专利名称：在制备抗毒素、抗血清中灭活病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种在制备抗毒素、抗血清过程中同时灭活病毒的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
抗毒素、抗血清(Antitoxin/Antiserum)是指采用特定的抗原免疫动物后，再收集高效价免疫血清，并经过提取、纯化后，制备出含完整抗体(IgG)或抗体片段[F(ab’ )2]的免疫球蛋白制品。以用于预防和治疗各相应疾病引起的感染。由于抗毒素、抗血清原料来源于马匹，而马匹又饲养在开放的环境中，其可能携带的病毒较多，因而该制品存在生物安全性问题。为了保证该制品的安全性，除要控制免疫马匹饲养环境和原料血浆质量外，在抗毒素、抗血清生产过程中，如何有效除去或灭活原料血浆中的病毒，是获得安全可靠的抗毒素、抗血清等血液制品的关键问题。目前国内外较为成熟的病毒灭活/去除方法有巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/ 去污剂法、纳米膜过滤法、光化学法等，但对于动物源性生化提取制品，尤其是规模化生产的抗毒素、抗血清的灭活病毒工艺，国内外至今未见报道。巴氏消毒法和干热法属热力处理灭活病毒方法，即通过热力使病毒蛋白变性，以破坏病毒结构从而灭活病毒，但同时热力也存在会使蛋白制品变性或生物活性降低的问题，故采用上述两种方法灭活病毒时，常需在蛋白制品中加入保护剂，但同时保护剂在保护蛋白制品的同时也保护了病毒，降低了病毒灭活率，从而加大了病毒灭活的难度。纳米膜过滤法主要利用病毒颗粒与蛋白分子的大小差异，通过纳米级的滤膜把病毒除去，但只适于小分子(直径较小)的蛋白制品，不适于大分子(较大直径)的蛋白制品，且纳米膜价格昂贵。 光化学法是利用某些光敏剂对病毒表面及病毒核酸结构具有强烈的亲和作用，在适当波长的光照下易激活，从而通过光化学作用破坏与其接触的病毒结构的方法，但该方法对一些蛋白活性损伤较大。有机溶剂/去污剂法是利用有机溶剂和去污剂的配伍，破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而达到灭活病毒的目的。该方法有很好的蛋白质兼容性，能有效灭活病毒，且对蛋白的结构和功能的影响甚微，但如何从制品中除去加入的有机溶剂和去污剂，则是该方法最大的难点。
发明内容
针对现有生物制品中病毒灭活或去除存在的操作时间长，容易造成活性物质失活，病毒灭活不彻底，适用范围受限等不足，本发明提供一种简单、快速、经济、适用范围广的，能在制备抗毒素、抗血清过程中，同时灭活存在于血液中的病毒的方法，以保证抗毒素、 抗血清制品能够更安全有效地应用于临床。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种在制备抗毒素、抗血清中灭活病毒的方法，其特征在于包括下列步骤A、将血浆原料稀释2 4倍体积后，调节稀释液pH值至2.8 4. 0 ；
B、在每IOOml步骤A的稀释液中，加入0.1 l.Og胃酶，于四 311下消化1 3小时，或者于20 22°C下消化20 22小时，得消化液；
C、在每IOOml步骤B的消化液中，加入14 16g硫酸铵，并调节混合液pH值至4. 8 5. 6，加热混合液至57 59°C，并保持30分钟，降温至45 °C以下，分离，得上清液；
D、将步骤C的上清液稀释至所含蛋白浓度为10 50g/L，在该稀释液中加入有机溶剂和去污剂，直至每IOOml稀释液中含有0. 25 1. 35g的有机溶剂，每IOOml稀释液中含有 1. 00 1. 35g的去污剂，于M 37°C水浴中恒温4 6小时，得混合液；
E、在每IOOml步骤D的混合液中，加入15 25g硫酸铵，静置90 180分钟，分离去上清液，得沉淀物；
F、将步骤E的沉淀物稀释至蛋白含量低于20g/L,调整稀释液pH值为7. 7 7. 9，并按每IOOml稀释液加入0. 6 1. Og明矾的量，在稀释液中加入明矾，静置60 120分钟后， 过滤得上清液；
G、将步骤F的上清液用3 5万分子量的滤膜，浓缩至五分之一体积时，在浓缩液中加入20mM、pH值为6. 0 8. 0、加入量是步骤A的原料血浆体积的2 5倍的PB进行置换、 浓缩，直至硫酸铵含量低于1. 0 g/L，得浓缩液；
H、将步骤F的浓缩液，经离子交换层析后，得收集液，按常规对收集液进行除菌、过滤后，分装得灭活病毒的抗毒素、抗血清制品。所述步骤A、D、F的稀释是采用注射用水或者质量浓度为0. 8 1. 0%的NaCL溶液进行稀释的。所述步骤A的稀释液PH值是用1 4N的盐酸溶液调整的，酸浓度过大，则会使pH 值的精确控制变为困难，酸浓度太小时，又会增加溶液(体积)的加入量，使待处理的制品浓度过稀。所述步骤C的混合液PH值、步骤F的稀释液是用1 4N的氢氧化钠溶液调整的， 碱浓度过大，则会使PH值的精确控制变为困难，碱浓度太小时，又会增加过量(体积)的溶液，使待处理的制品浓度过稀。所述步骤D的有机溶剂为医用级的磷酸三丁酯；去污剂为医用级的聚山梨酯-80 或"Triton X-100中的一种，其中聚山梨酯_80终浓度为每IOOml稀释液中含有1.00 1. 35g的聚山梨酯-80，Triton X-100终浓度为每IOOml稀释液中含有1. 00 1. 35g的 Triton X-IOO0所述步骤H的离子交换层析的介质为Q Sepharose Fast Flow ,DEAE Sepharose Fast Flow中的一种阴离子交换剂。所述抗血清制品包括破伤风抗毒素、抗狂犬病血清或抗蛇毒血清。本发明具有下列优点和效果采用上述方案，能在制备抗毒素、抗血清过程中，用有机溶剂和去污剂破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而彻底灭活血浆中残留的病毒，同时保持蛋白的结构和功能，之后再用离子交换层析，有效除去有机溶剂和去污剂的残留，使制品纯度进一步提高，因为所选用的有机溶剂及去污剂为非离子型，不会与离子交换剂结合，而制品中的蛋白则能与离子交换剂结合，从而使有机溶剂和去污剂与蛋白完全分离，之后再在离子交换分离清洗过程中，除去有机溶剂和去污剂，不仅病毒灭活操作简单，处理时间短，经济实用，而且所得制品纯度高、安全性好。本发明作了经离子交换层析后TNBP、Trit0n X-100残留量实验，实验结果见表1。表1
样品残凿靈(ug/ml)TIBPTriton X-10020100901201009022010C903201009012010090220100903屋析液2.22. 22.4碰出未检出
从表中可见，经离子交换层，TNBP, Triton X_100残留量均低于限定值，即 TNBP 彡 10ug/ml, Triton X-100 彡 10ug/ml。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作更详细的介绍。实施例1
在制备破伤风抗毒素中灭活病毒的方法，包括下列步骤
A、将马血浆原料用注射用水稀释2倍体积后，用IN的盐酸溶液调节稀释液pH值至
2. 8 ；
B、在每IOOml步骤A的稀释液中，加入0.Ig胃酶，于下消化3小时，得消化液；
C、在每IOOml步骤B的消化液中，加入14g硫酸铵，并用IN的氢氧化钠溶液调节混合液PH值至4. 8，加热混合液至57°C，并保持30分钟，降温至45°C以下，分离，得上清液；
D、将步骤C的上清液用注射用水稀释至所含蛋白浓度为10g/L，在该稀释液中加入医用级有机溶剂磷酸三丁酯和医用级去污剂Triton X-100，直至每100ml稀释液中含有磷酸三丁酯0. 25g，每100ml稀释液中含有1. 00g Triton X-100，于水浴中恒温6小时，得混合液；
E、在每100ml步骤D的混合液中，加入15g硫酸铵，静置90分钟，分离去上清液，得沉淀物；
F、将步骤E的沉淀物用注射用水稀释至蛋白含量低于20g/L，用IN氢氧化钠溶液调整稀释液PH值为7. 7，并按每100ml稀释液加入0. 6g明矾的量，在稀释液中加入明矾，静置 120分钟后，过滤得上清液；
G、将步骤F的上清液用3万分子的滤膜，浓缩至五分之一体积时，在浓缩液中加入 20mM、pH值为7. 0、加入量是步骤A的马原料血浆体积的2倍的PB进行置换、浓缩，直至硫酸铵含量低于1. 0 g/L，得浓缩液；
H、将步骤F的浓缩液，经过其上装有介质为QSepharose Fast Flow阴离子交换剂的离子交换层析后，得收集液，按常规对收集液进行除菌、过滤后，分装得灭活病毒的破伤风抗毒素制品。实施例2
在制备抗狂犬病血清中灭活病毒的方法，包括下列步骤
A、将血浆原料用注射用水稀释4倍体积后，用4N盐酸溶液调节稀释液pH值至4.0；
B、在每100ml步骤A的稀释液中，加入Ig胃酶，于31°C下消化1小时，得消化液；
5C、在每IOOml步骤B的消化液中，加入16g硫酸铵，并用4N的氢氧化钠溶液调节混合液PH值至5. 6，加热混合液至59°C，并保持30分钟，降温至45 °C以下，分离，得上清液；
D、将步骤C的上清液用注射用水稀释至所含蛋白浓度为50g/L，在该稀释液中加入医用级有机溶剂磷酸三丁酯和医用级去污剂Triton X-100，直至每IOOml稀释液中含有磷酸三丁酯1.35 g，每IOOml稀释液中含有1.35g Triton X-100，于37°C水浴中恒温4小时，得混合液；
E、在每IOOml步骤D的混合液中，加入25g硫酸铵，静置180分钟，分离去上清液，得沉淀物；
F、将步骤E的沉淀物用注射用水稀释至蛋白含量低于20g/L，用4N氢氧化钠溶液调整稀释液PH值为7. 9，并按每IOOml稀释液加入1. Og明矾的量，在稀释液中加入明矾，静置 60分钟后，过滤得上清液；
G、将步骤F的上清液用5万分子的滤膜，浓缩至五分之一体积时，在浓缩液中加入 30mM、pH值为7. 6、加入量是步骤A的原料血浆体积的5倍的PB进行置换、浓缩，直至硫酸铵含量低于1.0g/L，得浓缩液；
H、将步骤F的浓缩液，经过其上装有介质为DEAESepharose Fast Flow阴离子交换剂的离子交换层析后，得收集液，按常规对收集液进行除菌、过滤后，分装得灭活病毒的抗狂犬病血清制品。 实施例3
在制备抗蛇毒血清中灭活病毒的方法，包括下列步骤
A、将血浆原料用质量浓度为0.8%的NaCL溶液稀释3倍后，用3N盐酸溶液调节稀释液 pH值至3. 2 ；
B、在每IOOml步骤A的稀释液中，加入0.5 g胃酶，于20°C下消化22小时，得消化液；
C、在每IOOml步骤B的消化液中，加入15g硫酸铵，并用3N的氢氧化钠溶液调节混合液PH值至5. 0，加热混合液至57°C，并保持30分钟，降温至45°C以下，分离，得上清液；
D、将步骤C的上清液用质量浓度为0.8%的NaCL溶液稀释至所含蛋白浓度为25 g/ L，在该稀释液中加入医用级有机溶剂磷酸三丁酯和医用级去污剂聚山梨酯-80，直至每 IOOml稀释液中含有磷酸三丁酯0.85 g，每IOOml稀释液中含有1. 20 g聚山梨酯-80，于
水浴中恒温5小时，得混合液；
E、在每IOOml步骤D的混合液中，加入18g硫酸铵，静置100分钟，分离去上清液，得沉淀物；
F、将步骤E的沉淀物用质量浓度为0.8%的NaCL溶液稀释至蛋白含量低于20 g/L，用 3N氢氧化钠溶液调整稀释液pH值为7. 8，并按每IOOml稀释液加入0. 8 g明矾的量，在稀释液中加入明矾，静置100分钟后，过滤得上清液；
G、将步骤F的上清液用5万分子的滤膜，浓缩至五分之一体积时，在浓缩液中加入 25mM、pH值为7. 4、加入量是步骤A的原料血浆体积的3倍的PB进行置换、浓缩，直至硫酸铵含量低于1.0 g/L，得浓缩液；
H、将步骤F的浓缩液，经过其上装有介质为QSepharose Fast Flow阴离子交换剂的离子交换层析后，得收集液，按常规对收集液进行除菌、过滤后，分装得灭活病毒的抗蛇毒血清制品。
实施例4
在制备抗蛇毒血清中灭活病毒的方法，包括下列步骤
A、将血浆原料用质量浓度为1.0%的NaCL溶液稀释3倍后，用3N盐酸溶液调节稀释液 pH值至3.6 ；
B、在每IOOml步骤A的稀释液中，加入0.7 g胃酶，于22°C下消化20小时，得消化液；
C、在每IOOml步骤B的消化液中，加入15g硫酸铵，并用3N的氢氧化钠溶液调节混合液PH值至5. 0，加热混合液至57°C，并保持30分钟，降温至45°C以下，分离，得上清液；
D、将步骤C的上清液用质量浓度为1.0%的NaCL溶液稀释至所含蛋白浓度为35g/ L，在该稀释液中加入医用级有机溶剂磷酸三丁酯和医用级去污剂聚山梨酯-80，直至每 IOOml稀释液中含有磷酸三丁酯0. 90 g，每IOOml稀释液中含有1.20 g聚山梨酯-80，于 25°C水浴中恒温5小时，得混合液；
E、在每IOOml步骤D的混合液中，加入20g硫酸铵，静置100分钟，分离去上清液，得沉淀物；
F、将步骤E的沉淀物用质量浓度为1.0%的NaCL溶液稀释至蛋白含量低于20 g/L，用 3N氢氧化钠溶液调整稀释液pH值为7. 8，并按每IOOml稀释液加入0. 8 g明矾的量，在稀释液中加入明矾，静置100分钟后，过滤得上清液；
G、将步骤F的上清液用5万分子的滤膜，浓缩至五分之一体积时，在浓缩液中加入 25mM、pH值为7. 2、加入量是步骤A的原料血浆体积的4倍的PB进行置换、浓缩，直至硫酸铵含量低于1.0 g/L，得浓缩液；
H、将步骤F的浓缩液，经过其上装有介质为QSepharose Fast Flow阴离子交换剂的离子交换层析后，得收集液，按常规对收集液进行除菌、过滤后，分装得灭活病毒的抗蛇毒血清制品。为表明本发明在制备抗毒素、抗血清过程中，彻底灭活血浆中残留的病毒的灭活效果，下面通过检测实例加以验证，其中灭活效果的检测是依据国药监注[2002]第160号文进行的
A)各取三批马血浆样品用注射用水稀释至3倍体积，分别加入水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV，滴度为8. 0 TCID50/ml)和脊髄灰质炎病毒 (P0li0Virus，PV-l，滴度为9.0 TCID50/ml)为指示病毒，Vero细胞为病毒检测用细胞。按实施例1的方法制得灭活病毒的破伤风抗毒素制品；
B)同时留存部分病毒作对照；
C)病毒检测
采用96孔培养板微量法培养4天观察，用Karber法计算病毒滴度，以评估灭活病毒的效率。病毒灭活验证方案设未处理的含病毒的阳性对照、S/D系统空白对照(含病毒)，无病毒阴性对照，验证结果见表2。注每组数据重复测定两次，取平均值。验证结论在本发明方法中，有机溶剂/去污剂(S/D)处理0.5h、1.0h、2.0h和 4. Oh后，可分別将样品中8.5 logs的水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)和9.0 logs的脊髄灰质炎病毒(Poliovirus，PV-I )降到2. 0 3. 0 logs，且重复三次检测数据相近，根据国药监注[2002]160号文的规定，认定本方法为有效的病毒灭活方法。为有效保证抗毒素、抗血清的质量及其安全性，按本发明实施例1连续生产的三批破伤风抗毒素制品进行检测，检测结果见表3。表2S/D法灭活病毒工艺验证结果
权利要求
1.一种在制备抗毒素、抗血清中灭活病毒的方法，其特征在于包括下列步骤A、将血浆原料稀释2 4倍体积后，调节稀释液pH值至2.8 4. 0 ；B、在每IOOml步骤A的稀释液中，加入0.1 l.Og胃酶，于四 311下消化1 3小时，或者于20 22°C下消化20 22小时，得消化液；C、在每IOOml步骤B的消化液中，加入14 16g硫酸铵，并调节混合液pH值至4. 8 5. 6，加热混合液至57 59°C，并保持30分钟，降温至45 °C以下，分离，得上清液；D、将步骤C的上清液稀释至所含蛋白浓度为10 50g/L，在该稀释液中加入有机溶剂和去污剂，直至每IOOml稀释液中含有0. 25 1. 35g的有机溶剂，每IOOml稀释液中含有 1. 00 1. 35g的去污剂，于M 37°C水浴中恒温4 6小时，得混合液；E、在每IOOml步骤D的混合液中，加入15 25g硫酸铵，静置90 180分钟，分离去上清液，得沉淀物；F、将步骤E的沉淀物稀释至蛋白含量低于20g/L,调整稀释液pH值为7. 7 7. 9，并按每IOOml稀释液加入0. 6 1. Og明矾的量，在稀释液中加入明矾，静置60 120分钟后， 过滤得上清液；G、将步骤F的上清液用3 5万分子量的滤膜，浓缩至五分之一体积时，在浓缩液中加入20mM、pH值为6. 0 8. 0、加入量是步骤A的原料血浆体积的2 5倍的PB进行置换、 浓缩，直至硫酸铵含量低于1.0 g/L，得浓缩液；H、将步骤F的浓缩液，经离子交换层析后，得收集液，按常规对收集液进行除菌、过滤后，分装得灭活病毒的抗毒素、抗血清制品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A、D、F的稀释是采用注射用水或质量浓度为0. 8 1. 0%的NaCl溶液进行稀释的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A的稀释液pH值、步骤C的混合液 PH值，是用1 4N的盐酸溶液调整的。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤F的稀释液pH值是用1 4N的氢氧化钠溶液调整的。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤D的有机溶剂为医用级的磷酸三丁酯；去污剂为医用级的聚山梨酯-80或Triton X-100中的一种，其中聚山梨酯_80终浓度为每IOOml稀释液中含有1. 00 1. 35g的聚山梨酯-80, Triton X-100终浓度为每IOOml 稀释液中含有1. 00 1. 35g的Triton X-IOO0
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤H的离子交换层析的介质为Q Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow 中的一种阴离子交换剂。
全文摘要
本发明提供一种在制备抗毒素、抗血清中灭活病毒的方法，它将原料马血浆稀释并经胃酶消化、加温变性去沉淀后，加入有机溶剂和去污剂进行病毒灭活，再经硫酸铵盐析分离、明矾吸附、超滤浓缩/脱盐、离子交换层析得收集液，经除菌过滤后，分装得制品。通过有机溶剂和去污剂破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而彻底灭活血浆中残留的病毒，同时保持蛋白的结构和功能，之后再有效除去有机溶剂和去污剂的残留，使制品纯度进一步提高，不仅病毒灭活操作简单，处理时间短，经济实用，而且所得制品纯度高、安全性好。
文档编号C07K16/06GK102532306SQ201210004548
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者吴笛, 杨冬, 罗靖雄 申请人:玉溪九洲生物技术有限责任公司