食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达方法

专利名称：食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及在毕赤酵母中表达和生产吸血蝙蝠唾液纤溶 酶原激活剂重组蛋白的方法。
背景技术：
血栓性疾病，特别是心脑血管血栓类疾病是严重危害人类健康的疾病之一，当前 世界卫生组织(WHO)提供的数据，突出表明心血管疾病(CVD)是全世界引起死亡率最高的 病因，每年大约有一千七百万人死于CVD。估计由此致残的人，包括心肌梗死和中风造成的 残疾也是CVD居首。国内外CVD发病和死亡率的持续上升和用于治疗的选择严重匮乏，使 得有关血栓病药物的研究成为热门。无论在发达国家还是在发展中国家，溶栓药物对于血 栓病的治疗是一个行之有效的方法，寻求安全、高效的溶栓药物和溶栓方案一直是国内外 该领域研究的热门。纤溶酶原激活剂(PA)如链激酶(str印tokinase)，尿激酶(urokinase)，尿激酶原 (prourokinase)，组织型纤溶酶原激活剂(t_PA)或尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)等可将 纤溶酶原(plasminogen)转化为纤溶酶(plasmin)，纤溶酶随后降解纤维蛋白为可溶性的 产物，因此纤溶酶原激活剂已广泛用于溶栓并再通血管，如用于急性心肌梗塞(AMI)的临 床治疗或观察，来挽救病人的生命。纵观溶栓药物的研究发展过程，已经历了三代。第一代溶栓药以尿激酶 (Urokinase, UK)和链激酶(Str印tokinase，SK)为代表，它们是纤溶酶原激活剂，能将纤溶 酶原转化成具有活性的纤溶酶，后者催化水解血栓中的主要成分血纤蛋白，进而溶解血栓。 但第一代溶栓药不是血纤蛋白特异的，对血栓选择性差，同时如链激酶还具有很强的抗原 性。第二代溶栓药有组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (Scu-PA)，它们是血纤蛋白特异性的，激活纤溶酶原的催化活性需要血纤蛋白作辅助因子 参与，不易引发循环血中纤溶酶原和血纤蛋白原的耗竭，避免发生系统性溶栓状态。但还是 存在治疗剂量大，血浆半衰期短，疗效和血纤蛋白特异性有限，仍易发生再栓塞和并发性出 血等缺点。第三代溶栓药物主要是利用分子生物工程技术，特别是蛋白质工程技术对先前药 物的改造，如t-PA和scu-PA的突变体，嵌合体，纤溶酶原激活剂与抗血纤蛋白、血小板或血 栓调节蛋白单克隆抗体的缀合物。当然，已有从生物体中新发现的纤溶蛋白酶原激活剂如 蝙蝠纤溶酶原激活剂(Bat-PA)、蛇毒纤溶酶原激活剂、葡激酶等。这一代药物向着更安全、 更高效的方向发展，目前正在积极研发中。但在副作用方面新一代药物较之第二代药物，大 规模临床试验中，其主要指标如并发性出血、凝前效应等差异并不显著，仍不能满足临床的 需要。因此，更为安全有效的新型溶栓药物的研制是一项紧迫而艰巨的任务。1989 年，Stephen J. Gardell 从南美洲吸血蝙蝠 Desmodus rotundus 的唾液中分 离得到一种t-PA类似物，称为蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Desmodus rotundus salivary
3plasminogenactivator, DSPA)，也名为 Bat-PA。包含 4 种纤溶酶原激活剂，即 dsPA α 1、 dsPA α 2、dsPA β 和 dsPA γ。dsPA α 1 和 dsPA α 2 的结构为 FEKP，dsPA β 含 EKP，dsPA γ 为 ΚΡ，其中dsPAa 1溶栓性能最为优越，研究也最多，具有高度的纤维蛋白结合特性，因而人 们推断出Finger区和EGF区对dsPA α 1的功能至关重要。所有的DSPA都只有单链形式， 具有酰胺水解活性，严格要求血纤蛋白作为辅助因子来激活纤溶酶原，否则不能激活活性。 DSPAa 1是由477个氨基酸组成的高分子蛋白，与t_PA分子有85%的同源性，区别在于它 不具有t-PA分子的K2区和纤溶酶切割位点。同t-PA相比，DSPA a 1的血纤蛋白依赖性和选择特异性更高，当血纤蛋白存在时， DSPA a 1的催化速率将提高IO5倍，而t_PA仅提高550倍。动物实验证明，重组的Bat-PA 的溶栓速度比重组的t-PA更快，对血栓中血纤蛋白选择性更强，持续的时间更长。同时，在 给药后，t-PA致使血纤蛋白原、纤溶酶原、a 2-抗纤溶酶下降的比例都明显大于Bat-PA，还 发现t-PA用药后有高分子质量的血纤蛋白原降解产物片段的积累，而Bat-PA不积累。关 于纤溶酶原和因子VIII的变化，也表明t-PA导致其下降，而Bat-PA不明显。这些实验特 征都显示Bat-PA极有可能开发成为一种溶栓速度快、血栓选择性高、出血副作用小的新型 纤溶酶原激活剂类溶栓药物。目前，四种形式的DSPA纤溶酶原激活剂已在哺乳动物细胞中得到表达，其中 DSPAa 1因其活性最高受到很多学者的关注，针对它的研究最多，DSPAa 1先后已在CHO细 胞、昆虫细胞、烟草中表达，表达量在10 60mg/L，但其代价昂贵，表达量也偏低。目前关于 这类药物的研发已经进入临床试验阶段。大肠杆菌表达系统是目前应用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，它最突 出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生 物的基因表达调控机制和蛋白加工修饰能力，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过 程，其产物往往形成没有活性的包涵体，需要经过变性，复性等处理才能应用。与大肠杆菌 相比，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是酵母是低等真核生物，除了具 有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物表达时对蛋 白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克 服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重 视和利用。第一代酵母表达系统是酿酒酵母(Saccharomyces. Cerevisiae)，作为单细胞真 核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵 母在分子遗传学方面被人们认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿 酒酵母表达了第一个外源基因——干扰素基因。随后又有一系列的外源基因在该系统中得 到表达。80年代末，酵母表达系统便成功商业化，用于表达异源蛋白。巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)是一种单细胞真核生物，1980年，Couderc 等从PichiaPastoris中分离纯化得到乙醇氧化酶(AOX)，这为将Pichia Pastoris开发成 为新一代表达系统打下了基础，随着对酵母中与过氧化物酶体相关的机制进一步的阐明和 深入认识，1983年美国Wegner等人最先发展出以Pichia Pastoris,又称甲基营养型酵母 (methy-phicyeast)为代表的第二代酵母表达系统。毕赤酵母系统克服了酿酒酵母的局限， 除了具有一般酵母所具有的特点外，具有以下几个优点(1)具有醇氧化酶AOXl基因启动子，这是目前最强，调控机制最严格的启动子之一。严格调控外源基因的表达，使外源基因只在甲醇培养基中有效表达；(2)表达质粒能在基因组特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合，由于外源 基因以同源重组整合到酵母细胞染色体上，所以遗传稳定；(3)毕赤酵母自分泌蛋白很少，外源蛋白是培养液中的优势蛋白；(4)菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。表达水平是细菌、昆虫或 哺乳动物的10 100倍。如表皮生长因子(Epidemal Growth Factor, EGF)在酿酒酵 母(Saccharomyces. Cerevisiae)中的产量为7. 4mg/L，而在巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)中为 450mg/L，提高 60 倍；(5)表达方式灵活，既可胞内表达，也可胞外表达，能将目的蛋白分泌到胞外并进 行翻译后加工；(6)毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存于其中，可免受蛋白酶的降 解，而且减少对细胞的毒害作用；(7)糖基化程度低。与酿酒酵母相比，毕赤酵母加到蛋白上的糖链长度平均每条侧 链为8 14个甘露糖残基，比酿酒酵母每条侧链50 150个甘露糖残基短得多。

发明内容
鉴于现有技术存在的缺陷CH0细胞、昆虫细胞、烟草中表达代价昂贵，表达量也 偏低，大肠杆菌表达系统不利于真核细胞蛋白的表达等。本发明的目的是提供一种食血蝙 蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达方法，该方法使食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂 特别是DSPA α 1在毕赤酵母中稳定高效表达，从而降低生产成本，提高表达量，并使产生的 重组蛋白具有天然蛋白的生物活性。本发明目的通过下列步骤实现在体外人工合成吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Bat-PA)的全长基因，再将其克 隆到表达载体PPIC9K上，对重组质粒进行线性化处理后，通过电穿孔的方法将线性化的重 组质粒转化进入酵母细胞，进而稳定整合到酵母染色体上，重组酵母在发酵培养过程中经 过诱导，吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在信号肽的引导下分泌表达到培养基中。本发明方法还包括重组酵母细胞的筛选方法，包括以下步骤挑取单克隆G418筛 选高拷贝菌株，小量表达挑选高表达菌株；P. Pastoris工程菌中目的蛋白的表达条件优化 及大量表达；通过Ni柱亲和层析的方法对表达产物进行纯化；纤溶平板法测定表达产物活 性。因金属镍离子与连续六个组氨酸的肽序列具有特异性亲和作用，采用在吸血蝙蝠 唾液纤溶酶原激活剂的编码基因5’加上一个六组氨酸编码的序列，使产生的蛋白的N端带 上六组氨酸的标签，以方便蛋白的纯化。对本发明所使用的方法中至关重要的是质粒载体的构建，它对获得基因工程重组 菌以及重组蛋白的正确表达有着重要的作用。


图1为食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达方法示意2为SDS-PAGE筛选高表达DSPA α 1重组菌株
5
图3为SDS-PAGE分析镍柱亲和层析5’ His-DSPA α 1图4为纤溶平板法测定DSPA α 1的活性本发明具有以下优点首次将吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂转入毕赤酵母，使其在毕赤酵母中稳定高效 表达，其表达量约30mg/L，相对于在CHO细胞、昆虫细胞、烟草中的表达量10 60mg/L，其 产量绝对值并不见优势，但是和这些表达宿主比起来，毕赤酵母可以高密度发酵，其培养条 件要求没有CHO细胞、昆虫细胞，烟草等苛刻，而且其操作也相对简单，可降低生产成本低， 提高表达量，产生的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂重组蛋白具有天然蛋白的高生物活性， 其纤溶活性为2. 56X 105IU/mg。能够激活纤溶酶原，将其转化为纤溶蛋白酶并迅速溶解纤 维蛋白。将DSPA α 1在毕赤酵母中表达，成功通过Ni柱亲和层析的方法对DSPA α 1进行纯 化。纯化后的蛋白可用于治疗各种血栓性心脑血管疾病。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步详细描述。实施例1 :DSPA α 1基因的人工合成从Gene bank中查得DSPAa 1，除去其本身的信号肽序列，并为方便下一步克隆到 PPIC9K质粒中，在5'端设计有Xho I酶切位点，在3'端设计有EcoR I酶切位点，一共约 1340bp,由上海生工体外人工合成全长，并克隆到PUC57载体中，转化至大肠杆菌TOPlO中
稳定保存。Gene fragment 5，CGCTCGAGAAAAGA 编码 GCXho IATATGGTGTG GCCTGCAGAG ACGAAAAAAC CCAGATGATA TACCAGCAAC AAGAGTCGTG GCTGCGCCCCGAGGTCAGAA GCAAGCGGGT AGAACACTGC CGGTGCGATA GAGGATTGGC CCAGTGTCAC ACCGTGCCTGTCAAAAGTTG CAGTGAACTG AGGTGCTTCA ATGGGGGGAC ATGCTGGCAG GCTGCATCTT TCTCAGACTTTGTCTGTCAG TGCCCTAAAG GATATACGGG GAAACAGTGT GAAGTAGATA CCCATGCCAC CTGCTACAAGGACCAGGGTG TCACCTACAG GGGCACATGG AGCACATCGG AAAGTGGGGC TCAGTGTATC AACTGGAACAGCAACCTTCT GACCCGGAGG ACCTACAATG GGCGGAGGTC AGATGCCATC ACACTGGGCC TTGGGAATCACAATTACTGC AGAAACCCAG ATAACAACTC AAAACCTTGG TGCTATGTCA TCAAGGCAAG CAAGTTCATCTTGGAGTTCT GTAGCGTGCC TGTCTGCTCC AAGGCCACCT GTGGCCTGAG AAAGTACAAG GAGCCACAGCTTCACAGTAC AGGAGGACTC TTCACAGACA TCACCTCTCA TCCATGGCAG GCTGCCATCT
6TTGCCCAGAACAGAAGGTCA CCTGACTGCTGCCCACTGCT TACCGGGTGAAACCTGGAAA ATGACGACACTTACAACAAT GAGTGACAGTGTCCGCGCCA CTGTCTGGCTACGGCAAGCA GGCTGTACCCCTCCAGCCGC TGCTGGAGACACGCGGAGCG CCCTTGGTGTGTAGGAATGA AGAAAGACATTCCAGGTGTA TACACCAAGG TTACTAATTA CCTAGGCTGG ATTCGAGACA ACATGCGCCCATAAGAATTCCG 3，EcoR I实施例2 载体的构建(1)目的基因DSPA α 1的扩增用上游引物5'-CCGCTCAGAAAAAGAGCATATGGTGTGGCCTGC-3'Xho I下游引物5‘ -GCGCGCGGAATTCTTATGGGCGCATGTTGTCTCG-3 ‘EcoR I以质粒pUC57/DSPA α 1为模板，PCR扩增出目的基因DSPA α 1(2)5，His DSPAa 1 基因的扩增Up primer (5‘端引物)ccGCTCGAGAaaaga |catcatcatcatcatcat]gacgacgacgacaag
GCATATGGTGTGGCCTGCXhoI His Tag EK 酶切位点Down primer (3，端引物):GCGCGCGGAATTCTTATGGGCGCATGTTGTCTCGEcoR I以质粒 pUC57/DSPA α 1 为模板，PCR 扩增 5，His DSPA α 1 基因。(3)将目的基因DSPA α 1，5，His-DSPA α 1克隆到表达载体pPIC9K1)将PCR扩增目的基因DSPAa 1, 5'His-DSPA a 1分别同时用Xho I,EcoR I双酶
TCAGGAGAAA TCCAGGAGAG GGAAGAGCAG GACATTGCAC TCTGTCTCCC TAAGTCATCT TGCACATCCA GAGAGATCCA CAACCACATG
GGTTCTTGTGTGGGGGGATA
GTATCCTCCCCAGCATCTTA
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GCTGAAGGAAGGGCATGTCA
GTCACAAAGAACATGCTGTG
GCCAGGGTGACTCAGGAGGC
TTGGGGTGTTGGCTGTGGGG
7切，完全酶切四小时，经琼脂糖电泳分离纯化，胶回收备用；2)由于pPIC9K载体中存在两个Xho I酶切位点，因此需要进行部分酶切。先用 EcoRI完全酶切pPIC9K载体约3h，再加入XhoI部分酶切载体，时间控制在25min。琼脂糖 电泳分离纯化，胶回收大片段(约9. 3kb)；3)将酶切后的目的基因片段和pPIC9K载体片段用T4DNA连接酶16 °C连接 过夜，转化至大肠杆菌感受态细胞TOPlO中。经菌落PCR鉴定出的DSPAa l/pPIC9K、 5’ His-DSPAa l/pPIC9K大肠杆菌表达菌株，送至上海生工测序，作进一步确认。实施例3 =DSPA a 1，5，His-DSPA a 1毕赤酵母表达菌株的构建(I)DSPAa l/pPIC9K、5，His-DSPAa l/pPIC9K 的线性化首先用碱裂解法从大肠杆菌TOPlO中分别大量提取DSPA a l/pPIC9K、 5'His-DSPA a l/pPIC9K，然后用过量的限制性内切酶Sal I分别酶切上述质粒DNA，使之完 全线性化，琼脂糖凝胶电泳后，采用胶回收试剂盒(TIANGEN)回收酶切产物，-20°C冰箱中 保存备用。(2)酵母细胞的转化取_20°C冰箱保存的毕赤酵母GS115(购自美国Invitrogen公司)100 μ L，接种于 3mLYPD培养基中30°C摇菌过夜，取活化的菌液2. 5mL接入250mLYPD液体培养基30°C摇菌 过夜，至0D600 = 1. 3-1. 5，收集菌体制备感受态细胞；4°C 1500g离心5min,重悬于250mL 冰预冷的无菌水中；4°C 1500g离心5min，重悬于125mL冰预冷的无菌水中；4°C 1500g离 心5min，重悬于5mL冰预冷的山梨醇中；4°C 1500g离心5min，重悬于0. 5ml冰预冷的山梨 醇中；从中取出80 μ L酵母感受态细胞，分别与上述制备的线性化质粒载体DNA(5-20 μ g) 充分混合，然后转移至冰浴后的0. 2cm无菌电击杯中，利用电击仪MicropulserTM (Biorad 公司产品)将线性化的质粒DNA导入酵母感受态细胞，电击参数为1. 5kV，25 μ F，200Q。电 击完成后，立即向电击杯中加入ImL冰冷山梨醇溶液稀释电转菌液，置于1. 5mlEP管中，然 后将菌悬液涂布于RDB平板上(lmol/L山梨醇，2%葡萄糖，1. 34% Yeast Nitrogen Base, 4X10_5%生物素，0. 005%氨基酸(L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-异亮氨酸))，每 200 μ L涂布一块平板，将平板置于30°C培养，直至单个菌落出现。RDB平板上的菌落长到肉眼可见时，将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准 备好，并分装，引物使用invitrogen公司毕赤酵母表达Kit中5' AOXl primer和3' AOXl primer。用半根灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下，放入一个灭菌的1.5mL离心管， 对应PCR管和1. 5mL离心管编号。PCR扩增条件94°C热启动4min ；94°C变性lmin，55°C退 火lmin，72°C延伸2min，35循环；72°C，最终延伸IOmin ；4°C保温。agarose电泳，对于 PCR扩增显现特异性条带的克隆，把对应于1. 5mL离心管中的半截牙签置于5mLYPD培养基 中，30°C培养，8-12h后20%甘油保种。实施例4 :G418筛选多拷贝及小量表达筛选高表达菌株利用含G418抗性基因的载体(pPIC9K)转化巴斯德毕赤酵母，通过转化子对G418 的抗性水平快速筛选出高拷贝转化子。首先，准备6块(3套)96孔板，筛选约180个在组 氨酸缺陷性RDB板上生长起来的His+阳性重组子。为了使各克隆处于一个细胞密度大致 相同的状态，采用了 96孔版连续培养的方法，最终确保相等的细胞数点到G418平板上。所 有待G418筛选的菌株，都预先通过菌落PCR鉴定其菌种背景。通过G418的筛选，从180个单克隆中，获得约1 10个抗高浓度G418的克隆，具体操作如下用灭菌的枪头，在每个微 孔中加入200 μ L YPD ；用灭菌枪头在第一套96孔板的每个微孔中接种单个His+转化子并 搅动以悬浮细胞；盖上96孔板，30°C培养48小时；48小时后，取一套新的96孔板并在每个 微孔中加入190 μ L YPD，再向每孔中加入10 μ L第一套96孔板中培养的细胞液，确保各孔 号对应，盖上盖，30°C培养24小时；之后，将第二套板中的细胞液转接如第三套板，操作同 前一天。第三套板培养过夜后，各克隆达到相同的细胞密度。取等密度的细胞液IOyL点 样在含有G418的YPD平板上，YPD平板上G418的含量分别为0,0. 25,0. 50,0. 75,1.0,1.5, 2. 0,3. 0,4. Omg/mL ；平板于30°C培养至菌液渗入培养基，再倒置培养2_5天后检查记录筛 选结果，挑取抗高浓度G418的克隆。利用小量表达筛选高表达DSPA α 1毕赤酵母菌株，具体操作如下用灭菌的枪头， 在每个微孔中加入200 μ L YPD ；用灭菌枪头在第一套96孔板的每个微孔中接种单个His+ 转化子并搅动以悬浮细胞；盖上96孔板，30°C培养48h ；48h后，取一套新的96孔板并在每 个微孔中加入190 μ L YPD，再向每孔中加入10 μ L第一套96孔板中培养的细胞液，确保各 孔号对应，盖上盖，30°C培养24h ；之后，将第二套板中的细胞液转接如第三套板，操作同前 一天。第三套板培养过夜后，各克隆达到相同的细胞密度。取等密度的细胞液30 μ L接种 于3mlBMGY培养基，30°C，250rpm培养至OD6tltl = 3 6 (大约24h)。弃上清并将细胞沉淀悬 浮于3mlBMMY培养基中诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度为1%，诱导72h后取样分析。用核酸蛋白分析仪，采用Bradford(CBB)法对蛋白质进行定量。以梯度稀释的BSA 蛋白作标准曲线，0μ g/mL、25g/mL、50y g/mL、75y g/mL、100y g/mL、125y g/mL。100 μ L 样 品中加入900 μ L考马斯亮蓝蛋白染液(IOOmg Comassia G250完全溶解于50mL95%乙醇， 加入100mL85%的浓磷酸后，补水至1L)，静置15分钟后测定595nm处的吸光度。用三氯乙酸(TCA)沉淀法制备蛋白质样品。450 μ L蛋白表达上清加50 μ L 0. 2% 的脱氧胆酸(DOC)溶液，混勻，冰上放置30min，加入50 μ L 10 %的TCA溶液，4 °C放置 IOmin, 12000rpm 离心 lOmin，将沉淀溶于 400 μ L 冰冷的丙酮，-20°C放置 15min，12000rpm 离心lOmin，将沉淀溶于15μ LDDW，即为电泳蛋白质样品。SDS-PAGE 取上述蛋白质样品 15μ L，加入 5μ L4XLoading Buffer (1 Ommol/L Tris-HCl (pH6. 8), 4% (w/v) SDS,0. 2% (w/v)溴酚兰，20% (v/v)甘油，200mmol/L β -巯基 乙醇)，95°C煮样5min，离心，取蛋白样品上清进行电泳分析。SDS-PAGE分离胶选用浓度为 12%，堆积胶浓度为5%。堆积胶部分用80V电压，分离胶部分选用120V电压，使溴酚兰指 示带走出凝胶。电泳时以中分子量蛋白质标准样品作为参照。经SDS-PAGE后发现DSPA α 1 分子量约为47kD推测的分子量相符。利用灰度扫描折算出DSPA α 1表达量在30mg/L左 右。虽然该表达量相对其他表达系统优势不明显，但是毕赤酵母表达系统可以高密度发酵， 因此在生产时还是有利于产量的提高和成本的降低。实施例5 :P. pastoris工程菌中目的蛋白的大量表达外源蛋白在毕赤酵母中的表达分为两步，即菌体生长和蛋白诱导表达。先利用 以甘油为碳源的培养基培养菌体，达到一定的OD值后，弃去上清液，菌体悬浮于以甲醇为 碳源的培养基中诱导表达，每隔24小时补加一次甲醇，以弥补甲醇的损失。将筛选出的 高表达菌株接种于3mlYPD培养基，30°C，250rpm培养14 16h，取活化菌液4ml接种于 400mlBMGY培养基，30°C，250rpm培养24h，静置12h，弃上清，将细胞沉淀悬浮于IOOmlBMMY培养基中诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度为1 %，诱导72h。4°C，IOOOOrpm, 15min离心，
收集上清，待用。实施例6 镍柱纯化重组His-Bat-PA构建表达的重组His-Bat-PA在5’或3’末端设计有His-Tag，因此可以利用镍柱 进行纯化。主要是利用金属镍离子与连续六个组氨酸的肽序列的特异性亲和作用，一步纯 化的方式分离纯化得到目的蛋白。镍柱亲和层析及SDS-PAGE (图2)实施例7 纤溶平板法测定DSPA α 1的活性分泌型表达产物发酵液的体积很大，但浓度较低，因此必须在纯化前进行浓缩，将 表达上清用65%硫酸铵沉淀浓缩5小时以上(冰浴)，IOOOOrpm离心30min取沉淀，4°C，将 沉淀透析过夜(中途更换数次透析液)，透析液为Buffer A(0. 06mol/L Na2HPO4,0. 09mol/ LNaCl，ρΗ7· 4)。改进的纤维蛋白平板法测定Bat-PA纤溶活性塑料培养皿(φ=90 mm)放置于 水平桌面上。60mg琼脂糖加IOmL纤溶平板缓冲液(0. 06mol/L Na2HPO4,0. 09mol/LNaCl, pH7. 4)，微波炉熔融后，置于45°C水浴中恒温，另取60mg牛纤维蛋白原加IOmL纤溶平板缓 冲液，45°C水浴中恒温溶解。先向琼脂糖溶液中加入0. 5mL凝血酶(100U/mL)混勻，再与纤 维蛋白原溶液迅速混勻，立即倒入上述灭菌的塑料培养皿中，将气泡赶至边缘，室温放置冷 却凝固后，4°C保存。标准品UK用纤溶平板缓冲液稀释至100U/μ L，这种平板是富含纤溶蛋 白_原的平Ife (plasminogen-rich plate)。以毕赤酵母甲醇诱导的培养物作为阴性对照，取DSPA α 1透析后的样品50 μ L滴 加在纤溶平板的点样孔中，恒温观察24h乳白色平板透明圈情况，发现其培养上清确实能 够在纤溶片板上形成透明圈，即DSPAa 1能够激活纤溶酶原，将其转变为纤溶酶并进而使 纤维蛋白降解。以UK为标准品测得DSPA α 1的纤溶活性为2. 56X 105IU/mg，相对其他一些 文献报道的相关蛋白，本发明所产生的DSPAa 1蛋白活性较高。
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权利要求
一种食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于，该方法通过下列步骤实现在体外人工合成吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Bat PA)的全长基因，再将其克隆到表达载体pPIC9K上，对重组质粒进行线性化处理后，通过电穿孔的方法将线性化的重组质粒转化进入酵母细胞，进而稳定整合到酵母染色体上，重组酵母在发酵培养过程中经过诱导，吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在信号肽的引导下分泌表达到培养基中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括对重组酵母细胞的如下筛 选步骤挑取单克隆G418筛选高拷贝菌株，小量表达挑选高表达菌株；P. pastoris工程菌 中目的蛋白的表达条件优化及大量表达；通过Ni柱亲和层析的方法对表达产物进行纯化； 纤溶平板法测定表达产物活性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，利用金属镍离子与连续六个组氨酸的 肽序列的特异性亲和作用，采用在吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的编码基因5’加上一个六 组氨酸编码的序列，使产生的蛋白的N端带上六组氨酸的标签，以方便蛋白的纯化。
全文摘要
一种食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达方法，通过在体外人工合成吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Bat-PA)的全长基因，再将其克隆到表达载体pPIC9K上，然后通过电穿孔的方法将线性化的重组质粒转化进入酵母细胞，进而稳定整合到酵母染色体上，该方法使食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂特别是DSPAα1在毕赤酵母中稳定高效表达，从而降低生产成本，提高表达量，并使产生的重组蛋白具有天然蛋白的生物活性纯化后的蛋白可用于治疗各种血栓性心脑血管疾病。
文档编号C12N15/81GK101914568SQ20091010339
公开日2010年12月15日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者刘堰, 宋小双, 石小花, 聂盼, 肖明春, 苏畅 申请人:西南大学