专利名称：人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种检测试剂盒，具体涉及人类偏肺病毒的 荧光定量检测试剂盒。
背景技术：
荧光定量PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合i^涟式反应)技术不仅 实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、 有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。目前在 科学研究和临床诊断中广泛使用。其中Taqman荧光定量技术的原理为以 Taqman荧光探针为基础；Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧 光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬 灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5， -3，外切酶活性将探针酶切降解，使荧 光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每 扩增一条DM链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物 形成完全同步，从而实现定量。
Taqman荧光定量技术的绝对定量方法，是依据标准曲线直接测定未知样本 目标靶基因的量。标准曲线的制作为将hMPV F基因克隆后10倍稀释所进行的 循环数定为 CT 点Maril Martell， et al. J Clin Microbiol, 1999: 37 (2): 327-332。PCR a相同时，模板量越高，CT值越低，CT值与模 板量的对数值呈线性关系，依据CT值用已知浓度的DM或制作曲线进行检测.
5C代表Cycle, T代表threshold, CT值的含义是每个反应管内的荧光信号到 达设定的域值时所经历的循环数。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲 线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未 知样本的CT值，即可从标准曲线上获得该样本的起始拷贝数。
人类偏肺病毒(Human Metapneumovirus, hMPV)为荷兰学者于2001年首 次在儿童呼吸道感染标本中分离得到的一种新的呼吸道病原体。该病毒可导致 人的上下呼吸道感染，其临床特征类似于RSV (呼吸道合胞病毒)，主要症状包 括咳嗽、咽痛、呼吸困难、缺氧、喘息等。自人类偏肺病毒发现以来，亚洲、 北美洲、欧洲、南美洲、非洲、大洋洲均有其感染的流行病学报告，呈现全球 流行趋势.在中国重庆和北京也有关于hMPV感染的报道。血清学研究表明hMPV 已经在A^流行50年以上，大多数人在5岁时均已感染过hMPV。 4~10.8%的 呼吸道感染住院患儿同hMPV有关。hMPV还是引起老人和免疫缺陷患者严重呼吸 道感染疾病的常见病原体，并可同其他一些病原体合并感染，如RSV，SARS-CoV (严重急性呼吸综合征冠状病毒)。由此可见，hMPV是一种常见的呼吸道病原体， 建立准确的检测手段对于其早期诊断和治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，它能用于 感染人类偏肺病毒的检测，操作简便、快速准确，而且重复性好、通用性好、 经济实用。
本发明所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于包括分 別包装的标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量 反应液(d)、 PCR上游引物(e)、 PCR下游引物(f )和荧光探针(g)。
6所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其还包括分別包装的MA提 取试剂和逆转录试剂，用于待测样本的前期处理。
所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的标准阳性才莫板(a) 是含有插入人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸特异序列的pMD18-T载体质粒， 浓度为lxl(T拷贝/pl，容积为125pl至500 Ml，保存条件为 20。C;
插入的人类偏肺病毒F基因1620个核普酸，其序列为
atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaa 60 gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120
acaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgt 180
actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaa 240
ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaa 300
tcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagca 360 ggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgct 420
ctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccacc 480
gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcaat taacaagaac 540
aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600
ctaaatgttg tgcggcagtt Ucagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660
ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgccaacatc agcaggaeag 720
ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780
gggg^ctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 840 acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaa"atgct 900
tgcetectaa gagaagatca aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960
ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020
atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctacaac caactaccca 1080
tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140
ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gtaatcgggt tggaataatc 1200
aaaca狄tac ctaaaggctg ctcataeata actaaccagg aegcagacac tgtaacaatt 1260
gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320 ccagtttcaa gcagtttcga tceaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tg付gcgctt 1380
gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440
ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggc ttcattattg taataatttt gattgctgtt 1500 cttgggtt幼ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aagg肌aecc 1560 acaggggcac ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag 1620。
所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所迷的阴性参控品(b)是 从未感染人类偏肺病毒标准林的Vero-E6细胞抹(非洲绿猴肾细胞林)提取病毒RNA并逆转录获得的cDNAcDNA(complementary DNA)是指在体外经反:转录 合成的、与RNA (通常指mRNA)互补的单链DNA，容积为100 y 1至400 n 1 ，
保存条件为-2(TC。
所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的阳性参控品(c)是 人类偏肺病毒标准林感染Vero-E6细胞抹后，提取病毒RNA并逆转录获得的 cDNA,容积为lOOja 1至400 p 1，保存条件为-20。C。
所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的荧光定量反应液(d ) 是Premix Ex Taq"试剂(购自日本TaKaRa ^>司)，容积为625 |j 1至2500 n 1， 保存条件为-20匸。
所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的PCR上游引物(e) 是根据人类偏肺病毒F基因设计的；上游引物的浓度为10yM、容积为25nl 至100nl;保存条件为-20TC;
PCR上游引物序列为5，-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3，。
所述的人类偏肺病毒的焚光定量检测试剂盒，其所述的PCR下游引物(f) 是根据人类偏肺病毒F基因设计的；下游引物的浓度为10nM、容积为25pl 至100nl;保存条件为-20lC;
PCR下游引物序列为5，-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3'。
所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的荧光探针(g)是根 据人类偏肺病毒F基因设计的；
萸光探针序列为5，-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3，
荧光探针的5，端标记的荧光报告基因是FAM, 3，端标记的荧光受体基因为 Eclipse淬灭基团；荧光探针的容积为50 u 1至200 n 1;保存条件为-20".所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的RNA提取试剂(h) 是QIAa即Viral RM Mini KitRM提取试剂(购自德国QIAGEN公司)，保存条 件为室温；所述的逆转录试剂(i)是PrimeScript"RT Reagent Kit逆转录试 剂(购自日本TaKaRa公司)，保存条件为-20"C。
本发明具有以下优点定量准确，可以准确定量检测病毒核酸；灵敏度及 特异性高；检测速度快，仅需1小时，加上核酸的提取和逆转录，共仅需3-4 小时；步骤简单；可同时进行高通量的样本检测。本发明适用于人类偏肺病毒 的临床或实验室定量及定性检测，人类偏肺病毒感染的早期诊断，监视和预测 人类偏肺病毒流行性，以及对疗效进行监测和评估。
图1是CT值与拷贝数的对数的标准曲线示意图。
具体实施例方式
实施例一本发明所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，包括分別 包装的标准阳性才莫板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量反 应液(d)、 PCR上游引物(e)、 PCR下游引物(f )和荧光探针(g);
本例的标准阳性模板(a)是含有插入人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸 特异序列的pMD18-T栽体质粒，浓度为lxlO"拷贝/jil，容积为1"jlH;将人 类偏肺病毒F基因1620个碱基克隆到该载体中，转化大肠杆菌DH5a增殖后， 用碱列解法(具体实验奈件和方法见J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992, 分子克隆实验指南，第二版)提取质粒DNA,再用DNA纯化试剂盒(购自Clonetec 公司)纯化，然后，用分光光度计Am。定量并稀幹至lxlO"拷贝/p1,,条 件为-20'C; pMD18-T载体购自日本TaKaRa公司，由该公司经pUC18载体改建而成，是一种高效克隆PCR产物的专用栽体，具有同pUC18载体完全相同的功 能，且能大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
本例的阴性参控品(b)是从未感染人类偏肺病毒标准林的Vero-E6细胞抹 (非洲绿猴肾细胞林败取病毒RNA并逆转录获得的cDNA!cDNA (complementary DNA)是指在体外经反转录合成的、与RNA (通常指fliRM)互补的单链DM，容 积为100p 1,保存条件为-20'C。
本例的阳性参控品(c)是人类偏肺病毒标准抹感染Vero-E6细胞林后，提 取病毒RNA并逆转录获得的cDNA,容积为100Ml，保存条件为-20X:。
本例的荧光定量反应液(d)是Premix Ex Taq"试剂(购自日本TaKaRa公 司)，容积为625jul，保存条件为-20。C。
本例的PCR上游引物(e)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；上游引物的 浓度为10uM、容积为25pl;保存条件为-20X:;
PCR上游引物序列为5，-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3，。
本例的PCR下游引物(f )是根据人类偏肺病毒F基因设计的；下游引物的 浓度为10yM、容积为25ul;保存务fr为-20TC;
PCR下游引物序列为5，-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3，，
本例的荧光探针(g)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；
荧光探针序列为5'-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3，
荧光探针的5，端标记的荧光报告基因是FAM, 3，端标记的荧光受体基因为 Eclipse淬灭基团；荧光探针的容积为50 p 1;保存条件为-20"C。
实施例二本发明所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，包括分别
10包装的标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量反 应液(d)、 PCR上游引物(e)、 PCR下游引物(f)和荧光探针(g);还包括分
本例的标准阳性模板(a )是含有插入人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸 特异序列的pMD18-T载体质粒，浓度为1 x 10"拷贝/ja 1，容积为500jul;将人 类偏肺病毒F基因1620个碱基克隆到该栽体中，转化大肠杆菌DH5a增殖后， 用碱列解法提取质粒DNA，再用DNA纯化试剂盒(购自Clonetec公司)纯化， 然后，用分光光度计A26。定量并稀释至lxlO"拷贝/Ml，保存条件为-20'C。
本例的阴性参控品(b )是从未感染人类偏肺病毒标准林的Vero-E6细胞抹 (非洲绿猴肾细胞林)提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA,容积为400jLt 1，保 存条件为-2(TC。
本例的阳性参控品(c )是人类偏肺病毒标准林感染Vero-E6细胞林后，提 取病毒RNA并逆转录获得的cDNA，容积为400^1,保存条件为-20t:。
本例的荧光定量反应液(d)是Premix Ex Taq"试剂(购自日本TaKaRa公 司)，容积为2500ji1,保存条件为-20t:。
本例的PCR上游引物(e)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；上游引物的 浓度为10iiM、容积为100ul; *务降为-201C;
PCR上游引物序列为5，-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3，。
本例的PCR下游引物(f )是根据人类偏肺病毒F基因设计的；下游引物的 浓度为10pM、容积为至100pl; M务降为-20t:;
PCR下游引物序列为5，-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3，。
本例的荧光探针(g)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；荧光探针序列为5，-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3，
荧光探针的5，端标记的荧光报告基因是FAM， 3，端标记的荧光受体基因为 Eclipse淬灭基团；荧光探针的容积为200 y 1;保存条件为-2(TC。
本例的RNA提取试剂盒是QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(购自德国 QIAGEN公司)，保存条件为室温。
本例的逆转录试剂盒是PrimeScript"RT Reagent Kit试剂盒(购自日本 TaKaRa公司)，保存条件为-20t:。
实施例三本发明所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，包括分别 包装的标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、焚光定量反 应液(d)、 PCR上游引物(e)、 PCR下游引物(f )和荧光探针(g);还包括分 别包装的用于待测样本的前期处理的RNA提取试剂和逆转录试剂。
本例的标准阳性模板(a)是含有插入人类偏肺病毒F基因1620个核苦酸 特异序列的pMD18-T栽体质粒，浓度为lxlO'。拷贝/Ml，容积为250pl;将人 类偏肺病毒F基因1620个碱基克隆到该载体中，转化大肠杆菌DH5a增殖后， 用碱列解法提取质粒DNA，再用DM纯化试剂盒(购自Clonetec公司)纯化， 然后，用分光光度计AM。定量并稀释至lxlO"拷贝/y 1,保存条件为-20"。
本例的阴性参控品(b )是从未感染人类偏肺病毒标准林的Vero-E6细胞抹 (非洲绿猴肾细胞林)提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA,容积为200 n 1,保 存条件为-201C。
本例的阳性参控品(c)是人类偏肺病毒标准林感染Vero-B6细胞抹后，提 取病毒RNA并逆转录获得的cDM，容积为200Ml，保存条件为-2010。本例的荧光定量反应液(d)是Premix Ex TaqT""试剂(购自日本TaKaRa公 司)，容积为1250]ul，保存条件为-201C。
本例的PCR上游引物(e)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；上游引物的 浓度为10pM、容积为50pl;保存条件为-20匸；
PCR上游引物序列为5，-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3，。
本例的PCR下游引物(f )是根据人类偏肺病毒F基因设计的；下游引物的 浓度为10pM、容积为至50pl;保存条件为-20'C;
PCR下游引物序列为5，-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3，。
本例的荧光探针(g)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；
荧光探针序列为5，-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3，
荧光探针的5，端标记的荧光报告基因是FAM， 3，端标记的荧光受体基因为 Eclipse淬灭基团；荧光探针的容积为100p 1;保存条件为-20"C,
本例的RNA提取试剂盒是QIAamp Viral RM Mini Kit试剂盒(购自德国 QIAGEN公司)，保存条件为室温。
本例的逆转录试剂盒APrimeScript RT Reagent Kit试剂盒(购自日本 TaKaRa公司)，保存条件为-20'C。
实施例四应用人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒检测临床呼吸道标本 (也可用鼻咽分泌物标本、或痰标本)，使用该试剂盒进行检测包括以下步骤
第一步，使用RM提取试剂(h),提取待测样本的RNA，保存于-80"备用； 待测样本是人呼吸道标本；
第二步，将第一步获得的待测样本的RNA，使用逆转录试剂(i)逆转录为cDNA，于-20t:保存备用；
第三步，用蒸馏水溶解标准阳性模版(a ),并将其系列稀释为1 x 10'拷贝/ yl、 lxl()8拷贝/jul、 lxlO'拷贝/nl、 lxl()6拷贝/yl、 lxi()5拷贝/Ml、 1 xl(T拷贝/Ml、 lxl()3拷贝/iil、 lxl()2拷贝/pl、 lxl(^拷贝/pl，共9管 系列稀释品，于-2(TC保存备用；
第四步，PCR扩增，取荧光定量反应液(d) 12. 1、取PCR上游引物(e) 0. 5nl、取PCR下游引物(f) 0. 5jil、取荧光探针(g) ljil、取蒸馏水8.5 pl和模板2jil，共25ji 1组成多个PCR反应体系；
所述的模板为第二步获得的cDNA、第三步获得的系列稀释品、阴性参控品 (b)、或者为阳性##品(c);
PCR扩增时，各反应体系中，至少需要包含5个第三步获得的系列稀释品、 阴性参控品(b)、阳性参控品(c)和至少1个第二步获得的待测样本的cDM; 其中系列稀释品用于制作标准曲线，阴性参控品作为PCR反应的阴性对照，阳 性参控品作为PCR反应的阳性对照，以检测PCR反应系统是否正常；
第五步，使用荧光定量检测仪对第四步获得的反应体系进行PCR循环检测， 设置PCR的反应条件为先951C变性10秒;再95C、 10秒—60匸、30秒—95 。C、 10秒—60匸、30秒…设置40个循环；目的是检测循环的CT值(即每个 反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)；
第六步，通过比较待测样本和系列稀释标准阳性模板的标准曲线，对待测 样本的起始拷贝数进行定量(见附图1),该步骤由美国BIO-RAD公司的CFX-96 荧光定量PCR检测仪自动完成，定量结果由该检测仪自动计算得出；
第七步，在PCR反应系统正常的情况下，即PCR反应结束后荧光定量检测仪
14在阴性#品管中未检测到荧光信号，而在阳性参控品管中检测到> 500个拷贝 的人类偏肺病毒，通过对照标准曲线获得待测样本的人类偏肺病毒拷贝数，拷 贝数》500的判定为人类偏肺病毒感染，其余为阴性。
每个呼吸道样本设置3个重复，以保证实验的精确性和稳定性；
实施例五应用人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒检测体外感染实验的 细胞(也可用上清液标本)，使用该试剂盒进行检测包括以下步骤
第一步，使用RNA提取试剂(h),提取待测样本的RM，保存于-80'C备用； 待测样本是体外感染实验的细胞；
第二步，将第一步获得的待测样本的RNA，使用逆转录试剂(i)逆转录为 cDNA，于-20XM呆存备用；
第三步，用蒸镏水溶解标准阳性模版(a)，并将其系列稀释为lxlO'拷贝/ pl、 lxl()8拷贝/nl、 lxlO'拷贝/pl、 lxlO'拷贝/pl、 lxl()5拷贝/nl、 1 乂104拷贝/|111、 lxl()3拷贝/Ml、 lxl()2拷贝/pl、 lxlO'拷贝/ju1,共9管 系列稀释品，于-20'C保存备用；
第四步，PCR扩增，取荧光定量反应液(d) 12.5y 1、取PCR上游引物(e) 0.5m1、取PCR下游引物(f ) 0.5nl、取荧光探针(g) ljil、取蒸馏水8.5 pl和模板2pl，共25nl组成多个PCR反应体系；
所述的模板为第二步获得的cDNA、第三步获得的系列稀释品、阴性参控品 (b)、或者为阳性参控品(c);
PCR扩增时，各反应体系中，至少需要包含5个第三步获得的系列稀释品、 阴性参控品(b)、阳性参控品(c)和至少1个笫二步获得的待测样本的cDM;
15其中系列稀释品用于制作标准曲线，阴性参控品作为PCR反应妁阴性对照，阳 性参控品作为PCR反应的阳性对照，以检测PCR反应系统是否正常；
第五步，使用荧光定量检测仪对第四步获得的反应体系进行PCR循环检测， 设置PCR的反应条件为先95。C变性10秒；再95°C、 10秒—60t:、 30秒—95 。C、 10秒—6(TC、 30秒…设置40个循环；目的是检测循环的CT值(即每个 反应管内的焚光信号到达设定的域值时所经历的循环数)；
第六步，通过比较待测样本和系列稀释标准阳性模板的标准曲线，对待测 样本的起始拷贝数进行定量(见附图1)，该步骤由美国BIO-RAD公司的CFX-96 荧光定量PCR检测仪自动完成，定量结果由该检测仪自动计算得出；
第七步，在PCR反应系统正常的情况下，即PCR反应结束后荧光定量检测仪 在阴性参控品管中未检测到荧光信号，而在阳性参控品管中检测到> 500个拷贝 的人类偏肺病毒，通过对照标准曲线获得待测样本的人类偏肺病毒拷贝数，拷 贝数> 500的判定为人类偏肺病毒感染，其佘为阴性。序列表
SEQUENCE LISTING
<110>重庆医科大学附属儿童医院
<120>人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒
<160> 4
<210> 1
<211> 1620
<212> DNA <213>偏肺病毒属(〃"s/ /7e〃/77oi//>7ys genus.) <220>
<221> Human Metapneumovirus <400> 1
atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaa 60
gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120
acaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgt 180
actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaa 240
ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaa 300
tcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagca 360
ggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgct 420
ctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccacc 480
gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcaat taaeaagaae 540
aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600
ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660
ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgcca狄atc agcaggacag 720
ataaaactaa tgttagagaa cegtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780
ggggtctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 840
acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900
tgcctcctaa gagaagatea aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960
ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020
ateaatgttg ctgagcaate aagagaatgc aacatcaaca tatetacaae caactaccca 1080
tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140
ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gt幼tcgggt tggaat肌tc 1200
aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt 1260
gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320
ccagtttcaa gcagtttcga tccaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt 1380
gatcaagtct付gaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440
ctgaacagtg cagaaaaagg aaaeactggc付cattattg taataatttt ga付gctg付 1500
cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaaaccc 1560
acaggggc狄ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag 1620
<210> 2 <211> 23 <212> DNA<213>人工序列 <220>
<221>PCR上游引物 <400> 2
cctttctaac atgcccacat etc 23
<210> 3 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<221>PCR下游引物 <400> 3
gctcccgtag acccctatca g 21
<210> 4 <211>24 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<221>荧光探针 <400> 4
ccctttcttc gcaccatccc acgg 2权利要求
1、人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于包括分别包装的标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量反应液(d)、PCR上游引物(e)、PCR下游引物(f)和荧光探针(g)。
2、 根据权利要求l所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于还包括分别包装的RNA提取试剂和逆转录试剂。
3、 根据权利要求1或2所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述的标准阳性模板(a )是含有插入人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸特异序列的pMD18-T载体质粒，浓度为lxio"拷贝/pi，容积为125pl至500 nl，保存条件为-20。C;插入的人类偏肺病毒F基因1620个核苦酸，其序列为atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaa 60gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120acaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgt 180actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaa 240ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaa 300tcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagca 360ggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtget 420ctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccacc 480gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaa狄ctga ctagtgcaat taacaagaac 540aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataea tgccaacatc agcaggacag 720ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780ggggtctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagc绍c cgatctttgg tgtcatagat 840acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900tgcctcctaa gagaagatca aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctacaac caactaccca 1080tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gtaatcgggt tggaataatc 1200aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt 1260gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320ccagtttcaa gcagtttcga tccaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt 1380gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggc ttcattattg taataatttt gattgctgtt 1500cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaaaccc 1560acaggggcac etccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag 1620。
4、 根据权利要求1或2所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述的阴性参控品(b)是从未感染人类偏肺病毒标准抹的Vero-E6细胞株提取病毒rna并逆转录获得的cDM容积为100 m 1至400 y 1，保存条件为-20'C。
5、 根据权利要求1或2所述的人类偏肺病毒的焚光定量检测试剂盒，其特征在于所述的阳性参控品(c )是人类偏肺病毒标准抹感染Vero-E6细胞林后，提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA，容积为100p 1至400m 1，保存条件为-20x:。
6、 根据权利要求1或2所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于:所述的荧光定量反应液(d)是Premix Ex TaqT'试剂，容积为625 m 1至2500jj1,保存条件为-20'c。
7、 根据权利要求1或2所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述的PCR上游引物(e)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；上游引物的浓度为10jiM、容积为25nl至100ul;保存条件为-20匸；PCR上游引物序列为5，-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3'。
8、 根据权利要求1或2所述的人类偏肺病毒的焚光定量检测试剂盒，其特征在于所述的PCR下游引物(f)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；下游引物的浓度为10nM、容积为25pl至100jil; M务降为-20";PCR下游引物序列为5，-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3，。-
9、 根据权利要求1或2所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于..所述的荧光探针(g)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；焚光探针序列为5，-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3，；荧光探针的5，端标记的荧光报告基因是FAM, 3，端标记的荧光受体基因为Eclipse淬灭基团；荧光探针的容积为50 y 1至200 y 1;保存条件为-20'C。
10、 根据权利要求2所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述的RNA提取试剂(h)是QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取试剂，保存条件为室温；所述的逆转录试剂(i)是PrimeScript"^RT Reagent Kit逆转录试剂，保存条件为-20°C。
全文摘要
本发明涉及人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于包括分别包装的标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量反应液(d)、PCR上游引物(e)、PCR下游引物(f)和荧光探针(g)；还包括分别包装的RNA提取试剂和逆转录试剂。本发明具有以下优点定量准确，可以准确定量检测病毒核酸；灵敏度及特异性高；检测速度快，仅需1小时，加上核酸的提取和逆转录，共仅需3-4小时；步骤简单；可同时进行高通量的样本检测。适用于人类偏肺病毒的临床或实验室定量及定性检测，人类偏肺病毒感染的早期诊断，监视和预测人类偏肺病毒流行性，以及对疗效进行监测和评估。
文档编号C12Q1/68GK101538618SQ200910103609
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月15日 优先权日2009年4月15日
发明者杜丽娜, 耀 赵, 赵晓东, 昕 陈 申请人:重庆医科大学附属儿童医院