专利名称：动物衣原体多重套式pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及动物衣原体检疫检测试剂盒，具体是一种用于同步进行衣原体(属)的鉴定和单管分型检测猪源衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体三种常见动物衣原体的多重套式PCR检测试剂盒，本发明还应用所述试剂盒对所述三种动物衣原体进行同步多重套式PCR检测生物学检测的方法。
背景技术：
猪源衣原体(Chlamydia suis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)和肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)是三种导致动物衣原体病的常见衣原体。在兽医临床上，这三种衣原体往往呈混合感染，引起猪的流产，腹泻及呼吸系统症状。Rogers等的实验室感染试验发现，猪衣原体的感染可以导致无症状的肠道损害，并不引起腹泻(Rogers，D.G.，2000)。在断奶仔猪，本病原的感染出来引起肠道损害外，还会导致多系统衰竭征(Carrasco，L.，2000).Hoelzle利用PCR检测技术调查了49头有呼吸系统疾病的猪和205头有繁殖系统疾病的母猪，发现49％呼吸系统疾病的猪和60％有繁殖系统疾病的母猪均存在衣原体感染，对健康猪的调查也发现24.85％的猪的呼吸道可以检测到衣原体存在。通过探针杂交及测序鉴定，发现大多的情况是鹦鹉热衣原体和猪衣原体的混合感染(Hoelzle，L.E.，2000)。
传统的衣原体诊断方法包括组织涂片染色法，体外分离培养，免疫荧光及补体结合试验等。近年来，越来越多新型诊断技术被应用于衣原体检测。Vladimir V等人利用PCR-RFLP技术对衣原体科的各种衣原体进行了研究，认为衣原体omp2基因的3’端序列是衣原体的种属特异的区域，可以应用于衣原体的分类及鉴定(Vladimir V.，2005)。但这种技术在聚合酶连式反应之后还需要对产物进行纯化和酶切，由此比较费时。Xiong等人利用多重PCR体系扩增衣原体的OMP1及胞内质粒基因，然后和RLB膜上的15种亚型特异性的沙眼衣原体设计特异性的探针杂交，实现对不同亚型沙眼衣原体的同时检测(Likuan Xiong，2006)。近年来国内的学者已经开始了对猪衣原病的重视，也开发了不少新的诊断方法，但是研究的仍以鹦鹉热衣原体为主(邱昌庆，1998；赵志伟，2002；张焕容，2007；曹兴萍，2007)，对于猪的其他衣原体的诊断技术的研究尚无相关报道。由此发明一种可以同时检测多种衣原体的检测方法对研究我国猪群衣原体感染情况具体重要意义。国内外在病原体的检测方面，利用单管多重PCR对多重病原进行同步检测已经有很多的报告，但在兽医临床诊断方面，尚未见到多重检查猪衣原体的诊断方法。
病原体的PCR检测需要合成相应的特异PCR扩增引物，并设计适合每对引物的PCR扩增条件即可以在临床检测中获得良好的结果，因此，该方法已在国内外的兽医临床检验中广泛应用。近年来，兽医临床上发现的多种病原体的混合感染促进了同步检测多种病原体的检测方法的发展。针对病原体核酸序列设计的多重PCR需要针对不同的病原体设计各自特异且种内保守的寡聚核苷酸引物，并同时在同一个体系种进行反应，由于引物之间的相互作用的复杂性，故多重的PCR扩增体系需要进行各方面的优化和调整。一般而言，多重PCR方法的复杂性和引物对数成正比。因此，本发明的三重PCR扩增用引物的设计和PCR条件的设计是发明的核心。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于同步进行衣原体(属)的鉴定和单管分型检测猪源衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体的多重套式PCR检测试剂盒，本发明的另一个目的是提供用所述试剂盒对所述三种动物衣原体进行同步重套式PCR检测生物学检测的方法。
在本发明的PCR扩增引物的设计上，除了遵循一般的引物设计要求外，本发明创新采用了套式多重扩增的先进理念，先设计一对针对这三种衣原体的通用引物，然后在该对引物的扩增区域内部的不同位置，设计了针对三种不同衣原体的特异引物，而且保证在相同的退火温度下均能获得较好的扩增。由于有了通用引物的前扩增，使得特异引物可以更加容易获得对特异衣原体靶基因的扩增，这极大地提高了多重PCR检测方法的灵敏度。同时，每种衣原体只是共同使用了一条通用的上游引物，独立了一条特异的下游引物，减少了体系中的引物数量，降低了PCR体系和扩增条件的设计难度。针对不同衣原体的特异引物存在于通用引物扩增靶序列内部的不同位置，从而可以方便地通过扩增片段的长度的不同鉴别出不同的衣原体种类。
因此，实现本发明目的采用的技术方案是这样的，即一种动物衣原体多重套式PCR检测试剂盒，包括 Mix I PCR反应液管、Mix II PCR反应液管；阳性对照管、阴性对照管、样品裂解液A管、样品裂解液B管、提取液C管、异丙醇管、75％乙醇管、灭菌去离子水管；其中 (1)Mix I PCR反应管管内由以下反应液组成 序列为SEQ ID NO1的25mM的上游引物0.3uL； 序列为SEQ ID NO2的25mM的下游引物0.3uL； 10×PCR buffer缓冲液2.5uL； 10mM dNTP Mix 0.5uL； 25mM MgC12 1.5uL； 5U/uL Taq聚合酶0.25uL； 灭菌双蒸水16.65uL； 合计22uL，为一个反应的量； (2)Mix II PCR反应液管管内由以下反应液组成 序列为SEQ ID NO3的25mM的上游引物0.4uL； 序列为SEQ ID NO4的25mM的下游引物0.2uL； 序列为SEQ ID NO5的25mM的下游引物0.1uL； 序列为SEQ ID NO6的25mM的下游引物0.2uL； 10×PCR缓冲液2.5uL； 10mM dNTP Mix 0.5uL； 25mM MgC12 2.0uL； 5U/uL Taq聚合酶0.2uL； 灭菌双蒸水15.9uL； 合计22uL，为一个反应的量； (3)阳性对照管为猪源衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体各自的ompA基因重组质粒，比例为1∶1∶1，2uL～20uL，其中 猪源衣原体ompA基因重组质粒pMD19-csuH的DNA序列为SEQ ID NO7； 鹦鹉热衣原体ompA基因重组质粒pMD19-cpsH的DNA序列为SEQ ID NO8； 肺炎衣原体ompA基因重组质粒pMD19-cpnH的DNA序列为SEQ ID NO9； (4)阴性对照管阴性对照为无衣原体感染猪的肺脏组织DNA样品，2uL-20uL； (5)试剂管 样品裂解液A管1.5mM EDTA，0.8mM Tris，150mM NaCl，0.5％SDS，共计30mL； 样品裂解液B管25mg/mL蛋白酶K，200～500uL； 提取液C管碱性酚/氯仿/异戊醇混合液＝25/24/1(pH8.0)，12～30mL； (6)灭菌去离子水管1～2mL。
SEQ ID NO1代表的序列为5′-CTCCTTRCAAGCYYTGCCTGT-3′； SEQ ID NO2代表的序列为5′-GTGAGCWGCTCTTTCRTYRATTAARCG-3′； SEQ ID NO3代表的序列为5′-CTCCTTRCAAGCYYTGCCTGT-3′； SEQ ID NO4代表的序列为5′-GAGGTTTGTTGATGGTGAAT-3′； SEQ ID NO5代表的序列为5′-GAGGTTTGTTGATGGTGAAT-3′； SEQ ID NO6代表的序列为5′-GAGATTGAACGCTGTAGAGT-3′； SEQ ID NO7代表的序列为 5′-AAAAGGCTAATGAACCATGATTACGCCAAGTTTgCACGCCTGCCGTTCGACGATTGTGAG60 CTGCTCTTTCATTGATTAAACGAGTCTCAACAGTAACTGCGTATTTATCTGCATCTACAA 120 TTGTTGTTCCAACTGCAAGACCACAAGATTTTCTGGACTTCATCTTGTTGATTTGCATGG 180 AGACGATTTGCATAGTATCTCCGAGCTCTCCAGCGCTGCCTTTGTCTTCCACTTTACCAG 240 CTCCTGCAATTGTCGGGTTTAATGTGGTGACATCGAAGACAGCTGTAGCTAGTTTTGGCT 300 GAGCAATGCGAATTGTGTCGGCATCAAAGCTTGCTCGAGACCATTTAACTCCAATGTAAG 360 GAGTGAACATATTTAATCTGTAAGAGAGGGCTAAACTTGCTTGCCATTCATGGTAATCGA 420 TAGAGGCATCTTTAGTCCCTGTAGCAGCAGTTGTTCCTGCTTTTAGATCGAGAGGGAATT 480 CTACCCCAACATACCCTTGAGGTTTGTTGATGGTGAATTCAGCAGCATTGCAAAGAACGT 540 TTAACTCTTCTACTTTAGGTTTAGACTGAGCGTATTGGAAAGAAGCTCCTAAAGTTGCGC 600 ACCCACATTCCCATAAAGCGGCTCTAGCGCCTACACTCCAAGCGAAGGCAGTATCTGTAT 660 AAAGCTCGACAACGGACTGTGATAGGCTTACGTTTAGGTACAGCTGTTGCCTGTGCTGCA 720 GTAgTCTCGTTAGCTCCGAATAATCCGACTAAgTTAAAAGAAaCAAATTTCCCTTGAGGT 780 AACCGTTGGTTGCTCCTAAGTACAGAATACATCAAACGATCCAATATTCAACGCCTGAAA 840 GCAGCATTGGTAACATCTCCGCATCTGGAATGTTACCATAGGCAGGTTATCGCGAGCGGT 900 TAGTTGGTAGGGATGTGTATCCTGGGTATGCTAGAATATCCCCCATGTCAACTGCTTGCA 960 ATCTGTTTTAGGACCGTCCAAC-3′982 SEQ ID NO8代表的序列为 5′-CAGCTATGAaCATGATTACGCCAAGTTTGCACGCCTGCCGTTCGACGATTCTCCTTACAA60 GCTTTGCCTGTAGGGAACCCTTCTGATCCAAGCTTATTAATTGATGGTACAATATGGGAA 120 GGTGCTGCAGGAGATCCTTGCGATCCTTGCGCTACTTGGTGCGACGCTATTAGCTTACGT 180 GCTGGATTTTACGGAGACTATGTTTTCGACCGTATCTTAAAAGCAGATGCACCTAAAACA 240 TTTTCTATGGGAGCCAAGCCTACTGGATCCGCTGCTGCAAACTATACTACTGCCGTAGAT 300 AGACCTAACCCGGCCTACAATAAGCATTTACACGATGCAGAGTGGTTCACTAATGCAGGC 360 TTCATTGCCTTAAACATTTGGGATCGCTTTGATGTTTTCTGTACTTTAGGAGCTTCTAAT 420 GGTTACATTAGAGGAAACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGTTTATTCGGAGTTAAAGGT 480 ACTACTGTAAATGCAAATGAACTACCAAACGTTTCTTTAAGTAACGGAGTTGTTGAACTT 540 TACACAGACACCTCTTTCTCTTGGAGCGTAGGCGCTCGTGGAGCCTTATGGGAATGCGGT 600 TGTGCAACTTTGGGAGCTGAATTCCAATATGCACAGTCCAAACCTAAAGTTGAAGAACTT 660 AATGTGATCTGTAACGTATCGCAATTCTCTGTAAACAAACCCaAGGGCTATAAGGCGTTG 720 CTTTCCCTTGCCACAGACGCTGGCGTAaCACAGCTACTGGAACAAGTCTGCGACATCATT 780 ATCATGATGGCAGTAGAGCCTCTCTATCTTAAGACTAACTCTTTAGGGCAACATTGGAGT 840 ACATGGTCCCGGCACTTTTGAGCTGATAAATCGCATTGCCACAACTACTACGCTGTTTTA 900 CTACTGCATGACTCTTTCTAGAATGCCAGCATGCCTATATTGATTTCTTTCAACTTG-3′ 957 SEQ ID NO9代表的序列为 5′-AATGGAACCATGATTACGCCaAGTTTgCACGCCTGCCGTTCGACGATTCTCCTTACAAGC 60 TTTGCCTGTAGGGAACCCAGCTGAACCAAGTTTATTAATCGATGGCACTATGTGGGAAGG 120 TGCTTCAGGTGATCCTTGCGATCCTTGCTCTACTTGGTGTGATGCTATCAGCATCCGCGC 180 AGGATACTACGGAGATTATGTTTTCGATCGTGTATTAAAAGTTGATGTGAATAAAACTTT 240 CAGCGGCATTGGCAAGAAACCCACAGGATCCTCTCCAAATGACTTTAAAAATGCTGAAGA 300 TAGACCCAACGTCGCTTATGGCAGACATTTGCAAGACTCCGAATGGTTTACAAATGCAGC 360 TTTCTTAGCGTTAAATATCTGGGATCGTTTTGGTATTTTCTGCACATTAGGCGCTTCTAA 420 TGGGTACTTCAAAGCTAGTTCTGCGGCGTTCAATCTCGTTGGTTTGATTGGTGTTAAAGG 480 AAACTCCTTAACAAATGACCAACTTCCCAACGTAGCCATCACTCAAGGCGTTGTTGAGTT 540 TTACACAGATACAACGTTCTCTTGGAGCGTAGGTGCACGTGGAGCTCTATGGGAATGTGG 600 TTGCGCAACTTTAGGAGCTGAATTCCAATACGCTCAATCTAATCCTAAAATTGAAATGTT 660 GAATGTAATCTCCAGCCCAGCACAATTTGTGGTTCACAAGCCTAGAGGATACAAGGgAAC 720 GTCCGCCAACTTTCCTTTACCTGCAAATGCAGGCACAGAGGCTGCTACGGATACTAAATC 780 TGCACACTCAATATCATGAATGGCAAGTTGGTCTAGCACTCTCTTACAGATTGGAAATGT 840 TAGTCCTTACGTTGGCGTAAACTGGTCCGAGCAACTTTTGATGCCGACCTATCCGCATCG 900 CTCACCTAATTGGCCTCTGCTGTTATGAACTTGAACACTGGAAACCAACCCTTTTAAG-3′958 本发明动物衣原体多重套式PCR检测的方法，其特征是方法由以下步骤组成 (1)制备待测样品的核酸模板取100～200uL(mg)待检样品，先加入裂解液A 500uL，震荡混匀，然后加入样品裂解液B 15uL，混匀后55℃裂解2～3小时。然后加入提取液C 600uL，离心15分钟萃取出样品中的DNA，取上清500uL，然后加入等体积的异丙醇沉淀，-80℃沉淀30分钟，1300转/分钟离心15分钟，去掉上清，沉淀用700uL 75％乙醇脱盐，40℃烘干，最后将沉淀的DNA溶解于20～50uL灭菌去离子水中，即为核酸模板； (2)取3uL样品核酸模板和阴阳性对照DNA分别用Mix I PCR管和MixII PCR管进行扩增；Mix I PCR扩增产物在1100bp左右，示动物衣原体阳性，而阴性对照在该位置上无可见扩增；Mix II PCR扩增产物若出现526bp扩增条带，表示猪源衣原体PCR阳性，340bp扩增条带表示鹦鹉热衣原体PCR阳性，267bp示肺炎衣原体PCR阳性，而阴性对照无任何可见扩增条带； Mix I PCR的扩增条件是 预变性95℃5分钟； 循环变性94℃40秒，退火59℃35秒，延伸72℃1分钟；40个循环 延伸72℃8分钟。
Mix II PCR扩增条件是 预变性95℃5分钟； 循环94℃40秒，55℃30秒，72℃35秒；35个循环 延伸72℃8分钟。
本发明的优点 本发明可以快速地对待检样品是否感染衣原体进行鉴定，并能进一步鉴定其是否属于常见的衣原体感染，并具有较高的灵敏度。在引物的设计上，选择了衣原体的九种亚种所有已知核酸序列，并通过文献检索加多重比对的办法对收集到的核酸序列进行了筛选。通过反复的试验，我们排除了有非特异扩增的引物，最后选定的SEQ ID NO1引物，SEQ ID NO2引物，SEQ ID NO3引物，SEQ ID NO4引物，SEQ ID NO5引物，SEQ ID NO6引物分别作为衣原体属，猪衣原体，肺炎衣原体，鹦鹉热衣原体的鉴定引物。并通过条件的优化，可以高灵敏度地对衣原体的常见种属进行鉴定。本发明的技术可以组装成临床诊断猪衣原体病病原的PCR诊断试剂盒，供兽医临床和实验室诊断所用。
本发明提供的扩增试剂和核酸提取试剂均为试验反复验证和优化，具有市场上同类PCR检测试剂盒的相应的优点。归结起来为1)特异性好实验证明，本发明对非衣原体DNA无非特异的扩增，假阳性率低。2)灵敏度高试验证明，本发明对衣原体DNA的检测低限在约为0.5～0.9ng。
图1.待检样品核酸电泳； 图2.Mix I PCR扩增产物电泳； 图3.PCR Mix II扩增产物电泳； 图4.PCR Mix II特异性试验电泳； 图5.灵敏度试验电泳。
具体实施例方式 实施例1、本发明引物的设计及筛选 收集已知的9种亚型的衣原体菌株ompA基因全长序列，利用ClustW软件进行多重比对，在每种亚型衣原体的特异性区域设计针对各种亚型衣原体的特异性引物，分别记为SEQ ID NO1......SEQ ID NO6。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。利用核酸提取试剂盒提取正常Hella细胞、无衣原体感染猪肺组织及血清DNA，在预变性95℃5min；循环94℃60s，50℃60s，72℃60s；35个循环，延伸72℃8min，进行扩增。去掉有明显扩增的引物。用核酸提取试剂盒分别提取标准衣原体菌株，用设计的各对亚型特异性引物在上述条件下扩增每种阳性衣原体核酸模板，排除有非特异性扩增的引物，留取只对本亚型有特异性扩增对其他亚种衣原体无扩增的引物。在59℃退火下，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2引物只对衣原体有扩增，对猪DNA，Hella细胞DNA，支原体等其他非衣原体DNA无任何扩增，适合于对样本是否含有衣原体可以进行鉴定。在55℃退火下，SEQ ID NO4引物可以特异性地扩增猪源衣原体，对其他衣原体亚种及非衣原体DNA均无非特异扩增；在55℃退火下，SEQ ID NO6引物可以特异性地扩增猪鹦鹉热衣原体，对其他衣原体亚种及非衣原体DNA均无非特异扩增；联合引物SEQ ID NO3、SEQ IDNO4、SEQ ID NO5，SEQ ID NO6可以在55℃退火下实现对猪衣原体、猪鹦鹉热衣原体，猪肺炎衣原体的单管同步鉴定，且无非特异性的扩增。
获得的引物 实施例2阳性对照品的制备 用试剂盒核酸提取试剂提取阳性衣原体菌株细胞培养物的DNA，电泳提取的核酸。然后采用Mix I PCR分别扩增猪源衣原体，鹦鹉热衣原体，肺炎衣原体DNA，三个反应后均可以扩增出一条1100bp左右的条带。使用胶回收试剂盒回收扩增的条带，利用分光光度计测定回收的核酸的浓度。按照1∶10的比例和pMD19载体进行连接反应，23℃连接2小时，转化JM109菌，抗性筛选及PCR鉴定阳性者，再测序验证，获得含ompA基因近全长片段克隆，将三种衣原体的阳性质粒等比例混合，分装每支50uL，浓度控制在80～100ng/uL。
实施例3阴性对照品的制备 用试剂盒核酸提取试剂提取无衣原体感染的猪肺组织的DNA，电泳提取的核酸。然后用灭菌去离子水稀释，将浓度控制在浓度控制在80～100ng/uL，分装每支50uL。
实施例4制备待测样品的核酸模板 1、样品模板的制备 a、血清样品 取待检血清100uL，加入一无菌1.5mL离心管中，再加入500uL裂解液A，吹吸混匀，加入15uL裂解液B，混匀，放置于55℃水浴锅中裂解2～3小时；取出，将入600uL提取液C，剧烈震荡混匀后，13000rpm，4℃离心10分钟；取上清500uL(避免取到下层液体)，加入等体积异丙醇，液氮或-80℃快速冷冻30min。取出，13000rpm，4℃离心15分钟；然后，轻轻倒去离心管中的所有液体，在吸水纸上倒扣一阵；然后加入600uL冰预冷的75％乙醇，轻轻倾斜转洗一周后，倒去乙醇，倒扣于吸水纸一阵后，自然或50℃真空抽干；最后加入25uL无菌双蒸水，溶解核酸。制备的核酸样品可低温保存数周至检测。超低温可以保存数年。
b、组织样品 匀浆组织块，然后将组织匀浆3500转离心5分钟，取上清100uL进行DNA提取，步骤同a。
c、鼻咽拭子 每支鼻咽拭子加入100～500uL无菌PBS，反复挤压以析出拭子上的病原，然后弃去拭子，取析出液100uL进行核酸提取，步骤同a。
2、核酸模板的电泳 将步骤一提取获得的DNA电泳。条件1％琼脂糖凝胶，10V/cm，40min。
实施例5扩增体系的建立和优化 以标准阳性菌株DNA为模板，在非严谨的条件下进行扩增，优化扩增的退火温度，然后在优化的退火条件下，优化体系的Mg2+浓度、引物浓度，PCR缓冲液浓度及Taq酶浓度。优化的Mix I PCR反应液中包含10×PCR缓冲液2.5uL，10mM dNTP Mi x 0.5uL，25mM MgCl 21.5uL，25mM引物seq1和seq2各0.3uL，5U/uL Taq聚合酶0.25uL，灭菌双蒸水16.65uL；优化的Mix IIPCR反应液中包含10×PCR缓冲液2.5uL，10mM dNTP Mix 0.5uL，25mMMgC12 2.0uL，25mM引物seq3 0.4uL，25mM引物seq4 0.2uL，25mM引物seq50.1uL，25mM引物seq6 0.2uL，5U/uL Taq聚合酶0.2uL，灭菌双蒸水15.9uL。在优化的退火温度及循环条件下，两个体系可以实现对衣原体的属及三种主要亚型的鉴定。优化的Mix I PCR的扩增条件是 预变性95℃5分钟； 循环变性94℃40秒，退火59℃35秒，延伸72℃1分钟；40个循环； 延伸72℃8分钟。
Mix II PCR扩增条件是 预变性95℃5分钟； 循环94℃40秒，55℃30秒，72℃35秒；35个循环； 延伸72℃8分钟。
实施例6特异性和灵敏度 采用上述优化的体系及扩增条件，对标准阳性衣原体菌株(猪衣原体、猪肺炎衣原体及鹦鹉热衣原体)、猪支原体、猪传染性胸膜肺炎S5菌株、猪繁殖障碍综合征病毒美洲株、出血性大肠杆菌和SPF猪组织等核酸提取物进行扩增，Mix I PCR和Mix II PCR体系均无非特异性扩增条带。
将阳性菌株DNA用灭菌去离子水梯度稀释后，用Mix I PCR和Mix II PCR进行套式扩增，本发明的最低检测限约为0.5～0.9ng。
实施例7试剂的制备 1、裂解液A的配制 1)、首先配制1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl) 三羟甲基氨基甲烷 12.11g 灭菌双蒸水80mL 浓盐酸调pH至8.0 灭菌双蒸水加至100mL 2)然后配制0.5M乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g 灭菌双蒸水80mL 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水加至100mL 然后配制20％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液 十二烷基磺酸钠20g 灭菌双蒸水80mL 浓盐酸调pH至7.2 灭菌双蒸水加至100mL 3)配制裂解液A 1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(室温下pH8.0)2mL 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 0.4mL 20％十二烷基磺酸钠溶液(pH7.2) 5mL 5M氯化钠 4mL 灭菌双蒸水加至200mL 分装30mL/瓶。
2、裂解液B配制 蛋白酶K5g 灭菌双蒸水 加至250mL 分装500uL/支。
3、提取液C配制 碱性酚 25mL 氯仿 24mL 异戊醇 1mL 分装20mL/瓶。
4、Mix I PCR反应液的配制 10×PCR缓冲液2.5uL，10mM dNTP Mix 0.5uL，25mM MgCl2 1.5uL，25mM引物seq1和seq2各0.3uL，5U/uL Taq聚合酶0.25uL，灭菌双蒸水16.65uL；合计22uL，每个试剂盒提供足做30个反应的量共22×30＝660uL。
5、Mix II PCR反应液的配制 优化的Mix II PCR反应液中包含10×PCR缓冲液2.5uL，10mM dNTPMix 0.5uL，25mM MgCl2 2.0uL，25mM引物seq3 0.4uL，25mM引物seq4 0.2uL，25mM引物seq5 0.1uL，25mM引物seq6 0.2uL，5U/uL Taq聚合酶0.2uL，灭菌双蒸水15.9uL；合计22uL，每个试剂盒提供足做30个反应的量(22×30＝660uL)。
实施例8试剂盒的组装 将如上所配制的阳性对照、阴性对照各一支，Mix I PCR和Mix II PCR 1支，裂解液A一瓶、裂解液B和提取液C各两瓶放置于试剂盒的支架上，盖好盖子，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。
与本专利申请有关的序列表
<110>重庆大学、重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>动物衣原体多重套式PCR检测试剂盒及其检测方法
<160>9
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>根据衣原体ompA基因序列设计，用于动物衣原体的检测的上游引物；
<400>SEQ ID NO1
ctccttrcaagcyytgcctgt21
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<223>根据衣原体ompA基因序列设计，用于动物衣原体的检测的下游引物；
<400>SEQ ID NO2
GTGAGCWGCTCTTTCRTYRATTAARCG 27
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>根据衣原体ompA基因序列设计，用于动物衣原体的检测的上游引物；
<400>SEQ ID NO3
TACGGAGAyTATGTTTTyGA 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>根据衣原体ompA基因序列设计，用于动物衣原体的检测的下游引物；
<400>SEQ ID NO4
GAGGTTTGTTGATGGTGAAT 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>根据衣原体ompA基因序列设计，用于动物衣原体的检测的下游引物；
<400>SEQ ID NO5
GAGATTGAACGCTGTAGAGT 20
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<223>根据衣原体ompA基因序列设计，用于动物衣原体的检测的下游引物；
<400>SEQ ID NO6
GCCTTGAGTGATGCCTA17
<210>7
<211>982
<212>DNA
<213>pMD19-Chlamydia suis
<223>克隆的猪源衣原体ompA基因，用于动物衣原体的检测阳性对照；
<400>SEQ ID NO7
AAAAGGCTAATGAACCATGATTACGCCAAGTTTgCACGCCTGCCGTTCGACGATTGTGAG 60
CTGCTCTTTCATTGATTAAACGAGTCTCAACAGTAACTGCGTATTTATCTGCATCTACAA 120
TTGTTGTTCCAACTGCAAGACCACAAGATTTTCTGGACTTCATCTTGTTGATTTGCATGG 180
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CTCCTGCAATTGTCGGGTTTAATGTGGTGACATCGAAGACAGCTGTAGCTAGTTTTGGCT 300
GAGCAATGCGAATTGTGTCGGCATCAAAGCTTGCTCGAGACCATTTAACTCCAATGTAAG 360
GAGTGAACATATTTAATCTGTAAGAGAGGGCTAAACTTGCTTGCCATTCATGGTAATCGA 420
TAGAGGCATCTTTAGTCCCTGTAGCAGCAGTTGTTCCTGCTTTTAGATCGAGAGGGAATT 480
CTACCCCAACATACCCTTGAGGTTTGTTGATGGTGAATTCAGCAGCATTGCAAAGAACGT 540
TTAACTCTTCTACTTTAGGTTTAGACTGAGCGTATTGGAAAGAAGCTCCTAAAGTTGCGC 600
ACCCACATTCCCATAAAGCGGCTCTAGCGCCTACACTCCAAGCGAAGGCAGTATCTGTAT 660
AAAGCTCGACAACGGACTGTGATAGGCTTACGTTTAGGTACAGCTGTTGCCTGTGCTGCA 720
GTAgTCTCGTTAGCTCCGAATAATCCGACTAAgTTAAAAGAAaCAAATTTCCCTTGAGGT 780
AACCGTTGGTTGCTCCTAAGTACAGAATACATCAAACGATCCAATATTCAACGCCTGAAA 840
GCAGCATTGGTAACATCTCCGCATCTGGAATGTTACCATAGGCAGGTTATCGCGAGCGGT 900
TAGTTGGTAGGGATGTGTATCCTGGGTATGCTAGAATATCCCCCATGTCAACTGCTTGCA 960
ATCTGTTTTAGGACCGTCCAAC982
<210>8
<211>957
<212>DNA
<213>pMD19-Chlamydophila pneumoniae
<223>克隆的肺炎衣原体ompA基因，用于动物衣原体的检测阳性对照；
<400>SEQ ID NO8
CAGCTATGAaCATGATTACGCCAAGTTTGCACGCCTGCCGTTCGACGATTCTCCTTACAA 60
GCTTTGCCTGTAGGGAACCCTTCTGATCCAAGCTTATTAATTGATGGTACAATATGGGAA 120
GGTGCTGCAGGAGATCCTTGCGATCCTTGCGCTACTTGGTGCGACGCTATTAGCTTACGT 180
GCTGGATTTTACGGAGACTATGTTTTCGACCGTATCTTAAAAGCAGATGCACCTAAAACA 240
TTTTCTATGGGAGCCAAGCCTACTGGATCCGCTGCTGCAAACTATACTACTGCCGTAGAT 300
AGACCTAACCCGGCCTACAATAAGCATTTACACGATGCAGAGTGGTTCACTAATGCAGGC 360
TTCATTGCCTTAAACATTTGGGATCGCTTTGATGTTTTCTGTACTTTAGGAGCTTCTAAT 420
GGTTACATTAGAGGAAACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGTTTATTCGGAGTTAAAGGT 480
ACTACTGTAAATGCAAATGAACTACCAAACGTTTCTTTAAGTAACGGAGTTGTTGAACTT 540
TACACAGACACCTCTTTCTCTTGGAGCGTAGGCGCTCGTGGAGCCTTATGGGAATGCGGT 600
TGTGCAACTTTGGGAGCTGAATTCCAATATGCACAGTCCAAACCTAAAGTTGAAGAACTT 660
AATGTGATCTGTAACGTATCGCAATTCTCTGTAAACAAACCCaAGGGCTATAAGGCGTTG 720
CTTTCCCTTGCCACAGACGCTGGCGTAaCACAGCTACTGGAACAAGTCTGCGACATCATT 780
ATCATGATGGCAGTAGAGCCTCTCTATCTTAAGACTAACTCTTTAGGGCAACATTGGAGT 840
ACATGGTCCCGGCACTTTTGAGCTGATAAATCGCATTGCCACAACTACTACGCTGTTTTA 900
CTACTGCATGACTCTTTCTAGAATGCCAGCATGCCTATATTGATTTCTTTCAACTTG 957
<210>9
<211>958
<212>DNA
<213>pMD19-Chlamydophila psittaci
<223>克隆的鹦鹉热衣原体ompA基因，用于动物衣原体的检测阳性对照；
<400>SEQ ID NO9
AATGGAACCATGATTACGCCaAGTTTgCACGCCTGCCGTTCGACGATTCTCCTTACAAGC 60
TTTGCCTGTAGGGAACCCAGCTGAACCAAGTTTATTAATCGATGGCACTATGTGGGAAGG 120
TGCTTCAGGTGATCCTTGCGATCCTTGCTCTACTTGGTGTGATGCTATCAGCATCCGCGC 180
AGGATACTACGGAGATTATGTTTTCGATCGTGTATTAAAAGTTGATGTGAATAAAACTTT 240
CAGCGGCATTGGCAAGAAACCCACAGGATCCTCTCCAAATGACTTTAAAAATGCTGAAGA 300
TAGACCCAACGTCGCTTATGGCAGACATTTGCAAGACTCCGAATGGTTTACAAATGCAGC 360
TTTCTTAGCGTTAAATATCTGGGATCGTTTTGGTATTTTCTGCACATTAGGCGCTTCTAA 420
TGGGTACTTCAAAGCTAGTTCTGCGGCGTTCAATCTCGTTGGTTTGATTGGTGTTAAAGG 480
AAACTCCTTAACAAATGACCAACTTCCCAACGTAGCCATCACTCAAGGCGTTGTTGAGTT 540
TTACACAGATACAACGTTCTCTTGGAGCGTAGGTGCACGTGGAGCTCTATGGGAATGTGG 600
TTGCGCAACTTTAGGAGCTGAATTCCAATACGCTCAATCTAATCCTAAAATTGAAATGTT 660
GAATGTAATCTCCAGCCCAGCACAATTTGTGGTTCACAAGCCTAGAGGATACAAGGgAAC 720
GTCCGCCAACTTTCCTTTACCTGCAAATGCAGGCACAGAGGCTGCTACGGATACTAAATC 780
TGCACACTCAATATCATGAATGGCAAGTTGGTCTAGCACTCTCTTACAGATTGGAAATGT 840
TAGTCCTTACGTTGGCGTAAACTGGTCCGAGCAACTTTTGATGCCGACCTATCCGCATCG 900
CTCACCTAATTGGCCTCTGCTGTTATGAACTTGAACACTGGAAACCAACCCTTTTAAG958
权利要求
1.一种猪衣原体多重套式PCR检测试剂盒，其特征是它包括
Mix I PCR反应液管、Mix II PCR反应液管；阳性对照管、阴性对照管、样品裂解液A管、样品裂解液B管、提取液C管、异丙醇管、75％乙醇管、灭菌去离子水管；其中
(1)Mix I PCR反应管管内由以下反应液组成
序列为SEQ ID NO1的25mM的上游引物0.3uL；
序列为SEQ ID NO2的25mM的下游引物0.3uL；
10×PCR buffer缓冲液2.5uL；
10mM dNTP Mix 0.5uL；
25mM MgCl2 1.5uL；
5U/uL Taq聚合酶0.25uL；
灭菌双蒸水16.65uL；
合计22uL，为单次反应的用量；
(2)Mi x II PCR反应液管管内由以下反应液组成
序列为SEQ ID NO3的25mM的上游引物0.4uL；
序列为SEQ ID NO4的25mM的下游引物0.2uL；
序列为SEQ ID NO5的25mM的下游引物0.1uL；
序列为SEQ ID NO6的25mM的下游引物0.2uL；
10×PCR缓冲液2.5uL；
10mM dNTP Mix 0.5uL；
25mM MgCl2 2.0uL；
5U/uL Taq聚合酶0.2uL；
灭菌双蒸水15.9uL；
合计22uL，为单次反应的用量；
(3)阳性对照管为猪源衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体各自的ompA基因重组质粒，比例为1∶1∶1，2uL～20uL，其如下
猪源衣原体ompA基因重组质粒pMD19-csuH的DNA序列为SEQ ID NO7；
鹦鹉热衣原体ompA基因重组质粒pMD19-cpsH的DNA序列为SEQ ID NO8；
肺炎衣原体ompA基因重组质粒pMD19-cpnH的DNA序列为SEQ ID NO9；
(4)阴性对照管阴性对照为无衣原体感染猪的肺脏组织DNA样品，2uL-20uL；
(5)试剂管
样品裂解液A管1.5mM EDTA，0.8mM Tris，150mM NaCl，0.5％SDS，共计30mL；
样品裂解液B管25mg/mL蛋白酶K，200～500uL；
提取液C管碱性酚/氯仿/异戊醇混合液＝25/24/1(pH8.0)，12～30mL；
(6)灭菌去离子水管1～2mL。
2.如权利要求1所述试剂盒用于的动物衣原体多重套式PCR检测的方法，其特征是方法由以下步骤组成
(1)制备待测样品的核酸模板取100～200uL(mg)待检样品，先加入裂解液A 500uL，震荡混匀，然后加入样品裂解液B 15uL，混匀后55℃裂解2～4小时。然后加入提取液C 600uL，离心15分钟萃取出样品中的DNA，取上清500uL，然后加入等体积的异丙醇沉淀，-80℃沉淀30分钟，1300转/分钟离心15分钟，去掉上清，沉淀用700uL 75％乙醇脱盐，40℃烘干，最后将沉淀的DNA溶解于20～50uL灭菌去离子水中，即为核酸模板；
(2)PCR扩增检测取3uL样品核酸模板和阴阳性对照DNA分别用MixI PCR液1管和Mix II PCR反应液1管进行扩增；Mix I PCR扩增产物在1100bp左右，示动物衣原体阳性，而阴性对照在该位置上无可见扩增；MixII PCR扩增产物若出现526bp扩增条带，表示猪源衣原体PCR阳性，340bp扩增条带表示鹦鹉热衣原体PCR阳性，267bp示肺炎衣原体PCR阳性，而阴性对照无任何可见扩增条带；
Mix I PCR的扩增条件是
预变性95℃5分钟；
循环变性94℃40秒，退火59℃30分钟，延伸72℃1分钟；40个循环；延伸72℃8分钟；
Mix II PCR扩增条件是
预变性95℃5分钟；
循环94℃30秒，55℃30秒，72℃35秒；35个循环
延伸72℃8分钟。
全文摘要
本发明涉及动物衣原体病的分型诊断试剂盒及其方法。本发明根据动物衣原体三种动物衣原体的ompA基因序列，设计了一对针对的上游及下游聚合酶链式反应寡聚核苷酸引物，可以扩增出所有动物衣原体的一条特异性片段，实现对动物衣原体属的所有衣原体进行有效的检测。在该引物的基础上，可以在临床核酸样本中单管同步扩增出三段长度大小不同的片段，在普通电泳中可以清晰分辨，从而实现对三种动物衣原体的同步检测。本发明利用套式多重PCR方法，单管同步检测猪衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体三种衣原体，从而降低了动物衣原体实验室动物衣原体疾病诊断的成本和工作量。特异性强、灵敏度高、可重复性高，且操作简便，没有繁杂的后处理。
文档编号C12Q1/68GK101608239SQ20091010345
公开日2009年12月23日 申请日期2009年3月26日 优先权日2009年3月26日
发明者李应国, 李正国, 昱 王, 王国民, 肖进文, 聂福平, 陵 袁, 吴东海, 刘生峰, 志 谭, 周启民 申请人:重庆大学, 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心