专利名称：：荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及检测方法
技术领域：
：本发明提供一种对流行的曱型H1N1流感病毒的荧光定量PCR检测方法及检测引物和特异性探针。
背景技术：
：自09年4月以来，包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了人感染曱型H1N1流感病毒疫情，这是一种新的曱型流感病毒。随着感染曱型H1N1流感的人群不断的增加，疫情愈来愈严重，WHO已于6月11日将流感大流行警戒级别提升到6级，世界处在09年流感大流行的开端。曱型H1N1流感病毒属正黏液病毒科曱型流感病毒属的单月殳RNA病毒。根据其外部糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA步神经氨酸酶(nneuraminidase,NA)的不同抗原特性可将曱型流感病毒分为多个亚型。HA和NA具有高度变异性，但对于该流感病毒其它片段相比又极其保守。因此，HA、NA基因片段成为检测流感病毒的重要考察对象。面对这突如其来的流感病毒，如何快速准确的检测已成为世界各国疾病预防控制中心最关心的问题。实时焚光定量法显然已经成为各国公认的检测标准。实时萸光定量RT-PCR(rRT-PCR)法检测新型曱型H1N1的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan(^果针，对呼吸道样本或体外培养的曱流感病毒进行定量检测鉴定。WHO较早公布了用实时定量RT-PCR来检测曱流感的操作步骤。其中，InfA引物和探针组是通用于检测A型流感病毒，swInfA引物和探针组是特异检测所有曱流感A病毒，swHl引物和探针组是特异检测猪H1流感病毒。但是，当时NCBI公布的相关序列有限，WHO所公布的引物和探针对此次暴发的曱型H1N1流感病毒的检测特异性、灵敏度有限。本发明就是针对于目前设计并公布的引物及探针存在的灵敏度检测相对较低，检测费用较高进行改进。
发明内容本发明提供一种对曱型H1N1流感病毒的荧光定量PCR检测方法，本发明的方法包括利用一对新的引物和探针对病毒样本进行实时荧光定量监测。本发明的检测方法检测特异性好，灵敏度高，尤其适用于此次暴发的甲型H1N1流感，与禽流感、猪流感以及普通季节性流感无交叉反应。本发明还在于设计且提供一对新的引物和探针，由此降低检测成本，实现了快速准确;险测H1N1流感病毒。本发明提供一种获得检测曱型H1N1流感病毒的引物和探针的方法，该方法包括(1)篩选新型曱型H1N1流感HA全长序列，进行同源性比对，在其保守区只针对本次新型曱型流感设计引物；(2)才艮据PCR扩增区域内的核普酸序列设计特异性探针，并提交GENEBANK检测探针的特异性；(3)对待检测物进行实时定量分析。在本发明上述方法中，所筛选的新型曱型H1N1流感可以是NCBI公布的所有新型的甲型H1N1流感HA全长序列。另外，本发明的方法中，可以利用DNASTAR软件进行序列的同源性比对。比对结果见图1。图中阴影部分为HA基因序列高保守区。在本发明引物和探针设计中，首先在比对的序列保守区设计上下游引物，根据引物设计原理，在保守区617bp-760bp之间设计上游和下游引物。引物和探针在合成时探针5'端连接FAM荧光基团和3'端连接BHQ非荧光基团。引物的特异性增强。序列见表l。表l引物和探针序列引物NEWF(5，-3，)CAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAG引物NEWR(5'-3'):TCCCCGGCTCTACTAGTGTCCAGTA引物NEWProbe(5，-3，)GGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAA表2为利用BeaconDesigner7.5软件分析设计的引物和探针的参数。_表2引物和探针信息_SensePrimer_Anti-sensePrimer_ProbeSequenceSequenceCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGTCCCCGGCTCTACTAGTGTCCAGTAGGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAARating72.179.877.3Position617759658Length2525305TmGC%GCClamp3'EnddGSelfDimerdG(Internal)HairpindG(Internal)HairpinBond(Internal)SelfDimerBond(Internal)Run/RepeatLengthCross-DimerdG(Internal)58.45965.4404843.321-4.6-2.3-3.5-4.60-0.7-1.603446322-1.1本发明提供一种检测新型曱流感的实时荧光定量PCR方法，该方法包括以下步骤(1)核酸提取病毒RNA提取选用QIAampMinikit52卯6病毒RNA提取试剂盒。(2)RT-PCR扩增选用的扩增试剂盒为ABP^司TaqmanOne-StepRT-PCRMasterMixReagents。反应体系组分及其体积见表3。表3组々体积()无核酸酶水5.53样本RNA5.00上游引物(40^iM)0.50下游引物(40pM)0.50探针(10(iM)0.50Taqman2xUniversalPCRMasterMix12.5040xMultiScribeTM和Rnase抑制剂Mix0.63总体步25.00扩增条件采用本领域的标准扩增条件'6例如48°C30分钟95。CIO分钟95°C15s，60。C35sj40循环本发明所述的方法中，探针与荧光基团相连，所述荧光基团为FAM，BHQ，其它荧光基团也同样适用，比如，FAM-TAMARA等。所述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000,7300，7500,7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应4义(例如MX4000,MX3000,MX3005)。图1为利用DNASTAR软件分析HA全长基因同源性区域。图2和图3为YHANEW引物和WHO-SWH1引物灵敏度比较的检测结果。选用HA全长基因片段作为标准品。标准品各个浓度梯度扩增后荧光强度随反应循环数变化的曲线。其中，图2为SWH1引物扩增曲线，图3为YHANEW引物扩增曲线，图中横坐标为循环次数，纵坐标代表相应的校正后报告荧光强度(Rn)。图4表示用本发明建立的方法对普通季节性流感H1N1、猪流感H1N1、禽流感H5N1、H9N2进行非特异性检测的结果。其中，X轴表示循环次数，Y轴表示相应的校正后报告荧光强度。图5表示用本发明建立的方法对可疑发热病人的咽拭子进行检测。其中，X轴表示循环次数，Y轴表示相应的校正后报告荧光强度。具体实施例方式实施例l:引物灵^:度检测1)选择已知样本HA基因全长做为标准品，将其病毒RNA浓度从10"依次稀释到10—1();2)阴性对照无核酸酶水；3)反应体系按照表3进行配制。检测结果如图2、3所示。7图2中1一6曲线分别为标准品浓度稀释度为10-4—10-1()用引物WH0-SWH1扩增的曲线。图3中1一6曲线依次为标准品浓度稀释度为1(T4—10-1()用《I物YHANEW扩增的曲线。我们从图2和图3中可以看出，YHANEW引物扩增出结果的曲线出线早于WHO-SWH1引物扩增出结果的曲线。表4SWH1、YHANEW引物灵敏度检测结果CT值样本稀释度-^-SWH1YHANEWio-422.7519.00l(T525.2722.0210-629.2724.93IO-732.2129.1110-835.0032.42IO-937.8434.10io-10—一NTC———表4数据表示，本发明中YHANEW引物和探针与WHO公布的SWHl引物和探针分别扩增HA^因片段病毒RNA的不同浓度梯度下的扩增CT值。CT值反应了每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。我们从数据中可以看到，引物WHO-SWH1扩增10力CT值为37.84,而有效CT值为15^Ct(阈值)￡36，在此我们可以判断其CT值为"一"。从而，我们得出结论引物YHANEW相较于WHO-SWHl灵敏度要稍高些。实施例2:引物非特性检测1)对普通季节性流感H1N1,猪流感H1N1，禽流感H5N1、H9N2，进行非特异性检测；2)阳性对照病毒HA片段RNA;3)阴性对照无核酸酶水；4)反应体系按照表2进行配制。检测结果见图4及表5。图4结果显示，只有编号为1的阳性对照HA出现了扩增曲线。其余样8品曲线均在基线以下，无扩增反应。_表5人、禽、猪流感病毒检测结果55^CT值表5数据显示了该引物对普通季节性流感H1N1，猪流感H1N1，禽流感H5N1、H9N2基因扩增CT值为"一"。表明该引物对其病毒RNA无扩增反应。实施例3:对病人咽拭子检测1)对采集的可疑病例咽拭子进行检测，筛选新型曱型H1N1流感病毒；2)阳性对照病毒HA片段RNA;3)阴性对照无核酸酶水；4)反应体系按照表3进行配制。检测结果见图5及表6。图5中只出现了一条扩增曲线为阳性对照，其余样本均无扩增。反应结果为阴性。_表6咽拭子检测结果_^Si^表6中的数据结果显示，检测病人咽拭子结果均为阴性。H9N2猪H1N1人H1N1H5N110-6NTC知知知知知知性性33.0027.18124610-7NTC知知知知性性-、一义二、」、「一、_二、日月结果分析扩增反应完成40个循环之后，引物灵敏度检测到病毒RNA浓度稀释度为1(T8;与普通季节性流感H1N1，猪流感H1N1,禽流感H5N1、H9N2无交叉反应；从采集的病人咽拭子检测到6抹均为阴性。结果判断当待检测样本的15^Ct(阈值)$36时即判为阳性。权利要求1、一种甲型H1N1流感病毒的荧光定量PCR检测方法，该方法包括使用一对引物和探针对病毒样本进行实时定量监测，引物和探针序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="152"></tables>2.权利要求l所述的检测方法，其中，所述方法所检测的样本包括人血液、痰、鼻咽、口咽洗液或拭子；支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物。3权利要求l所述的检测方法，其中，所述探针连接的荧光基团为FAM國BHQ，FAM-TA區RA等。4.权利要求1所述的4企测方法，其中，该方法包括步骤1)待检测样本核酸的提取；2)RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25pLPCR反应体系。5.权利要求4中所述的检测方法，其中，所述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。6.一种检测新型甲型H1N1病毒试剂盒，其中包括引物或者其他能与新型曱型H1N1流感HA全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过10%，引物序列如下:_引物NEWF(5，-3，):_CAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAG_弓I物NE職(5，-3，)GGGGTCGGCTCTACTAGTGTCCAGTA7、一种检测新型甲型H1N1病毒试剂盒，其中包括引物及能与H1N1流感HA全长序列特异性探针，探针序列如下:_NEW探针(5'-3，)GGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAA能与新型甲型H1N1流感HA全长序列特异性结合并扩增的等同4冢针,其位点区域的覆盖率不能超过50%,其同源性不能超过70%。8、一种检测新型甲型H1N1病毒试剂盒，其中包括引物:<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>能与新型曱型H1N1流感HA全长序列特异性结合并扩增的等同引物,其位点区域的覆盖率不能超过50%,其同源性不能超过70%。全文摘要本发明公开了一种检测新型甲型流感病毒荧光定量PCR试剂盒，由引物和探针、Taqman2×UniversalPCRMasterMix、40×MultiScribe<sup>TM</sup>andRNaseInhibitorMix、无核酸酶水组成，该引物和探针检测特异性好，灵敏度高，尤其适用于此次暴发的甲型H1N1流感，与禽流感、猪流感以及普通季节性流感无交叉反应，而且成本也大大降低。文档编号C12Q1/70GK101665842SQ200910089668公开日2010年3月10日申请日期2009年7月28日优先权日2009年7月28日发明者姚李四,孙肖红,杨鹏飞,燕清丽,静王,胡孔新申请人:中国检验检疫科学研究院