载体 组合的形式的活性成分。本发明的遗传构建体可被制备成多种组合物，并且还可被配制成 合适的药物载剂用于向人或动物对象施用。
[0189] 本发明的rAAV分子及包含它们的组合物提供了新的有用的治疗方法，用于治疗、 控制和改善多种病症，特别是，关节疾病、病症和功能障碍（包括例如骨关节炎、类风湿性 关节炎及相关病症）的症状。
[0190] 本发明还提供了含有一种或更多种所公开的rAAV载体、表达系统、病毒体、病毒 颗粒或哺乳动物细胞的组合物。如下文所述，这些组合物还可包含药物赋形剂、缓冲剂或稀 释剂，并且可被配制成用于向动物，特别是人类施用。这些组合物还可任选地包含脂质体、 脂质、脂质复合物、微球体、微颗粒、纳米球体或纳米颗粒，或其可以以其它方式被配制成用 于向有此需要之对象的细胞、组织、器官或身体施用。这些组合物可被配制成用于多种治疗 中，例如，用于改善、预防和/或治疗病症（例如肽缺乏、多肽缺乏、肽过表达、多肽过表达）， 包括例如导致诸如以下疾病或病症的病症：例如癌症、肿瘤或其它恶性生长、神经缺陷功能 障碍、自身免疫性疾病、关节疾病、心脏病或肺病、局部缺血、中风、脑血管意外、短暂性缺血 发作（transient ischemic attack，TIA);糖尿病和/或其它胰腺疾病；心脏循环疾病或功 能障碍（包括，例如，低血压、高血压、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、血管损害或疾病）；神 经疾病（包括，例如，阿尔兹海默病、亨廷顿病、Tay-SacV s和帕金森病、记忆丧失、创伤、 运动损伤、神经病及相关病症）；胆、肾或肝疾病或功能障碍；肌肉骨骼或神经肌肉疾病（包 括，例如，关节炎、瘫痪、囊性纤维化（cystic fibrosis，CF)、肌萎缩侧索硬化（ALS)、多发性 硬化（MS)、肌营养不良（MD)等）。
[0191] 在一个实施方案中，向哺乳动物施用rAAV载体和/或病毒体颗粒的数目可约为 IO3至10 13颗粒/mL，或其之间的任意值，例如，约10 7、108、109、101(1、1011、IO 12或10 13颗粒/ mL。在一个实施方案中，施用高于IO13颗粒/mL的rAAV载体和/或病毒体颗粒。在需要时， rAAV载体和/或病毒体可作为单次剂量施用，或分成两次或更多次施用以实现对特定疾病 或病症的治疗。在大多数基于rAAV的基因治疗方案中，发明人相信，与常规的基因治疗方 案相比，使用衣壳经修饰的rAAV载体时将需要较低效价的感染性颗粒。
[0192] 在某些实施方案中，本发明涉及本文公开的一种或更多种基于rAAV的组合物在 可药用溶液中的制剂，用于向细胞或动物单独施用或与一种或更多种其它治疗方式组合施 用，特别是用于影响人之人细胞、组织和疾病的治疗。
[0193] 如果需要，可将表达一种或更多种治疗基因产品的核酸片段、RNA、DNA或PNA组合 物与其它药剂（例如，蛋白质或多肽或多种药物活性剂）组合施用，包括一次或更多次全身 或局部施用治疗性多肽、生物活性片段或其变体。事实上，对还可包含的其它成分几乎没有 限制，只要额外的药剂不对与靶细胞或宿主组织的接触造成显著不利的影响即可。因此，在 特定情况需要时，基于rAAV的遗传组合物可与多种其它药剂一起递送。如本文所述，这些 组合物可从宿主细胞或其它生物来源纯化，或者可化学合成。同样地，这些组合物还可包含 替换的或衍生的RNA、DNA、siRNA、mRNA、tRNA、核酶、催化性RNA分子或PNA组合物等。
[0194] 可药用赋形剂和载体溶液的配制为本领域技术人员所公知，在多种治疗方案中 (包括，例如，经口、肠胃外、静脉内、鼻内、关节内、肌内施用和制剂），使用本文所述特定组 合物的合适给药和治疗方案的开发同样为本领域技术人员所公知。
[0195] 通常，这些制剂可包含至少约0. 1%或更多的活性化合物，但是活性成分的百分数 当然可以变化，并且可便利地为总制剂重量或体积的约1%或2%至约70%或80%或更多。 自然地，每种治疗用组合物中活性化合物的量可以这样的方式制备，使得在任意给定单位 剂量的化合物中获得合适的剂量。在制备这些药物制剂时，本领域技术人员应考虑多种因 素，例如溶解性、生物利用率、生物半衰期、施用途径、产品的贮藏期以及其它药理学考虑因 素，因此，多种剂量和治疗方案可能是理想的。
[0196] 在某些情况下，期望地是，经如下途径来递送经适当配制的本文公开的药物组合 物中基于AAV载体的治疗构建体：皮下、眼内、玻璃体内（intravitreally)、肠胃外、皮下、 静脉内、脑室内（intracerebro-ventricularly)、肌内、鞘内、经口、腹膜内，通过口或鼻 吸入或者通过直接注射入一种或更多种细胞、组织或器官。施用方法还可包括美国专利 5, 543, 158、5, 641，515和/或5, 399, 363中所述的那些方式（各专利均明确地通过专门引 用以其整体并入本文）。作为游离碱或可药用盐的活性化合物的溶液可在无菌水中制备，并 且还可与一种或更多种表面活性剂（例如羟丙基纤维素）适当混合。还可在甘油、液体聚 乙二醇和其混合物中以及在油中制备分散体。在普通的贮藏和使用条件下，这些制备物含 有防腐剂以防止微生物生长。
[0197] 适于注射使用之基于AAV的病毒组合物的药物形式包括无菌水溶液或分散体以 及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末（美国专利5, 466, 468,明确地通过 专门引用以其整体并入本文）。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是流体， 从而以易于注射的程度存在。在制备和贮藏条件下，其必须是稳定的，并且必须在抗微生物 (例如细菌和真菌）的污染作用的条件下保存。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如， 水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、其合适的混合物和/或植物油。 例如，可通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散情况下保持所需颗粒大小和通过使用表 面活性剂来保持适当的流动性。
[0198] 术语"载体（carrier) "指随化合物施用的稀释剂、助剂（adiuvant)、赋形剂或载 剂。这些药物载体可以是无菌流体，例如水和油，包括石油（例如矿物油）、植物油（例如花 生油、大豆油和芝麻油）、动物油或合成来源的油。还可采用盐水溶液以及水性葡萄糖和甘 油溶液作为流体载体。
[0199] 本发明的组合物可通过标准途径向治疗对象施用，所述途径包括，但不限于，肺 部、鼻内、经口、吸入、肠胃外（例如静脉内）、表面、经皮、皮内、透粘膜、腹膜内、肌内、囊内、 眶内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注 射。在一些优选实施方案中，经鼻内、肺部或经口途径施用组合物。
[0200] 对于施用可注射水性溶液，例如，可适当缓冲溶液，如有必要，流体稀释剂首先利 用充足的盐水或葡萄糖形成等张。这些特定的水性溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹 膜内施用。就此而言，根据本公开内容，可采用的无菌水性介质为本领域技术人员所知。例 如，可将一个剂量溶解于ImL等张的NaCl溶液中，并将其添加至IOOOmL的皮下灌注流体 中，或在建议的输注部位注射（参见例如，"RemingtoY s Pharmaceutical Sciences"第 15版，1035-1038和1570-1580页）。根据治疗对象的状况，有必要对剂量进行一些改变。 负责施用的人员在任何情况下都要确定对个体对象的合适剂量。此外，对人施用，制剂应满 足FDA生物学标准局（FDA Office of Biologies standards)所要求的无菌性、致热原性 和一般安全性以及纯度标准。
[0201] 如下制备无菌可注射溶液：将活性AAV载体递送之治疗性多肽编码的DNA片段以 所需量并入到含有若干上文列举之其它成分（需要时）的合适的溶剂中，然后过滤灭菌。 通常，如下制备分散体：将多种经灭菌的活性成分并入到无菌载剂中，其含有基本分散介质 和所需的来自上文列举的那些的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况 下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从其预先经无菌过滤的溶液中 产生活性成分加任何另外的所需成分的粉末。
[0202] 还可将本文公开的AAV载体组合物配制成中性形式或盐形式。可药用盐包括酸加 成盐（与蛋白质的游离氨基形成），其是与无机酸（例如盐酸或磷酸）或有机酸（例如乙 酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等）形成的。与游离羧基形成的盐还可来自无机碱（例如，氢氧化 钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁）和有机碱（例如异丙胺、三甲基胺、组氨酸 和普鲁卡因等）。一旦成为制剂，以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用溶液。制 剂易于以多种剂型（例如可注射溶液、药物释放胶囊）等施用。
[0203] AAV组合物的量以及施用该组合物的时间在得益于本教导之技术人员的所知范围 内。然而，可能的是，治疗有效量之公开组合物的施用可通过单次施用实现，例如，单次注射 足够数目的感染性颗粒来为正进行该治疗的患者提供治疗益处。或者，在一些情况下，可期 望在相对较短或相对延长的时间段内提供多次或持续的AAV载体组合物施用，同样地可通 过医疗执业医生监视该组合物的施用来确定。
[0204] 表达载体
[0205] 本发明包括多种基于AAV的表达系统和载体。在一个实施方案中，优选的AAV表 达载体至少包含编码治疗肽、蛋白质或多肽的第一核酸片段。在另一实施方案中，本文公开 的优选AAV表达载体至少包含编码反义分子的第一核酸片段。在另一实施方案中，启动子 有效地与编码功能mRNA、tRNA、核酶或反义RNA的序列区连接。
[0206] 选择哪种表达载体以及最后多肽编码区有效连接到哪种启动子直接取决于所需 的功能特性，例如，蛋白质表达的位置和时间以及待转化的宿主细胞。这些是构建重组DNA 分子领域中固有的公知限制。然而，用于实践本发明的载体能够指引与其有效连接之功能 RNA的表达。
[0207] 已开发多种方法以通过互补的粘性末端或平端将DNA与载体有效连接。例如，可 将互补的同聚物束（tract)添加到待插入的DNA片段和载体DNA。然后，所述载体和DNA片 段通过互补同聚物尾之间的氢键连接，从而形成重组DNA分子。
[0208] 为了表达根据本发明的治疗剂，可制备含有受一个或更多个启动子控制编码治疗 剂之核酸片段的酪氨酸经修饰的rAAV表达载体。为了使序列处于启动子"控制之下"，一般 将转录阅读框之转录起始位点的5'端置于选择的启动子"下游"（即，3'）约1至约50个 核苷酸之间。"上游"启动子刺激DNA转录并促进编码的多肽表达。这就是"重组表达"在 本文中的含义。特别优选的重组载体构建体为包含rAAV载体的那些。这些载体均详细描 述于本文中。
[0209] 当考虑使用这些载体将一种或更多种外源蛋白质、多肽、肽、核酶和/或反义寡核 苷酸引入用所述载体转染的特定细胞中时，可采用本文公开的rAAV载体或酪氨酸经修饰 的rAAV载体，这些载体经遗传修饰成还包含有效位于至少第一异源启动子下游并受其控 制的至少第一外源多核苷酸，所述第一异源启动子在包含载体的细胞中表达多核苷酸以产 生编码的肽、蛋白质、多肽、核酶、siRNA、RNAi或反义寡核苷酸。这些构建体可采用异源启 动子，所述启动子为组成型、诱导型或甚至细胞特异性启动子。示例性这样的启动子包括， 但不限于，病毒、哺乳动物和鸟类（avian)启动子，包括例如，CMV启动子、β -肌动蛋白启动 子、杂合CMV启动子、杂合β -肌动蛋白启动子、EFl启动子、Ula启动子、Ulb启动子、四环 素诱导型启动子、VP16-LexA启动子等。
[0210] 载体或表达系统还可进一步包含一种或更多种增强子、调控元件、转录元件以改 变或影响rAAV载体中克隆的异源基因的转录。例如，本发明的rAAV载体还可包含至少第 一 CMV增强子、合成的增强子或者细胞或组织特异性增强子。外源多核苷酸还可进一步包 含一个或更多个内含子序列。
[0211] 治疗药盒
[0212] 本发明还涵盖一种或更多种本文公开之经遗传修饰的rAAV载体组合物以及一 种或更多种可药用赋形剂、载体、稀释剂、助剂和/或其它组分，因此可应用于配制特定的 rAAV多核苷酸递送制剂，以及制备用于向对象，特别是人施用的治疗剂。特别地，这样的药 盒可包含一种或更多种公开的rAAV组合物与使用病毒载体治疗对象中病症之说明书的组 合，且通常还可包含为方便的商业包装制作的容器。
[0213] 因此，用于施用本文公开之药物组合物的优选动物包括哺乳动物，特别是人。其它 的优选动物包括鼠、牛、马、猪、犬和猫。组合物可包含部分或显著纯化的rAAV组合物，其单 独存在或与一种或更多种另外的活性成分组合，其可从天然或重组来源获得，或者其可天 然地或通过化学合成获得，或者由表达编码这些另外活性成分之DNA片段的重组宿主细胞 在体外产生。
[0214] 还可制备包含至少一种本文公开的组合物以及使用所述组合物作为治疗剂之说 明书的治疗药盒。对于这样的药盒，容器装置通常可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、 注射器或其它容器装置，向其中可放置公开的rAAV组合物，并优选经适当等分。在还提供 了第二治疗性多肽组合物时，所述药盒还可包含其中可放置该第二组合物的第二不同容器 装置。或者，可将多个治疗生物活性组合物制备成单一药物组合物，并且可包装在单个容器 装置中，例如小瓶、烧瓶、注射器、瓶子或其它合适的单个容器装置中。本发明的药盒通常还 包括用于容纳市售用密闭小瓶的装置，例如，所需小瓶可保留在其中的注射或吹塑的塑料 容器。
[0215] AAV衣壳蛋白
[0216] 如下阶段是辅助病毒（helper)依赖性人细小病毒，腺相关病毒2 (AAV2)生命周期 中的关键阶段：将60个单独的衣壳蛋白亚基超分子组装成能够保护4. 7kb单链DNA基因 组之无包膜的T-I二十面体网格（lattice)。成熟的直径为20nm的AAV2颗粒由三种结构 蛋白构成，这三种蛋白被命名为VP1、VP2和VP3,比例为I : 1 : 18(分子质量分别为87、 73和62kDa)。基于其对称性以及这些分子量估计，在包含颗粒的60个衣壳蛋白中，三个为 VPl蛋白，三个为VP2蛋白，且五十四个为VP3蛋白。
[0217] 生物功能性等同物
[0218] 如本发明所述，野生型rAAV载体多核苷酸和多肽结构的修饰和变化提供了改进 的rAAV病毒体，从而获得具有期望特征的功能性病毒载体，特别是在递送治疗基因构建体 至选择的哺乳动物细胞、组织和器官用于治疗、防止和预防多种疾病和病症以及用于改善 这些疾病之症状的手段方面有所改良，并且通过rAAV载体介导的基因治疗有助于外源治 疗性和/或预防性目的多肽表达。如上所述，本发明的一个关键方面是在编码由公开的 rAAV构建体所编码的一种或更多种治疗剂的特异性多核苷酸序列中产生一个或更多个突 变。在某些情况下，得到的多肽序列被这些突变改变，或者在另一些情况下，多肽序列未被 编码核苷酸中的一个或更多个突变改变，以产生具有改进特性之经修饰的载体用于哺乳动 物系统中实现基因治疗。
[0219] 例如，可在不明显丧失与结构（例如，抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位 点）的相互作用结合能力的情况下，用其它氨基酸来替换蛋白质结构中的某些氨基酸。由 于正是蛋白质的相互作用能力和性质限定了蛋白质的生物功能活性，因此，某些氨基酸序 列替换可以在蛋白质序列以及，当然其潜在的DNA编码序列中进行，并且仍可获得具有相 似特性的蛋白质。由此，本发明人预期可在不明显丧失其生物用途以及活性的情况下，对本 文公开的多核苷酸序列进行多种变化。
[0220] 在进行这些变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质相 互作用生物功能方面的重要性为本领域所普遍理解（Kyte和Doolittle，1982,通过引用并 入本文）。可接受的是，氨基酸的相对亲水特征有助于所得蛋白质的二级结构，其转而限 定蛋白质与其它分子（例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等）的相互作用。以其疏水性 和电荷特征为基础，对每种氨基酸分配了亲水指数（Kyte和Doolittle，1982)，亲水指数 为：异亮氨酸（+4. 5)、缬氨酸（+4. 2)、亮氨酸（+3. 8)、苯丙氨酸（+2. 8)、半胱氨酸/胱氨酸 (+2. 5)、甲硫氨酸（+1.9)、丙氨酸（+1.8)、甘氨酸（-0.4)、苏氨酸（-0.7)、丝氨酸（-0.8)、 色氨酸（-0.9)、酪氨酸（-1.3)、脯氨酸（-1.6)、组氨酸（-3. 2)、谷氨酸（-3. 5)、谷氨酰胺 (-3. 5)、天冬氨酸（-3. 5)、天冬酰胺（-3. 5)、赖氨酸（-3. 9)和精氨酸（-4. 5)。
[0221] 示例性定义
[0222] 根据本发明，多核苷酸、核酸片段、核酸序列等包括，但不限于，获自天然来源、化 学合成的、修饰的或者以其它方式整体或部分通过人工制备或合成的DNA(包括并且不限 于基因组或基因组外DNA)、基因、肽核酸（PNA)、RNA (包括，但不限于，rRNA、mRNA和tRNA)、 核苷以及合适的核酸片段。
[0223] 除非另有限定，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域 中普通技术人员通常理解的含义相同。尽管，与本文描述的方法和组合物类似或等同的任 意方法和组合物均可用于实践或测试本发明，但是优选本文所述的方法和组合物。出于本 发明的目的，对下列术语做如下限定：
[0224] 本文所用的术语"启动子"指核酸序列调控转录的区域。
[0225] 本文所用的术语"调控元件"指核酸序列调控转录的区域。示例性的调控元件包 括，但不限于，增强子、转录后元件、转录控制序列等。
[0226] 本文所用的术语"载体（vector) "指能够在宿主细胞中复制和/或可与另一核酸 片段有效连接以使所连片段复制的核酸分子（通常由DNA构成）。质粒、黏粒或病毒均为示 例性载体。
[0227] 本文所用的术语"基本对应于"、"基本同源"或"基本同一性"指核酸或氨基酸序 列的特征，其中与选择的参考核酸或氨基酸序列相比，选择的核酸或氨基酸序列具有至少 约70%或约75%的序列同一性。更通常地，选择的序列和参考序列具有至少约76%、77%、 78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%或甚至85%的序列同一性，更优选至少约86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%的序列同一性。更优选地，高度同源 序列在选择的序列和与其相比较的参考序列之间通常共有超过至少约96%、97%、98%或 99 %的序列同一性。
[0228] 序列同一性的百分数可通过待比较之序列的全长来计算，或通过排除小的缺失或 添加（其总共少于选择之参考序列的约25%左右）来计算。参考序列可为较大序列的子 集，例如基因或侧翼序列的一部分，或染色体的重复部分。然而，在两个或更多个多核苷酸 序列序列同源的情况下，参考序列将通常包含至少约18至25个核苷酸，更通常地，至少约 26至35个核苷酸，甚至更通常地，至少约40、50、60、70、80、90或甚至100个核苷酸左右。
[0229] 理想地，需要高度同源的片段时，两个序列之间的百分数同一性的程度将为至少 约80%，优选至少约85%，且更优选约90 %或95 %或更高，可容易地通过本领域技术人员 公知的一种或更多种序列比较算法确定，例如，Pearson和Lipman所述的FASTA程序分析 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA，85 (8) :2444-8,1988 年 4 月）。
[0230] 本文所用的术语"有效连接"指连接的核酸序列通常为邻近的或基本邻近的，并且 必要时将阅读框中邻近的两个蛋白质编码区连接。然而，因为增强子通常在与启动子相隔 几千个碱基时仍起作用，以及内含子序列可具有可变的长度，所以一些多核苷酸元件可有 效连接，但却不是邻近的。
[0231] 实施例
[0232] 下述是说明用于实践本发明之方法和实施方案的实施例。实施例不应理解为限 制。
[0233] 材料和方法：
[0234] 细胞和抗体：HEK293、HeLa、NIH3T3细胞获自美国模式培养物保藏中心（American Type Culture Collection(Manassas，VA，USA))，并且可作为单层培养物保持于补充有 10% FBS(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO, USA)和抗生素（Lonza)的 DMEM(Invitrogen)中。 在Ficoll-Paque(GEHeathCare)上纯化来自白细胞去除法（Ieukapheresis)的外周血单核 细胞（PBMC) (AllCells)，将其重悬于不含血清的AM-V培养基（Lonza)中，并将半贴壁的细 胞部分与重组人11-4(50(^/1^)和61^^?(80(^/1^)〇?&0 578丨61118)-起孵育7天。用含有 10ng/mL TNF-a、10ng/mL IL_l、10ng/mL IL-6 和 lmg/mL PGE2(R&D Systems)的细胞因子 混合物起始细胞成熟，持续48小时。在EGFP表达之前，对细胞的共刺激分子表达进行表征 以确保它们满足成熟树突细胞（mDC)的一般表型（⑶80、RPE、鼠 IgGl ;⑶83、RPE、鼠 IgGl ; CD86、FITC、鼠 IgGl ; Invitrogen) 〇
[0235] 定点诱变：使用Turbo? Pfu聚合酶（Stratagene)，用前述质粒pACG2进行两阶 段PCR(Wang等，1999)。简言之，在阶段1中，在分离的管中对正向和方向PCR引物进行两 个PCR延伸反应，进行3个循环。在阶段2中，将两个反应混合，并进行另外15个循环的 PCR反应，然后用DpnI消化一小时。对于每个突变残基，将引物设计成引入从丝氨酸（TCA 或AGC)到缬氨酸（GTA或GTC)的变化。
[0236] 产生重组AAV载体：如前所述产生含有由鸡?.-肌动蛋白启动子驱动之EGFP基 因的重组AAV2载体（Zolotukhin，2002)。简言之，使用聚乙稀亚胺（Polyethelenimine) (PEI，线性，MW 25,000, Polysciences，Inc.)转染 HEK293 细胞。转染后 72 小时，收获细 胞，并通过碘克沙醇（iodixanol) (Sigma-Aldrich)梯度离心和离子交换柱色谱（HiTrap Sp Hp 5mL，GE Healthcare)纯化载体。然后，使用离心旋转浓缩机浓缩病毒，并在三个循 环内将缓冲液更换成乳酸RingeW s (Apollo,截断150kDa，容量为20mL，CLP) (Cheng等， 2011)。在37°C下，用DNA酶I (Invitrogen)处理10 μ L纯化的病毒2小时，然后再用蛋白 酶K(Invitrogen)于56°C下处理2小时。通过苯酷/氯仿，接着氯仿处理来纯化反应混合 物。在存在20 μ g糖原（Invitrogen)的情况下，用乙醇沉淀经包装的DNA。利用对CBA启 动子具有特异性的下述引物对，通过RT -PCR和SYBR Green PCR Master Mix(Invitrogen) 来确定DNA酶I抗性的AAV颗粒效价：
[0237] 正向 5，-TCCCATAGTAACGCCAATAGG-3，（SEQ ID NO :11)
[0238] 反向 5' -CTTGGCATATGATACACTTGATG-3，（SEQ ID NO :12)。
[0239] 重组AAV载体体外转导测定：用AAV2载体，分别以1，OOOvgs/细胞或2, OOOvgs/ 细胞转导来自HEK293或单核细胞的树突细胞（moDC)，并孵育48小时。或者，在转导前1 小时，用50 μ M选择性丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂2-(2-羟乙基氨基）-6-氨基己基氨基甲 酸叔丁酯-9-异丙基嘌呤（针对CaMK-II)、蒽[l，9-cd]吡唑-6 (2Η)-酮、1，9-吡唑并蒽酮 (针对JNK)和4- (4-氟苯基）-2- (4-甲基亚硫酰基苯基）-5- (4-吡啶基）IH-咪唑（针对 MAPK) (CK59, JNK抑制剂2, 98059, Calbiochem)预处理细胞。如前所述，用每个视野绿色 荧光的总面积（像素2)(平均值+SD)或通过流式细胞术来评估转基因表达（Markusic等， 2011 Jayandharan等，2011)。使用方差分析来比较测试值和对照，其被确定是统计学上显 著的。
[0240] Western印迹分析：Western印迹分析按照先前所述进行（Aslanidi等，2007)。通 过离心收获细胞，用PBS洗涤，并将其重悬于含有50mM Tris HCl、pH 7. 5，120mM NaCl、l% Nonidet P-40、10%甘油、IOmM Na4P207、lmM 苯甲基磺酰氟（PMSF)UmM EDTA 和 ImM EGTA， 并补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（组2和组3,Calbiochem)的裂解缓冲液中。在冰 上孵育悬浮液1小时，并通过在4°C下，以HOOOrpm离心30分钟进行澄清。在归一化蛋白 质浓度后，利用12%聚丙烯酰胺/SDS电泳分离样品，将其转移至硝酸纤维素膜，并用第一 抗体、抗 P_p38MAPK(Thrl80/Tyrl82)兔 mAb、总 p38MAPK 兔 mAb 和 GAPDH 兔 mAb(l : 1000， CellSignaling)，然后是第二连有辣根过氧化物酶的连接抗体（I : 1000，CellSignaling) 探测。
[0241] 特异性细胞毒性T淋巴细胞产生和细胞毒性测定：按照上文所述产生来自单核 细胞的树突细胞（moDC)。用编码人端粒酶cDNA的AAV2-S662V载体感染未成熟的DC(Dr. Karina Krotova，University of Florida)，将其以每个为 2, OOOvgs/细胞 MOI 分成两个重 叠的0RF-hTERT838_222#P hTERT 2Q42_3454。然后，用补充物对细胞进行刺激以诱导成熟。48小 时后，收获表达hTERT的成熟DC，并将其与PBMC以20 : 1的比例混合。将CTL以20 X IO6 细胞培养于25cm2烧瓶中含有重组人IL-15(20IU/ml)和IL-7(20ng/mL)的AM-V培养基 中。每2天，添加新鲜的细胞因子。在致敏7天后，收获细胞，并将其用于杀伤测定（Heiser 等，2002)。生成杀伤曲线，并按照先前所述通过FACS分析活细胞/死细胞比例来确定特异 性细胞裂解（Mattis等，1997)。使用人无限繁殖的骨髓性白血病细胞系，K562,作为靶标。
[0242] 统计学分析：结果以平均值土S.D表示。使用分组不配对双尾分布学生t-检验来 鉴定组间差异。P值<0.05被认为是统计学上显著的。
[0243] 实施例1-特异性细胞丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制提高了 rAAV2载体的转导效率
[0244] 细胞表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶（EGFR-PTK)活性的抑制以及七个表面暴 露之酪氨酸残基的定点诱变通过防止这些残基的磷酸化显著提高了 AAV2载体的转导效 率，从而避免载体进行泛素化以及随后蛋白酶体介导的降解。AAV2衣壳还包含15个表面暴 露的丝氨酸残基，其可潜在地被多种细胞类型和组织中广泛表达的细胞丝氨酸/苏氨酸激 酶磷酸化。
[0245] 为了检测这些激酶活性的抑制是否可以防止表面暴露之丝氨酸残基的磷酸化，并 由此改善AAV2载体的细胞内运输和核转运，使用几种市售的细胞丝氨酸/苏氨酸激酶特异 性抑制剂（例如钙调蛋白依赖性蛋白激酶II (CamK-II)、c-Jun N末端激酶（JNK)和促分裂 原活化蛋白激酶（P38MAPK))。用多种浓度的特异性抑制剂，例如2-(2-羟乙基氨基）-6-氨 基己基氨基甲酸叔丁酯-9-异丙基嘌呤（针对CaMK-II)、蒽[l，9-cd]吡唑-6(2H)_酮、 1，9_吡唑并蒽酮（针对JNK)和4-(4-氟苯基）-2-(4-甲基亚硫酰基苯基）-5-(4-吡啶 基）1H-咪唑（针对p38MAPK)预处理HEK293细胞1小时。随后，用单链（ss)或自身互补 (sc)的AAV2载体，以每个细胞1，000个载体基因组（vector gemones，vgs)转导细胞。
[0246] 这些结果显示在50 μ M浓度时，所有抑制剂均显著提高了 ssAAV2和scAAV2载体 的转导效率，其中P38MAPK抑制剂最有效（图3Α和3Β)。所述结果表明转导效率的提高是 由于防止了载体衣壳的磷酸化，而非改善了病毒第二链DNA合成。
[0247] 实施例2-表面暴露之丝氨酸残基的定点诱变提高了载体介导的转基因表达
[0248] AAV2衣壳在其三个衣壳VP的病毒蛋白3 (VP3)共有区中包含50个丝氨酸（S)残 基，其中 15 个残基（S261、S264、S267、S276、S384、S458、S468、S492、S498、S578、S658、S662、 S668、S707、S721)是表面暴露的。如前所述，通过定点诱变用缬氨酸（V)残基替换所述15 个S残基中的每一个。大多数突变体可产生与WT AAV2载体类似的效价，除S261V、S276V、 S658V、S267V和S668V之外，其中S261V、S276和S658V产生低约10倍的效价，S267V和 S668V未产生具有可检测水平的DNA酶I抗性的载体颗粒。S468V和S384V突变体的效价 约3至5倍高于WT AAV2载体。评价每个S-V突变体载体在293细胞中的转导效率。
[0249] 图4A和4B所示的这些结果表明，15个突变体中，S662V突变体转导293细胞比其 WT对应物更有效约20倍。S458V和S492V突变体载体的转导效率分别提高约4倍和2倍。 在高于WTAAV2载体的效价下产生的S468V和S384V突变体在相同感染复数（MOI)下的转 导效率保持不变（S468V)或降低约10倍（S384V)。不同丝氨酸至缬氨酸突变之AAV2载体 的转导效率总结于图5中。出人意料地是，在含有双突变体（S458V+S662V和S492V+S662V) 的载体或含有三突变体（S458V+S492V+S662V)的载体中均未观察到转导效率进一步提高。
[0250] 实施例3-用多种氨基酸替换S662
[0251] 662位除了发生S至V的替换外，还用不同的氨基酸替换产生下列七个突变体： S662 -丙氨酸（A)、S662 -天冬酰胺（N)、S662 -天冬氨酸（D)、S662 -组氨酸（H)、S662 - 异亮氨酸（I)、S662 -亮氨酸（L)以及S662 -苯丙氨酸（F)。与上述类似，也对这些突变 体载体中每一个在293细胞中的转导效率进行评价。
[0252] 图6A和6B所示并总结于图7中的结果证明，与其它突变体相比，用V替换S导致 在不改变载体效价的情况下产生最有效的突变体。用N、I、L或F取代S使包装效率下降约 10倍，同时未对转导效率产生显著影响，而用D或H替换则使转导效率分别提高约8倍和约 4倍，同时未对载体效价产生影响。与WTAAV2载体相比，S至A的替换使病毒效价提高至约 5倍，并且使转基因表达增强约3倍。662位丝氨酸突变体的效价和感染性中观察到的可变 性表明每个氨基酸在调节AAV2包装效率及其生物活性两方面中起关键作用。
[0253] 实施例4-S662V载体在多种细胞类型中的转导效率与p38MAPK活性相关
[0254] 使用下述细胞类型检测S662V载体介导的转基因表达：（i)NIH3T3(小鼠胚胎成纤 维细胞）、（ii)H2.35(小鼠胎肝细胞）、（iii)HeLa (人子宫颈癌细胞）和（iv)来自原代人 单核细胞的树突细胞（moDC)。在相同条件下，用WT scAAV2-EGFP或S662V scAAV2-EGFP载 体以2, OOOvgs/细胞的MOI转导这些细胞类型。转染后（p. i.)48小时，评价HeLa、293和 moDC的EGFP基因表达；转染后5天，评价H2. 35和NIH3T3细胞的EGFP基因表达。
[0255] 图8A所示结果表明，尽管WT和S662V突变体载体之间转导效率的绝对差异范围 为约3倍（H2. 35细胞中）至约20倍（293细胞中），但是突变体载体在测试的每个细胞类 型中均一致地更有效。
[0256] 为了检测WT和突变体载体之转导效率中观察到的差异是否由细胞P38MAPK表达 水平和/或活性水平的变化引起，在以特异性抗体为探针的Western印迹上分析从各个细 胞类型制备的细胞裂解物以检测总P38MAPK和磷酸-P38MAPK两者的水平。使用GAPDH作 为上样对照。
[0257] 图8B所示结果表明，虽然P38MAPK蛋白质水平类似，但是通过磷酸化水平确定的 激酶活性在不同细胞类型中显著变化，并且S662V突变体载体的转导效率与p38MAPK活性 大致上相关。所述结果表明，AAV2载体的p38MAPK介导的磷酸化。此外，在293细胞或moDC 中，通过WT AAV2载体转导未导致p38MAPK磷酸化的上调，这表明AAV未诱导moDC中发生 稳健的表型变化。
[0258] 实施例5-moDC之S662V突变体载体介导的转导不导致表型改变
[0259] MAPK家族成员在APC的发育和成熟中起重要作用。在该实施例中，用50 μM上述 选择性激酶抑制剂处理分离自健康供体白细胞去除法的moDC，然后，用WT SCAAV2-EGFP载 体转导。感染后两小时，用补充物（TNF-α、IL-If3、Il-6、PGE2)处理细胞以诱导成熟。转 染后48小时，通过荧光显微术评价EGFP转基因表达。
[0260] 结果表明，用JNK和p38MAPK的特异性抑制剂预处理moDC使EGFP表达水平分别 提高约2倍和约3倍，并且使S662V突变体载体的转导效率增强约5倍（图9A、9B和9C)。
[0261] 由于，先前已报道过这些激酶的抑制可防止树突细胞成熟，因此还检测S662V突 变体诱导DC中表型变化的能力。简言之，以越来越高至50, OOOvgs/细胞的MOI感染moDC， 在感染后48小时收获，并通过荧光激活的细胞分选法（FACS)分析其表面共刺激分子的上 调。DC成熟标志物（例如CD80、CD83和CD86)的流式细胞术分析表明，与WTAAV2载体类 似，S662V突变体载体也未诱导moDC成熟（图9C)。所述结果表明，根据本发明制备之衣壳 突变的AAV载体证明具有低的免疫原性。
[0262] 实施例6-通过用AAV2-S662V载体转导moDC来产生hTERT特异性的CTL
[0263] 由于与WT-AAV2载体相比moDC中丝氨酸-突变体AAV2载体介导的转基因表达有 显著提高，因此该研宄证明装载有S662V的moDC能够刺激产生细胞毒性T淋巴细胞并有 效特异性杀伤靶细胞。鉴于大多数癌细胞中通常表达的人端粒酶被视为独特的抗癌靶标， 所以克隆受鸡β-肌动蛋白启动子控制之截短的人端粒酶（hTERT)基因，并将DNA包装到 AAV2S662V突变体中。用通过S662V载体递送的moDC/hTERT刺激含有达25% CD8阳性细 胞之非贴壁的外周血单核细胞（PBMC) -次。将无限繁殖的骨髓性白血病细胞系K562用于 两色荧光测定细胞介导的细胞毒性，以用随后降低的效应细胞（effector)与靶细胞的比 生成杀伤曲线。
[0264] 图10所示的结果表明，与表达GFP的moDC相比，装载有hTERT的moDC可有效地 刺激特异性T细胞克隆增殖及杀伤活性。这些结果还表明，基于衣壳突变之rAAV载体的递 送方法还可用于多种哺乳动物疫苗接种方法中。
[0265] 实施例7-通过表面暴露之酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸残基的定点诱变获得高效 率rAAV2载体
[0266] 目前，AAV载体在很多临床试验中用作递送载剂以靶向多种组织，从而实现治疗基 因的持续表达。然而，需要大的载体剂量才能观察到治疗益处。此外，足够量载体的产生以 及起始对载体的免疫应答的风险均提出了挑战。因此，开发新型的在较低剂量下具有高转 导效率的AAV载体是关键的。
[0267] 主要由于AAV2衣壳在酪氨酸残基处发生磷酸化，所以细胞表皮生长因子受体蛋 白酪氨酸激酶（EGFR-PTK)对重组AAV2载体的转基因表达产生不利影响。随后，酪氨酸磷 酸化的衣壳通过宿主蛋白酶体机制降解，从而对AAV载体的转导效率产生不利影响。JNK和 P38MAPK丝氨酸/苏氨酸激酶的选择性抑制剂使转导效率提高，表明某些表面暴露之丝氨 酸和/或苏氨酸残基的磷酸化降低了 AAV载体的转导效率。
[0268] 对野生型AAV2衣壳蛋白进行定点诱变。如图11A、图11B、图12A和图12B所示， 野生型AAV2衣壳蛋白的丝氨酸（S662V)和苏氨酸（T491V)突变体相当大地提高了 AAV载 体的转导效率。
[0269] 将丝氨酸（S662V)和苏氨酸（T49IV)突变与表现最佳的单酪氨酸突变体 (Y730F)和三酪氨酸突变体（Y730F+500+444F)组合以产生下述载体：（i)三种双突变体 (S662V+T491V;Y730F+S662V;Y730F+T491V) ;(ii) -种三突变体（S662V+Y730F+T491V); (iii)两种四突变体（Y730+500+444F+S662V ;Y730+500+44F+T491V)和（iv) -种五突变体 (Y730+500+4440F+S662V+T491V)。使用原代鼠肝细胞细胞系H3. 25评价每个突变体载体的 转导效率。
[0270] 如图13A和图13B所示，与相应的未经修饰之野生型（WT) AAV2载体的转导效率相 比，基于AAV2四突变体（Y730+500+730F+T491V)的载体使转导效率提高约30倍；与基于 AAV2三突变体（Y730+500+444F)之载体产生的转导效率相比，提高约3倍。将S662V突变 与单（Y730F)或三酪氨酸突变体（Y730F+500+444F)载体组合对转导效率产生不利影响。
[0271] 经遗传修饰的树突细胞（DC)已得到广泛研宄，并且已开始了很多I期和II期临 床试验来评价它们在癌症患者中的功效。然而，目前，就细胞生存力、关于抗原呈递寿命的 不确定性以及患者单元型（haplotype)的限制方面而言，用于DC加载的方法是不够的。已 证明，通过不同的通常使用的AAV载体血清型成功转导不同的DC亚群，并且已讨论基于AAV 载体之抗肿瘤疫苗的潜在优点。然而，就特异性和转导效率方面而言，应保证通过重组AAV 载体将基因转移至DC的进一步改进，以在用作抗肿瘤疫苗时获得显著效果。
[0272] 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶可通过磷酸化病毒衣壳上表面暴露之丝氨酸和/或苏氨 酸残基和靶向载体进行蛋白酶体介导的降解来负调控重组AAV载体介导的转基因表达的 效率。防止表面暴露之丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化可使得载体能够避免磷酸化以及随后的 泛素化，从而防止蛋白酶体降解。
[0273] 对野生型AAV载体中15个表面暴露之丝氨酸（S)残基中的每一个进行定点诱变。 结果显示，与野生型AAV2载体相比，S662至缬氨酸（V)的替换使S662V突变体的转导效率 提高至6倍。此外，进行定点诱变以用V来替换野生型AAV2载体中17个表面暴露之苏氨 酸（T)残基中的每一个（T251V、T329V、T330V、T454V、T455V、T503V、T550V、T592V、T581V、 T597V、T491V、T671V、T659V、T660V、T701V、T713V、T716V)。在 2, OOOvgs/ 细胞 MOI 下，使用 来自原代人单核细胞的树突细胞（moDC)来评价每个T-V突变体载体的转导效率。用含有 10ng/mL TNF-α、l〇ng/mL IL-l、10ng/mL IL-6 和 lmg/mL PGE2 的细胞因子混合物成熟，接 着，在感染后48小时，在荧光显微镜下分析EGFP表达。对细胞共刺激分子（CD80、CD83和 CD86)的表达进行表征以确保它们满足成熟树突细胞（mDC)的典型表型。
[0274] 如图 14A 和图 14B 所示，下列 T 残基突变（T455V、T491V、T550V、T659V、T671V)使 转导moDC的效率提高至5倍，其中在该研宄中测试的那些突变体中，T491V被证明具有最 高的转导效率。
[0275] 为了检测多个T残基突变是否可进一步增强转导效率，还产生了下 列AAV2突变体：（i)四种具有双突变的AAV2载体（相对于野生型AAV2载体） (T455V+T491V ;T550V+T491V ;T659V+T491V ;T671V+T491V) ; (ii)两种三突变的 AAV2 载 体（T455V+T491V+T550V 和 T550V+T659V+T491V)以及（iii) 一种四突变的 AAV2 载体 (T455V+T550V+T659V+T491V)。结果证明，许多这些多突变体载体提高了转导树突细胞 的效率，并且特别地，显示三突变体（T550V+T659V+T491V)具有最佳转导效率（约比相 应的未经修饰的野生型AAV2载体的转导效率大十倍）。这些结果可通过以"混合且匹配 (mix-and-match) "的方式制备多种组合突变体来产生多个合适的衣壳突变之载体而得到 进一步增强/与各个单突变相比，一种这样的组合-将表现最佳的丝氨酸替换（S662V)突 变体与表现最佳的苏氨酸替换（T491V)结合，使转导效率进一步增强约8倍。
[0276] 实施例8-AAV2衣壳上泛素结合赖氨酸残基的靶向诱变提高其转导效率
[0277] 目前，从血友病临床试验得到的数据可公知，高剂量AAV载体的肝基因转移易于 产生稳健的适应性免疫应答。因此，需要开发新的方案使得较低剂量的载体能够用于获得 持续的表型修正并限制载体相关的免疫毒性。
[0278] 该实施例显示，AAV2衣壳蛋白VP3区中表面暴露的赖氨酸残基是宿主泛素连接酶 的直接靶标，这些赖氨酸残基的诱变提高了 AAV载体的转导效率。
[0279] 可对野生型AAV2衣壳中利用泛素化预测软件（UbPred)进行计算机分析鉴定的七 个赖氨酸残基（K39、K137、K143、K161、K490、K527 和 K532)进行泛素化。在 AAV2R印/Cap 编码质粒中进行赖氨酸至精氨酸的突变，并在七个赖氨酸突变体质粒的每一个中产生表达 EGFP之重组自身互补AAV2载体[scAAV-CBa-EGFP]的高纯原液。赖氨酸突变体载体具有与 野生型（WT)scAAV载体可比较的物理颗粒效价（约0.5-1 X 1012vgs/mL)，表明这些突变未 影响突变体衣壳的结构或包装能力。
[0280] 然后，评价含有WT衣壳或七个赖氨酸突变体衣壳中每一个之scAAV载体的体外转 导潜力。模拟感染或用AAV以不同的感染复数（MOI)(包括500、2000或5000vgs/细胞） 感染约8 X IO4个HeLa或HEK293细胞。感染后48个小时，通过荧光显微术和流式细胞术 测定转基因（EGFP)表达。
[0281] 图15所示结果证明，与WT-AAV2载体相比，K532R突变体载体使体外HeLa(18X)和 HEK 293(9X)细胞两者中的基因表达均显著增加。对于三个不同的测试M0I，K532R载体提 高的转导效力是一致的，与WT载体相比，平均提高了 10倍。
[0282] 实施例9-AAV载体介导体内典型和替代NF- κ B途径的激活
[0283] 用腺相关病毒（AAV)载体体外感染HeLa细胞导致替代NF- κ B途径（细胞免疫应 答和炎症反应的中心调节剂）的激活。此外，替代途径，而非典型途径的激活调控这些细胞 中AAV介导的转基因表达。
[0284] 该实施例定义了 NF-κ B在小鼠肝定向之AAV介导的基因转移中的作用。在体内， AAV介导的基因转移导致典型和替代NF- κ B途径发生持续激活。认为这些途径主要驱动 炎症反应（典型）或适应性应答（替代途径）。含有野生型（WT)或酪氨酸三突变体（TM) 衣壳之AAV2载体在2小时内激活典型NF- κ B途径，从而导致表达促炎细胞因子和趋化因 子（图14A)。该瞬时过程是Toll样受体9 (TLR9)依赖性的，并且可能反映了抗原呈递细胞 对载体基因组的初始感应。在载体递送后9小时制备之肝匀浆物的Western印迹分析（图 14B)显示，替代NF- κ B途径之丰富的核p52蛋白组分，这可能是由基因转移至肝细胞造成 的。
[0285] 在基因转移之前施用NF- κ B抑制剂Bayll有效地阻断这两种途径的激活。这防 止了促炎固有免疫应答并且还减少了抗AAV衣壳抗体形成（图14C)。重要的是，Bayll不 干扰由WT和TM AAV2载体两者介导的长期转基因表达（图14D)。这些结果证明，在施用载 体前，使用NF-κ B抑制剂的短暂免疫抑制消除了炎症（由固有应答导致），并且还限制了适 应性应答。
[0286] 实施例10-最佳rAAV3载体的开发：高效转导人肝癌细胞的机制
[0287] 在10个常用的AAV血清型中，已报道AAV3对细胞和组织的转导不佳。然而，本发 明人发现，AAV3载体非常有效地转导已建立的人肝胚细胞瘤（HB)和人肝细胞癌（HCC)细 胞系以及原代人肝细胞。AAV3利用人HGFR作为用于病毒进入的细胞受体/共受体。
[0288] 该实施例显示，hHGFR的细胞外以及细胞内激酶结构域两者均参与AAV3载体进入 和AAV3介导的转基因表达。结果表明，（i)在稳定转染和过表达hHGFR后，T47D细胞（表 达不可检测水平的内源hHGFR的人乳腺癌细胞系）中AAV3载体介导的转导显著提高（图 15A) ; (ii)与hHGFR相关之酪氨酸激酶活性对AAV3载体的转导效率产生不利影响（图15B、 图15C) 蛋白酶体抑制剂的使用显著提高了 AAV3载体介导的转导；（iv)AAV3衣壳上 特定表面暴露之酪氨酸残基的定点诱变导致转导效率提高；以及（V)两个酪氨酸突变的特 定组合进一步提高了转基因表达的程度（图15D)。这些AAV3载体可用于人类中肝癌的基 因治疗。
[0289] 实施例11-表面暴露之赖氨酸残基的定点诱变导致rAAV2和rAAV8载体在鼠体内 肝细胞中的转导提高
[0290] 泛素-蛋白酶体途径在重组AAV2载体的细胞内运输中起关键作用，其对这些载体 的转导效率产生不利影响。泛素化的主要信号是AAV2衣壳上特定表面暴露之酪氨酸（Y)、 丝氨酸（S)和苏氨酸（T)残基的磷酸化；去除这些残基中的一些显著提高了野生型（WT) AAV2载体的转导效率。
[0291] 该实施例说明，表面暴露之赖氨酸残基的定点诱变防止了 AAV衣壳的泛素化，其 转而防止了通过细胞蛋白酶体机制的载体降解，从而产生改进的载体用于递送治疗或诊断 多核苷酸至选择的哺乳动物细胞。
[0292] 制备具有表面暴露的赖氨酸（K)残基（K258、K490、K527、K532、K544、549和K556) 被谷氨酸（E)替换之单突变的AAV2载体，并对其进行分析。与相应的未经修饰之WT AAV2 载体相比，表达EGFP报道基因之Κ490Ε、Κ544Ε、Κ549Ε和Κ556Ε scAAV2载体的转导效率提 高多达5倍（参见图16)。在该研宄中分析的实例性构建体中，Κ556Ε单突变体在赖氨酸替 换的突变体中具有最高的转导效率（在Hela细胞中的体外转导率为2, OOOvgs/细胞）。当 静脉内递送IXlOltlVgs各载体至C57BL/6小鼠，并在感染后2周评价肝细胞中的转基因表 达时，也可获得类似结果。静脉内递送IXlO ltVgs/动物的表达萤火虫荧光素酶（Fluc)报 道基因之WT或赖氨酸突变的SSAAV2载体，然后，在感染后两周进行的生物发光成像进一步 证实了这些结果。
[0293] 重要地是，将最有效的单氨基酸残基突变中的两个组合以产生双突变体 (Κ544Ε+Κ556Ε)。，该双突变体ssAAV2-Fluc载体在鼠体内肝细胞中的转导效率与任意单突 变体相比提高约2倍；与WT未经修饰的ssAAV2对照载体相比，提高约10倍。
[0294] 先前已显示，AAV8载体可非常优异地转导鼠肝细胞。由于表面暴露之K残基 中的一些在该血清型中同样保守，因此还产生具有Κ530Ε-、Κ547Ε-或Κ569Ε-突变体的 ssAAV8-Fluc载体。与WT ssAAV8载体相比，Κ547Ε和Κ569Ε ssAAV8-Fluc载体在鼠体内 肝细胞中的转导效率分别提高约3倍和约2倍（图17A、图17B、图17C、图17D、图17E和图 18)〇
[0295] 结果（本文总结于图19A、图19B、图20A和图20B、图21A-21I、图22A-22I、图 23A-23F、图24和图25中）证明还可利用靶向表面暴露之赖氨酸残基来产生新的改进的基 于AAV的病毒载体以提高人细胞的转导，并且重要地是，将新的靶向载体用于基因治疗中。
[0296] 参考文献：
[0297] 下述参考文献在一定程度上提供了实例性的方法或其它可以补充本文内容的细 节，将其明确地通过引用并入本文：
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[0348] 应当理解地是，本文所述的实例和实施方案仅出于说明目的，对其的各种修改或 变化将是本领域技术人员所能预见到的，并包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求 的范围内。
[0349] 本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利均特此通过引用并入，如 同每篇参考文献被单独明确地显示通过引用并入，并在本文对整体进行阐述的同样的程 度。
[0350] 除非本文中另有指示或明显地与上下文矛盾，否则在描述本发明的上下文中使用 的没有数量词修饰的名词应解释为涵盖单数和复数两者。
[0351] 除非本文中另有指示，否则本文中引用的数值范围仅意图用作分别指落入范围的 每个单独值的简写方法，并且每个单独值均被并入说明书中，如同其在本文中被单独引用。
[0352] 除非本文中另有指示或明显地与上下文矛盾，否则本文描述的所有方法均可以以 任意合适的顺序进行。
[0353] 除非另有指示，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言（例如，"例如"）的 使用仅意图更好地说明本发明，而并非对本发明的范围构成限制。说明书中没有语言应被 解释指任何对实践本发明来说必要的要素，除非同样清楚地说明。
[0354] 除非另有说明或明显地与上下文矛盾，否则在本文中提及要素时，使用的术语如 "包括"、"具有"、"包含"或"含有"在此描述本发明的任何方面或实施方案意图为"由该特 定要素组成"、"本质上由该特定要素组成"或"基本包含该特定要素"的本发明的类似方面 或实施方案提供支持（例如，除非另有说明或明显地与上下文矛盾，否则本文中描述为包 含特定要素的组合物应理解为还描述了由该要素组成的组合物）。
[0355] 根据本公开内容，可制备并实施本文公开并要求保护的所有组合物和方法，而无 需过多实验。尽管已在一些优选实施方案中对本发明组合物和方法进行了描述，但是，对本 领域技术人员明显地是，可在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下对本文所述组合 物和方法，以及步骤或方法步骤的顺序进行改变。更特别地，显然地是，可用化学上和生理 上都相关的某些试剂来替换本文所述的试剂，同时将获得相同或类似的结果。对本领域技 术人员显然地是，所有这些类似的替换和修改均被认为处于所附权利要求限定之本发明的 精神、范围和概念内。
【权利要求】
1. 一种AAV VP3蛋白，其包含； (a)对应于 SEQ ID NO ;2 的野生型 AAV2 衣壳蛋白之 K258、K321、K459、K490、K507、 K527、K572、K532、K544、K549、K556、K649、K655、K665 或 K706 位置上的非赖氨酸氨基酸残 基； 化）对应于SEQ ID NO ;8的野生型AAV8衣壳蛋白之K530、K547或K569位置上的非赖 氨酸氨基酸残基； (C)对应于 SEQ ID NO ;2 的野生型 AAV2 衣壳蛋白之 S261、S264、S267、S276、S384、 S458、S468、S492、S498、S578、S658、S662、S668、S707 或 S721 位置上的非丝氨酸氨基酸残 基； (d) 对应于 SEQ ID NO ;2 的野生型 AAV2 衣壳蛋白之 T251、T329、T330、T454、T455、 T503、T550、T592、T581、T597、T491、T671、T659、T660、T701、T713 或 T716 位置上的非苏氨 酸氨基酸残基；和/或 (e) 对应于 SEQ ID N0;2 的野生型 AAV2 衣壳蛋白之 Y252、Y272、Y444、YS00、Y700、Y704 或Y730位置上的非酪氨酸氨基酸残基。
2. 根据权利要求1所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID NO ;2的野生型AAV2衣 壳蛋白之K459、K490、K532、K544或K556位置上的非赖氨酸氨基酸残基。
3. 根据权利要求1或2所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID NO ;8的野生型 AAV8衣壳蛋白之K530、K547或K569位置上的非赖氨酸氨基酸残基。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID NO ;2的 野生型AAV2衣壳蛋白之K544和K566位置上的非赖氨酸氨基酸残基。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其中所述非赖氨酸氨基酸残基选 自谷氨酸巧)、精氨酸（时、丝氨酸（巧或异亮氨酸（I)。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID N0;2的野 生型 AAV2 衣壳蛋白之 K258、K321、K459、K490、K507、K527、K572、K532、K544、K549、K556、 K649、K655或K706位置上的谷氨酸巧）氨基酸残基。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID N0;2的野 生型AAV2衣壳蛋白之K544和K566位置上的谷氨酸巧）氨基酸残基。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID N0;8的野 生型AAV8衣壳蛋白之K530、K547或K569位置上的谷氨酸巧）氨基酸残基。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID N0;2的野 生型AAV2衣壳蛋白之S662位置上的非丝氨酸氨基酸残基。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其中所述非丝氨酸氨基酸残基 选自鄉氨酸（V)、天冬氨酸（D)或组氨酸（H)。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID N0;2的 野生型AAV2衣壳蛋白之S662位置上的鄉氨酸残基。
12. -种分离的核酸分子，其编码根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白。
13. -种AAV载体，其编码权利要求1至11中任一项所述的蛋白质，或其包含权利要求 12所述的分离的核酸分子。
14. 根据权利要求13所述的AAV载体，其中与相应的未经修饰之野生型AAV载体的转 导效率相比，所述载体的转导效率至少高五倍。
15. 根据权利要求13或14所述的AAV载体，其包含在腺相关病毒颗粒或感染性rAAV 病毒体内。
16. -种组合物，其包含（a)根据权利要求1至11中任一项所述的AAV VP3蛋白、根 据权利要求12所述的分离的核酸分子或根据权利要求13至15中任一项所述的AAV载体； W及化）可药用缓冲剂、稀释剂或载剂。
17. 根据权利要求16所述的组合物，其包含在用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物疾 病、损伤、病症、创伤或功能障碍的一种或更多种症状的药盒中。
18. 根据权利要求16或17所述的组合物，其用于诊断或治疗哺乳动物中的W下疾病， 或者用于治疗、预防或改善哺乳动物中W下疾病的一种或更多种症状；癌症、糖尿病、自身 免疫性疾病、肾病、屯、血管疾病、膜腺疾病、肠疾病、肝病、神经系统疾病、神经肌肉病症、神 经运动缺陷、神经骨骼肌损伤、神经失能、感觉神经功能障碍、中风、局部缺血、进食障碍、 a 1-抗膜蛋白酶（AAT)缺乏症、己腾病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、骨骼疾病、创伤 或肺病。
19. 根据权利要求16至18中任一项所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于 诊断、治疗、预防或改善哺乳动物中之疾病、病症、功能障碍、损伤、异常状况、先天性缺陷或 创伤的一种或更多种症状。
20. -种转导哺乳动物细胞群的方法，其包括向所述群的一个或更多个细胞中引入含 有有效量的根据权利要求13至15中任一项所述之AAV载体的组合物。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述AAV载体含有该样的VP3蛋白，所述VP3蛋 白包含对应于SEQ ID NO ;2的野生型AAV2VP3蛋白之K459、K490、K532、K544或K556或者 SEQ ID N0;8的野生型AAV8衣壳蛋白之K530、K547或K569位置上的非赖氨酸氨基酸残基。
22. 根据权利要求20或21所述的方法，其中所述非赖氨酸氨基酸残基为谷氨酸巧)、 精氨酸（时、丝氨酸（巧或异亮氨酸（I)。
23. 根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述非赖氨酸氨基酸残基为谷氨 酸巧）。
24. 根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
25. 根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为内皮细胞、上皮 细胞、血管细胞、肝细胞、肺细胞、屯、脏细胞、膜腺细胞、肠细胞、肾细胞、肌细胞、骨细胞、树 突细胞、屯、肌细胞、神经细胞、血细胞、脑细胞、成纤维细胞或癌细胞。
【文档编号】C12N15/35GK104470945SQ201380034940
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年5月15日 优先权日:2012年5月15日
【发明者】阿伦·斯里瓦斯塔瓦, 乔治·弗拉基米罗维奇·阿斯拉尼迪, 基姆·M·万弗利特, 马维斯·阿格班杰-麦克纳 申请人:佛罗里达大学研究基金会有限公司