专利名称：仙台病毒实时荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒检测方法，具体的地说是一种仙台病毒 实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
仙台病毒(Sendai virus)属RNA病毒中的副黏液病毒科第一型，可在小鼠、大鼠、 豚鼠等多种啮齿类实验室动物中导致自然感染甚至死亡，小鼠仙台病毒很难控制，常呈隐 性感染，急性型多见于20日龄左右乳鼠，表现呼吸道症状。仙台病毒感染可对实验研究产 生严重干扰，如改变体液和细胞介导的免疫应答，可改变被感染的肿瘤细胞的表面抗原及 其致癌性。目前，检测各种病毒的方法很多，如血清学试验、组织块培养和共培技术、核酸杂 交和常规PCR检测技术等，其中常规PCR检测技术敏感性、特异性、稳定性和可操作性都比 较好，但常规PCR反应后的处理存在交叉污染，也比较容易出现假阳性结果，并且实验时间 也相对较长。而实时荧光定量PCR检测技术就填补了以上的缺陷，无论是在研究中还是在 临床样品的检测上，实时荧光定量PCR快速、敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有 效方法。实时荧光定量PCR技术具有以下优点=(I)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和 光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时 反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污 染系统，所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种仙台病毒实时荧光 定量PCR检测方法，该检测方法的检测灵敏度可达到1. 0 X IO4个拷贝的病毒分子，对于单 个样本检测时间为2个小时，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、 重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。按照本发明提供的技术方案，所述仙台病毒实时荧光定量PCR方法包括步骤如 下1、标准质粒的构建在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得 仙台病毒的保守基因，利用基因克隆技术构建含有该保守基因序列的标准质粒分子；2、特异性引物及荧光探针的设计以步骤1中选取的高度保守序列为基准，设计 一对特异性引物及一条荧光探针；设计原则为每条引物的长度为18-25个碱基，荧光探针 长度为20 30个碱基；特异性引物和荧光探针中GC含量要求在40-60%，理论Tm> 50°C; 特异性引物和荧光探针自身以及特异性引物和荧光探针之间的3’端避免碱基配对；选用 的特异性引物和荧光探针要设计在仙台病毒基因中的保守区，只对仙台病毒特异，和其他 物种无交叉反应；荧光探针应位于一对特异性引物之间的区域；所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中
正向引物的序列为5，-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3，，反向引物的序列为5，-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3，；所述荧光探针的序列为5，-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3，；3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线，包括步骤(1)模板的制备将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下定量 标准质粒为2. 98 X IO9拷贝/ μ 1，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为 1.0Χ ΙΟ8、1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4 的稀释液，稀释液在-20°C条件下保存备 用；(2)实时荧光定量PCR反应体系25μ 1 的 PCR 反应体系含有成分如下DEPC 水，15. 75μ 1 ； 10XPCR buffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循环反应根据步骤⑵中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(4)建立检测标准曲线荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始 模板数对数为X轴，Ct值为y轴的标准曲线；4、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备，包括步骤(1)采用Trizol法提取感染病毒样本的RNA ；(2) ffl Invitrogen & 目 ! # 白勺 SuperScriptTM Preamplification System forFirst Strand cDNA Synthesis 试剂盒做反转录，制备 cDNA ；5、有效性验证及结果检测判定(1)利用未感染仙台病毒小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系25μ 1的阴 性对照PCR反应体系为含有成分如下DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10XPCRbuffer, 2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；未感染仙台病毒小鼠的cDNA，1 μ 1 ；利用感染仙台病毒小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系25 μ 1的阳性对照 PCR 反应体系为含有成分如下DEPC 水，15. 75 μ 1 ;10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ；300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染仙台病毒小鼠的cDNA, 1 μ 1 ；(2)循环反应按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(3)有效性验证
荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对 照应无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其Ct值应< 30，否则重 做。本发明采用实时定量荧光PCR进行仙台病毒的特异性检测，具有以下优点(1)、特异性好由于TagMan荧光探针定量使用杂交对定量分子进行甄别，具有很 高的准确性，同时，靶序列由引物和荧光探针双重控制，特异性好，假阳性低。(2)、灵敏度高荧光检测技术是一个很灵敏的检测技术，因此TagMan检测的灵敏 度很高。(3)、线性关系好由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过 荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。(4)、操作简单，自动化程度高、防污染；使用TagMan荧光探针定量扩增和检测可 以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染。同时扩增和检测一步完成，操作简单，易于实现 自动化。
图1为仙台病毒的检测标准曲线。图2为仙台病毒PCR电泳图谱。
具体实施例方式一、实验材料1、阳性样本取自感染仙台病毒小鼠(来自无锡市血防所动物实验室)的血液。2、实验试剂裂解液Trizol (购于美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒、TaqDNA 聚合酶及引物(购于美国Promega公司)，液氮、氯仿、异丙醇、75 %乙醇、DEPC处理水、 dNTPs、DL2000 Marker (均购自美国 Sigma 公司)。实验仪器离心机(CT15RT，上海天美电化仪器设备工程有限公司)、实时荧光定量PCR仪 (FQD-48A，杭州博日科技有限公司)、普通PCR仪(TC_96/G/H(b)A杭州博日科技有限公 司)、紫外分光光度仪(ND-1000，美国Thermo FisherScientific公司)、扫描仪(YLN-26、 北京市朝阳区京南机电综合服务部)、数码照相机(索尼WXl)、冰箱(MDF-382E(N)，三洋电 机国贸公司)。二、实验方法1、标准质粒的构建在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得 仙台病毒的保守基因，该保守基因序列的NC号为001552. 1，基因片段从5275 5619 ；利用 基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒分子，所用的质粒为PUC57(由金斯瑞公司 提供)，由金斯瑞公司提供合成。2、特异性引物及荧光探针的设计以步骤1中选取的高度保守序列为基准，按照 发明内容部分的设计原则设计一对包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)的特 异性引物及一条荧光探针其中，正向引物的序列(SEQ ID NO. 1)为
5，-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3，，反向引物的序列(SEQ ID NO. 2)为5’ -CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3’ ；荧光探针的序列(SEQ ID NO. 3)为5’ -GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3’ ；3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线(1)模板的制备将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下定量 标准质粒为2. 98 X IO9拷贝/ μ 1，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为 1.0Χ ΙΟ8、1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4 的稀释液，稀释液在-20°C条件下保存备 用；(2)实时荧光定量PCR反应体系25 μ 1 的 PCR 反应体系含有成分如下DEPC 水，15. 75 μ 1 ；10XPCR buffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循环反应根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(4)建立检测标准曲线荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始 模板数对数为X轴，Ct值为y轴的标准曲线(如图1所示)；对图1所示的检测标准曲线进行分析可见，模板的5个稀释点均在同一条直线上， 表明当基因拷贝数在LOXlO8-L OXlO4范围内时，检测域值与拷贝数之间均呈良好的线 性关系；回归分析显示，R2 = 0. 9935 ；可见本发明设计的引物及荧光探针的特异且工作性 能良好。4、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备(1)采用Trizol法提取感染病毒样本的RNA ；具体步骤为(a)、抽取感染仙台病毒小鼠的血液，在1.5ml的微量离心管中加入抽取的血液 500 μ 1，然后加入Trizol裂解液500 μ 1，充分混勻，室温放置IOmin ；(b)、向上述室温放置IOmin后的微量离心管中加入200 μ 1的氯仿，盖紧离心管 盖，用力震荡离心管，室温放置IOmin ；然后4°C，13000r/min离心15min ；(C)、吸取上述离心后的上层水相加入到另一个新的离心管中，加入等体积的异丙 醇，轻轻颠倒离心管充分混勻液体，室温放置IOmin后，4°C，13000r/min离心15min ；(d)、小心弃去上清液，再加入lml75%乙醇洗一遍，4°C，8000r/min离心IOmin ；(d)、弃去上清液，按每Iml Trizol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇，涡旋混 勻，4°C下10000r/min离心5分钟。(e)、小心弃去上清液，然后将分离下来的RNA置于超净台中干燥5min ；(注意干燥后的RNA溶于DEPC处理水中，即可进行反转录操作，若要保存备用，可在步骤(e)后直接加入乙醇并冻存于-70°C，可保存一年；若加入DEPC水后则只能 在-20°C保存1个月左右)。(2) cDNA 的制备米用 Invitrogen 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for FirstStrand cDNA Synthesis试剂盒做反转录，具体步骤为仏)、在0. 5ml微量离心管中，加入步骤(1)中提取的干燥后的RNA 1_5μ g，补充适 量的DEPC水使总体积达11 μ 1 ；向微量离心管中加入10 μ M Oligo (dT) 15 μ 1，轻轻混勻、离 心；(b)、将微量离心管70°C加热IOmin后立即插入冰浴中至少Imin ；然后加入下 列混合试剂，混合试剂的成分为10 X PCR buffer, 2 μ 1 ； 25mM MgCl2, 2 μ 1 ； IOmM each dNTPmix, 1 μ 1 ；0. IM DTT,2y 1 ；然后轻轻混勻，4 °C 下 12000r/min 离心 Imin ；然后转入 42°C水浴中下孵育2-5min ；(c)、加入反转录酶200U1 μ 1，在42°C水浴中继续孵育50min ；(d)、将微量离心管70°C加热15min，终止反应；(e)、将微量离心管插入冰中，加入RNase H 1 μ 1，在37°C下孵育20min，降解残留 的RNA，反转录的最终体系为35 μ 1，最后补足DEPC水165 μ 1，得最终cDNA为200 μ 1，置 于-20°C保存备用。5、有效性验证及结果检测判定(1)利用未感染仙台病毒小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系25μ 1的阴 性对照PCR反应体系为含有成分如下DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10XPCRbuffer, 2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；未感染仙台病毒小鼠的cDNA，1 μ 1 ；利用步骤4中制备的感染仙台病毒小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系 25 μ 1的阳性对照PCR反应体系为含有成分如下DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10XPCR buffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染仙台病毒小鼠的cDNA，1 μ 1 ；(2)循环反应按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20seC，55°C退火30seC，72°C延伸30seC，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(3)有效性验证荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点(如图1 所示)；阴性对照在本检测试验中无Ct值并且无扩增曲线，表明该反应体系中无仙台病毒； 图中的阳性对照点位于标准曲线上，并且其Ct值< 30，实验有效，可见，本发明的检测方法 能够准确有效地检测出仙台病毒。三、常规PCR检测(1)以DL2000 Marker作为参照，采用步骤1中构建的标准质粒作为模板，以未感 染仙台病毒小鼠的cDNA作为样本cDNA，进行PCR电泳检测，分为参照组、阴性对照组、阳性 表1 常规PCR电泳检测中的各组的反应体系成分其中，8.25μ 1 的混合液由 2. 5μ 1 的 10XPCR buffer，0. 5 μ 1 的 IOmM dNTPs, 0. 25 μ 1 的 1. 25U Tag DNA 聚合酶，2. 5 μ 1 的 300nM PrimerF 禾口 2. 5 μ 1 的 300nMPrimerR组成。(2)常规PCR反应反应循环程序及参数为(a)、95°C预变性5min，l个循环；(b)、 95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，35个循环后反应结束，得到反应产物；(3)将上述反应产物进行常规凝胶电泳检测(120V 40min)，检测结果如图2所示 (泳道M 参照组DL2000 Marker,泳道1 阴性对照组，泳道2 阳性对照组，泳道3 样品组 a,泳道4 样品组b，泳道5 样品组c，泳道6 样品组d，泳道7 样品组e)，由图可见，泳道 1并未出现条带，说明本实验方法的非特异性较好。本发明采用的实时荧光定量PCR技术巧妙地利用了 PCR技术的DNA高效扩增、荧光探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点，克服了常规PCR定性检 测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了实验时间，简化了实验操作。 而且荧光检测的结果由电脑分析读数，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更 为客观、灵敏、准确。同时，本发明中采用的阳性对照是根据仙台病毒的保守基因序列设计 构建的标准质粒分子，相对于以往采用灭活病毒液作为阳性品的检测，更增加了安全性，标 准质粒分子还可以大量进行复制，使得阳性标准品的来源更加稳定和可靠，避免了阳性病 毒株在每次试验中的使用。
权利要求
仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括有标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备、有效性验证及结果检测判定，其特征在于，所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中正向引物的序列为5’ CGCTGTGGGGGAACAAATTC 3’，反向引物的序列为5’ CAGCAGCTCGGAGTAATGTT 3’；所述荧光探针的序列为5’ GCGAATTGGGTTGTGAGACT 3’。
2.如权利要求1所述的仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所述实时 荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线的步骤为(1)将构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下定量标准质粒 为2. 98 X IO9拷贝/ μ 1，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1. OX 108、 1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4的稀释液，稀释液在_20°C条件下保存备用；(2)实时荧光定量PCR反应体系25 μ 1 的 PCR 反应体系含有成分如下DEPC 水，15. 75μ 1 ； 10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)，2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循环反应根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置 相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环；(b)、 95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；(4)建立检测标准曲线荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板 数对数为χ轴，Ct值为y轴的标准曲线。
3.如权利要求1所述的仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所述有效 性验证及结果检测判定的步骤为(1)利用未感染仙台病毒小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系25μ 1的阴性对照 PCR 反应体系为含有成分如下:DEPC 水，15. 75 μ 1 ； 10XPCRbuffer，2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ；300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；未感染仙台病毒小鼠的cDNA, 1 μ 1 ；利用感染仙台病毒小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系25μ 1的阳性对照PCR 反应体系为含有成分如下DEPC 水，15. 75μ 1 ;10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ； 300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染仙台病毒小鼠的cDNA, 1 μ 1 ；(2)循环反应按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置 相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环；(b)、 95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；(3)有效性验证荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照应 无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其Ct值应< 30，否则重做。
全文摘要
本发明涉及一种仙台病毒实时荧光定量PCR检测方法。该方法包括标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备以及有效性验证及结果检测判定步骤；其中特异性引物的正向引物的序列为5’-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3’，反向引物的序列为5’-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3’；所述荧光探针的序列为5’-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3’。本发明检测灵敏度高，检测时间短，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。
文档编号C12Q1/70GK101928784SQ20101011025
公开日2010年12月29日 申请日期2010年2月3日 优先权日2010年2月3日
发明者张红, 潘振华, 盛青松, 陈林凤 申请人:无锡奥瑞生物医药科技有限公司