病毒灭活的生物混合物的制作方法
【技术领域】
[0001] -般来将，本发明涉及病毒灭活的生物液体或干燥混合物，并且涉及其制备。主要 地，本发明涉及但不限于病毒灭活的血小板提取物及其制备。
【背景技术】
[0002] 血小板是在止血和愈合中发挥基础作用的小的、形状不规则的无核细胞。血小板 包含完整的预合成蛋白阵列，其中包括信号蛋白、细胞骨架蛋白、膜蛋白和调节蛋白。它们 参与损伤部位处的组织再生和愈合过程的关键阶段中，这主要是由于包含大量生物活性分 子（包括生长因子（GF)、细胞因子和趋化因子）的血小板颗粒内容物。
[0003] 诸如血小板衍生生长因子（PDGF)、转化生长因子（TGF)、碱性成纤维细胞生长因 子（bFGF)、血管内皮生长因子（VEGF)之类的血小板生长因子在伤口愈合级联的以下全部 阶段中起关键作用：炎症、增殖和重塑阶段。
[0004] 研宄已表明，血小板衍生的生长因子刺激血管生成、有丝分裂发生、细胞增殖、中 性粒细胞和巨噬细胞、胶原合成、伤口收缩、细胞外基质合成、上皮形成和趋化作用。
[0005] 血小板通常通过输注使用来例如促进止血。最近，血小板越来越多地以富血 小板血浆（PRP)的形式使用，其也称为PRP凝胶、血小板凝胶、PRP凝块等。通常，PRP 是由在有限体积的血浆中浓缩的自体血小板构成的间接体内制剂（Lacci KM，Dardik A.Platelet-rich plasma ：support for its use in wound healing.Yale J Biol Med. 2010 年 3 月；83 (I) :1-9)。
[0006] 对于局部施用，PRP通常通过添加凝血酶和/或CaCl2，从而通过凝血酶（内源性 或外源性的）与纤维蛋白原之间的相互作用形成纤维蛋白凝胶而活化。活化时，血小板发 生活性脱颗粒作用，并释放出各种调节剂，包括GF (Lacci KM，Dardik A，2010)。PRP的注射 用途目前构成了小规模但快速成长的细分市场。将PRP用于软和硬组织填充的基本原理是 其可能增强不愈性损伤中的组织再生、加速伤口成熟、血管形成和上皮形成、减少疤痕形成 以及减少术后并发症和发病率（Lacci KM，Dardik A，2010)。
[0007] 连同各种细胞类型使用活化的PRP的研宄已表明从PRP释放的因子例如 生长因子可诱导细胞增殖[(例如Kanno等人，Platelet-rich plasma enhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation.J Oral Maxillofac Surg. 2005 年 3 月；63 (3) :362-9 ;Bertrand_Duchesne 等人，Epidermal growth factor released from platelet-rich plasma promotes endothelial cell proliferation in vitro. J Periodontal Res. 2010 年 2 月；45 (I) :87-93 ;Kakudo 等人， Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 2008 年 11 月； 122(5) :1352-60)，调节人内皮细胞的血管生成能力（Sulpice等人，Cross-talk between the VEGF-A and HGF signalling pathways in endothelial cells.Biol Cell. 2009年9 月；101 (9) :525-39 ;Rughetti 等人，Platelet gel-released supernatant modulates the angiogenic capability of human endothelial cells. Blood Transfus.2008 年 I 月； 6(1) :12-7)，并且引发骨诱导性能（Intini G. The use of platelet-rich plasma in bone reconstruction therapy. Biomaterials· 2009 年 10 月；30 (28) :4956-66)]。此外，据发现， 在与胎牛血清支持的水平相当或更高的水平下，活化的PRP支持体外细胞生长并维持多个 目标细胞的生存能力，所述目标细胞包括骨髓瘤、杂交瘤、肝细胞、成纤维细胞和上皮细胞 (Johansson等人，Platelet lysate ：a replacement for fetal bovine serum in animal cell culture? Cytotechnology. 2003 年 7 月；42 (2) :67_74)〇
[0008] PRP及释放的生长因子目前用于多种组织再生手术，主要是骨科和牙科手术 (Nurden 等人，Platelets and wound healing. Front Biosci.2008 年 5 月 1 日；13 : 3532-48)。在骨科手术中，PRP主要用于膝关节成形术、腰椎融合和椎间盘退变（见Nurden 等人2008年的综述）。牙科学和颁面外科学PRP应用主要包括钛种植体的巩固、上颁窦提升 和骨重塑（见Nurden等人2008年的综述）。PRP还越来越多地用于肌腱和韧带修复、面部 整形和重建手术、慢性皮肤伤口愈合、眼科学、面神经再生以及心脏和减肥手术（见Nurden 等人2008年的综述）。
[0009] 然而，自体PRP及释放因子的当前应用的主要缺点在于缺乏标准化。值得注意 的是，可以商购获得参数，诸如制备时间、血小板收率和采集效率，不同的用于制备PRP的 不同人工、半自动和全自动系统（Mazzucco等人，Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations :Fibrinet，RegenPRP-Kit，Plateltex and one manual procedure. Vox Sang. 2009 年 8 月；97 (2) :110-8)〇
[0010] 另一个重要的变量是用于血小板活化的技术[自体、异源或重组凝血酶，氯化钙 或巴曲酶（Rozman P，Bolta Z. Use of platelet growth factors in treating wounds and soft-tissue injuries. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat. 2007 年 12 月； 16(4) :156-65)]，其可影响颗粒释放效率和分泌的GF的量（Rozman P，Bolta Z，2007)。此 外，由于血小板对机械应力和周围环境的变化非常敏感，因此，它们可在预期活化步骤之 前，在加工过程中活化并释放GF(Mazzucco等人，2009)。这种不受控制的活化可进一步增 加在使用不同PRP制备系统时最终产品组成的变化。另外，自体PRP制剂的一个主要固有 弱点在于血小板GF含量在个体中不同，并因此可导致次最佳的结果。最后，当处理自体PRP 时，应考虑专用设备、一次性PRP加工试剂盒以及对专门人才的需要所造成的经济负担。
[0011]
【背景技术】包括 Su 等人"A virally inactivated functional growth factor preparation from human platelet concentrates" · Vox Sang. 2009 年 8 月；97 (2)： 119-128 ；Burnouf 等人"A novel virally inactivated human platelet lysate preparation rich in TGF-beta，EGF and IGF，and depleted of PDGF and VEGF". Biotechnol Appl Biochem. 2010 年 8 月 6 日；56 (4) :151-60 ;和美国专利公开 US 2012-0156306。
【发明内容】
[0012] 在一个方面，本发明涉及一种用于制备病毒安全生物液体混合物的方法，所述方 法包括以下步骤：提供生物液体混合物；进行溶剂/洗涤剂（S/D)病毒灭活处理；使经S/D 处理的混合物与两亲性聚合物接触；通过疏水作用色谱（HIC)和/或通过油提取移除S/D ; 收集包含来自HIC的流过级分和/或来自油提取的液体级分的材料；以及使材料经受至少 再一次正交病毒灭活处理。
[0013] 在本发明的一个实施例中，两亲性聚合物为无毒的。
[0014] 然而，在本发明的另一个实施例中，两亲性聚合物为烃基表面活性剂。
[0015] 然而，在本发明的另一个实施例中，两亲性聚合物具有约3. 5千道尔至小于约40 千道尔顿范围内的平均分子量。
[0016] 在本发明的一个实施例中，平均分子量为约30千道尔顿。
[0017] 然而，在本发明的另一个实施例中，烃基表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
[0018] 在本发明的一个实施例中，PVP具有约30千道尔顿（kDa)的平均分子量。
[0019] 在本发明的一个实施例中，HIC包括以下步骤：将经S/D处理的和聚合物接触的混 合物上样到HIC ;利用包含有机溶剂和/或盐的溶液进行洗涤；以及收集经洗涤的级分。
[0020] 在本发明的一个实施例中，有机溶剂为乙醇。
[0021] 在本发明的一个实施例中，盐为氯化钠。
[0022] 在本发明的另一个实施例中，所述至少再一次正交病毒灭活处理包括热灭活。
[0023] 在本发明的一个实施例中，所述方法还包括浓缩材料的步骤。
[0024] 在本发明的一个实施例中，所述方法用于制备病毒安全血小板提取物，并且生物 液体混合物为富含血小板的级分。
[0025] 在本发明的一个实施例中，所收集的材料包含与HIC洗涤级分混合的HIC流过级 分。
[0026] 在另一方面，本发明涉及一种可根据本发明的方法获得的病毒安全生物液体混合 物。
[0027] 在本发明的一个实施例中，PVP K25的浓度在0· 1% (w/w)至低于1% (w/w)的范 围内。
[0028] 在本发明的某些实施例中，PVP K25的浓度在0. 1% (w/w)至0. 5% (w/w)范围内。
[0029] 在本发明的一个实施例中，病毒安全生物液体混合物中的PVP K17、K25、K30浓度 在 0.01-5 % (w/w)范围内。
[0030] 在本发明的某些实施例中，生物液体混合物为富含H)GF-AB、TOGF-BB、EGF、VEGF 和/或bFGF的血小板提取物。
[0031] 在另一方面，本发明涉及从包含溶剂-洗涤剂（S/D)的生物液体混合物移除S/D 的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含S/D的混合物；使混合物与两亲性聚合物接触； 通过疏水作用色谱（HIC)和/或通过油提取从混合物移除S/D ;以及收集包含来自HIC的 流过级分和/或来自油提取的液体级分的材料。
[0032] 在本发明的一个实施例中，两亲性聚合物为无毒的。
[0033] 在本发明的一个实施例中，生物液体混合物为富含血小板的级分。
[0034] 在本发明的另一个实施例中，混合物包含趋化因子、细胞因子、生长因子、营养因 子或者它们的混合物。
[0035] 在本发明的一个实施例中，HIC包括以下步骤：利用包含有机溶剂和/或盐的溶液 进行洗涤；以及收集经洗涤的级分。
[0036] 在本发明的一个实施例中，两亲性聚合物为烃基表面活性剂。
[0037] 在本发明的一个实施例中，烃基表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
[0038] 在本发明的一个实施例中，有机溶剂为乙醇。
[0039] 在本发明的一个实施例中，盐为氯化钠。
[0040] 在本发明的一个实施例中，所收集的材料包含与洗涤级分混合的流过级分。
[0041] 在本方法的一个实施例中，源首先与S/D进行接触，然后与两亲性聚合物进行接 触。
[0042] 在本方法的一些实施例中，经S/D处理的源中的PVP浓度在约0. 01至0. 9mM、0. 01 至0. 3mM、或者0. 025至0. 3mM的范围内。
[0043] 在本方法的一些实施例中，经S/D处理的源中的HPMC浓度在约0. 01至0. 3mM范 围内。
[0044] 在一些实施例中，所述方法还包括干燥材料的步骤，从而导致生物干燥混合物。
[0045] 在某一方面，公开了一种用于从生物源制备生物液体混合物组合物的方法。所述 方法包括以下步骤：提供源；提供PVP和/或HPMC ;利用溶剂洗涤剂（S/D)处理源以允许病 毒灭活，并且利用PVP和/或HPMC进行处理；通过使经处理的源与疏水作用色谱（HIC)树 脂接触来移除S/D ;以及收集包含来自HIC的未结合级分的材料。
[0046] 在某一方面，公开了一种可根据本发明所公开的方法获得的生物液体混合物组合 物。
[0047] 在一个实施例中，组合物包括约0. 07至6mM、0. 07至2mM或者0. 17至2mM的范围 内的PVP浓度。
[0048] 在另一个实施例中，组合物包括约0. 07至I. 5mM范围内的HPMC浓度。
[0049] 在某一方面，公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含两亲性聚合物；选自趋 化因子、生长因子、细胞因子、营养因子及其混合物的血小板衍生蛋白质；和药学上可接受 的载体，其中所述两亲性聚合物为浓度在约〇. 07至6mM的范围内的PVP或浓度在约0. 07 至I. 5mM的范围内的HPMC。
【附图说明】
[0050] 图1示出了利用在S/D移除（处理2和处理4)之前通过使裂解物与肝素接触获 得的血小板提取物处理的3T3成纤维细胞的增殖。在S/D移除之前裂解物未与肝素接触的 前提下制备的血小板提取物用作对照组（处理1和3)。
[0051] 图2示出了利用在S/D移除（处理2)之前或期间通过使裂解物与低分子量肝素 (LMWH)接触制备的血小板提取物处理的3T3成纤维细胞的增殖。在S/D移除之后在不存在 裂解物与低分子量肝素（LMWH)接触的前提下获得的血小板提取物用作对照组（处理1)。
[0052] 图3示出了利用在S/D移除之后在存在不同分子量PVP聚合物的情况下获得的提 取物处理的3T3成纤维细胞的增殖：PVP K25-处理3 ;或者PVP K30-处理7。
[0053] 图4示出了利用包括不同浓度PVP的提取物处理的3T3成纤维细胞的增殖。样 品17 (处理17)和样品19 (处理19)在S/D移除的第二洗涤方面为不同的，其中分别使用 0· 1%和 0· 5%的 PVP。
[0054] 图5示出了利用在PVP K25(处理1)存在下S/D移除之后或者在肝素（处理2) 存在下S/D移除之后获得的大规模血小板提取物处理的3T3成纤维细胞的增殖。
[0055] 此外，所有图包括通过GraphPad Prism软件计算的R2拟合，半数有效浓度（EC50) 和95%置信区间EC50值。
[0056] 图6示出了执行手术后2星期时的大鼠背侧皮瓣（3X IOcm)。沿头至尾的方向抬 高皮瓣。A，B，C，D和E被采用样品用于组织学分析的不同区域。A最靠近尾侧皮瓣附接部 分，并且因此愈合最好，而E处于皮瓣的头部，其显示最高程度的坏死（黑色）。通过腹侧中 线切口（沿皮瓣中心的线）移除腹部和胸部脏器。
[0057] 图7示出了正常和愈合皮肤的典型着色图案：H&E着色（表皮增生，分数1并且表 皮完全愈合处理后，分数0)，真皮和表皮增殖的PCNA着色（增殖组织，分数1并且正常组 织，分数〇)以及角蛋白6着色（上基底着色，分数1，对于愈合，并且对于正常皮肤的基部着 色，分数〇)。
[0058] 图8示出了 2周后大鼠背侧皮瓣附着性等级的分数，在通过利用组织镊子轻轻地 牵拉区域A_C(参见图6)中的皮瓣远离创面来对其进行测试时。将皮瓣附接到下层组织与 皮肤的正常区域的附接对比，并且如下将等级分为1至3 :1 =皮瓣与下层组织之间无粘附 性至低附着性，2 =皮瓣与下层组织之间低于但接近正常粘着性，或者3 =皮瓣与下层组织 之的约正常粘着性。
【具体实施方式】
[0059] 本发明涉及一种用于制备病毒安全生物液体混合物诸如病毒安全的血小板提取 物的方法。血小板包含涉及组织再生和愈合过程的关键阶段的一整套因子。目前，将完整 的自体活化血小板（来源于患者）用于促进伤口愈合。然而，使用完整的自体血小板存在 多个缺点，特别是缺乏标准化；愈合所需的因子在患者自身的血小板中可能缺乏；制备血 小板因子混合物需要专用设备；程序耗时并且需要对患者自身进行附加步骤；以及需要经 过医学培训的人员。这些问题可例如通过使用由多个供体制得的血小板提取物来解决。
[0060] 然而，来源于人类血液的产品可存有传播感染原诸如病毒的风险。有效地降低病 毒传播风险可通过包括至少两次正交病毒灭活步骤而实现。另外，在血小板提取物的制造 中包括附加步骤可影响其中所含因子的回收率和活性。
[0061] 病毒灭活的这些方法中的一个为"溶剂洗涤剂（S/D)病毒灭活处理"。
[0062] 这种灭活包括利用S/D处理和移除S/D。根据本发明可发现，在通过HIC移除S/D 之后某些生长因子的回收率受损。
[0063] 根据本发明可发现，可通过在移除S/D之前和/或期间使经S/D处理的材料与聚 乙烯吡咯烷酮（PVP)或羟丙基甲基纤维素（HPMC) (PVP和HPMC均为无毒两亲性分子）接触 来增加某些血小板因子例如I3DGF-AB JDGF-BB ;和bFGF的回收率。
[0064] 根据本发明可发现，使经S/D处理的材料与PVP和HPMC接触导致TOGF-AB和其他 血小板因子例如I 3DGF-BB和bFGF增加的回收率或富集。
[0065] 在S/D移除期间，从使经S/D处理的材料与肝素和低分子量肝素（两者皆已知为 绑定特定生长因子）接触来增加因子的回收率，同时从使经S/D处理的材料与PVP接触的 角度来讲，这些发现为令人惊讶的，所述PVP为完全不同的化合物（具有两亲性特性），其具 有S/D移除期间对生长因子回收率相似的有利影响。
[0066] 另外，这些发现令人惊讶，因为添加 PVP K30、K25、K17和K12在某些测试条件下不 影响S/D移除。
[0067] 据发现，利用根据本发明的方法从包括源自血小板的因子混合物的源移除S/D导 致高因子回收率、高生物活性和有效的S/D移除。
[0068] 据发现，在S/D移除期间利用PVP Κ12、Κ17、Κ30或PVP Κ25增加血小板生长/营 养因子的回收率。据发现，利用Κ30的回收率高于利用Κ25的回收率。利用PVP Κ25获得 并且因此包括PVP Κ25的材料比利用PVP Κ30获得包括PVP Κ30的材料具有更高的增殖活 性。
[0069] 结果还显示，可能的是，使与血小板因子混合物接触的PVP Κ25浓度降低到低于 0. 5%或0. 17mM(从而使PVP在S/D移除后获得的提取物中降低到低于0. 5%或0. 17mM)， 并且仍获得因子回收率的增加同时维持HIC的能力以有效地移除S/D。
[0070] 结果显示，提取物中不同量的PVP K25,例如0. 1% (0. 03mM)和0. 5% (0. 17mM)不 影响其活性。
[0071] 结果显示，不同于处于一定浓度的肝素和硫酸葡聚糖，最终提取物中PVP的存在 不抑制凝血酶活性。当将纤维蛋白粘合剂用作血小板提取物（"血小板提取物"为一种生 物液体混合物组合物）的递送剂时，PVP的这种特性是特别重要的。
[0072] 结果显示，在存在PVP K25的情况下在大规模处理中生长因子回收率和活性相当 于小规模中的那些。
[0073] 这些结果表明，在S/D移除期间可有利地使用PVP以便获得具有增加的生物效能 的最终提取物，前提条件是所使用PVP的类型及其浓度（例如，混合物中PVP的w/w或摩尔 浓度）不影响S/D移除。
[0074] 在一个实施例中，在S/D移除步骤期间使生物源与PVP (PVP与乙醇和氯化钠混合） 接触之后，获得了血小板提取物。提取物包括roGF-AB/TGF-β I TDGF-AB/VEGF JGF-β 1/ bFGF ;和VEGF/bFGF比率，这些比率类似于经洗涤的白细胞减除单采血小板（WAP-LR)的原 料中和S/D移除之前材料中的比率。
[0075] 这些发现为制备根据本发明的生物液体混合物组合物提供了准备。
[0076] 本发明的方法允许制备下述血小板提取物，该血小板提取物在S/D移除之后具有 细胞因子、生长因子、趋化因子和/或营养因子增加的回收率。
[0077] 本发明公开了一种用于从生物源制备病毒安全生物液体混合物组合物的方法，该 方法包括以下步骤：提供源；提供两亲性聚合物；利用溶剂洗涤剂（S/D)处理源以允许病毒 灭活，并且利用两亲性聚合物进行处理；
[0078] 通过使经处理的源与疏水作用色谱（HIC)树脂接触来移除S/D ;以及收集包含来 自HIC的未结合级分的材料；其中该方法包括至少再一次正交病毒灭活处理，从而获得病 毒安全生物液体混合物组合物。
[0079] 在一个方面，本发明提供用于制备病毒安全生物液体混合物的方法，该方法包括 以下步骤：
[0080] 提供源；进行溶剂/洗涤剂（S/D)病毒灭活处理；
[0081] 使经S/D处理的材料与无毒的两亲性聚合物接触；通过疏水作用色谱（HIC)和/ 或通过油提取来移除S/D ;和使材料经受至少再一次正交病毒灭活处理。
[0082] 源的实例包括但不限于体液，诸如血液；血液级分、冷沉淀物、细胞培养物、亲脂性 蛋白剂；细胞、细胞粒子和/或细胞器；细胞裂解物；血小板裂解物；血沉棕黄层；动物组织 提取物，诸如牛肺、牛肠或动物骨提取物明胶、牛血清白蛋白，以及来源于动物的与水不混 溶的脂肪，诸如羊毛脂。源可源自多个供体。
[0083] 在一个方面，本发明公开了一种用于从包含S/D的生物源中移除溶剂-洗涤剂（S/ D)的方法，该方法包括以下步骤：提供源；提供两亲性聚合物；利用S/D并且利用两亲性聚 合物处理源；通过使经处理的源与疏水作用色谱（HIC)树脂接触从生物源中移除S/D ;以及 收集包含来自HIC的未结合级分的材料。
[0084] 在一个实施例中，移除S/D的方法省略了油提取的另外的步骤。
[0085] 已发现，本发明的方法可用于在不存在油提取分离的步骤情况下移除S/D。
[0086] 在一个实施例中，本发明涉及一种用于制备病毒安全的血小板提取物的方法，该 方法包括以下步骤：提供来自多于一个供体的富含血小板的级分；进行溶