猪白细胞干扰素冻干粉针剂及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种猪白细胞干扰素冻干粉针剂及其制备方法，所述冻干粉针剂是由猪白细胞干扰素原液和保护剂按20∶4-3的体积比混合冻干制成，原液中包括以下成分：猪白细胞悬液、猪血清、启动干扰素、仙台病毒病毒液和培养液。经原料制备→混和→水浴搅拌诱导培养→离心收获→灭活病毒→解冻除菌→加入保护剂→冻干工序制成。其功能是作为一种广谱抗病毒药物，治疗猪瘟、猪病毒性腹泻、猪病毒性感冒等病毒性疾病。田间控制和推广治疗试验总治愈率为94.57％，人工控制治疗猪瘟和猪病毒性腹泻总治愈率为83.3％和100％。
【专利说明】猪白细胞干扰素冻干粉针剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及猪白细胞干扰素冻干粉针剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]猪病毒性疾病是猪传染病中危害养猪业最严重的疫病，猪病毒性疾病中，尤以猪瘟危害最大，其发病率和病死率都很高，而且无有效的治疗方法。目前，主要以防疫手段控制猪毒性疾病的发生。近年来研究发现，干扰素除了具有抗病毒作用之外，还具有抗肿瘤作用，及对免疫系统的调节作用和抗细胞等一系列的生理活性，但在兽医学领域，动物干扰素未被广泛应用，主要原因在于目前所获得的动物干扰素安全性不高，制备工艺复杂，成本高，售价昂贵，效果不显著，推广受到限制。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种具有广谱抗病毒功效，适用于治疗猪瘟、猪病毒性腹泻、猪病毒性感冒等病毒性疾病的猪白细胞干扰素冻干粉针剂。
[0004]本发明的另一目的是提供上述猪白细胞干扰素冻干粉针剂的制备方法。
[0005]为了实现本发明目的，本发明的一种猪白细胞干扰素冻干粉针剂，所述冻干粉针剂是由猪白细胞干扰素原液和保护剂按20:4-3的体积比混合冻干制成。
[0006]其中，所述猪白细胞干扰素原液包括以下组成成分:猪白细胞悬液、猪血清、启动干扰素、仙台病毒病毒液和培养液；其中，猪血清、仙台病毒病毒液和培养液的体积比为250-350: 350-400: 5000 ;猪白细胞悬液和启动干扰素是加入到培养液中的，每毫升培养液中含有4 X 17-1O X 17个猪白细胞，每毫升培养液中含有50-150单位的干扰素抗病毒活性；
[0007]所述猪白细胞悬液的制备方法为:无菌采集健康猪鲜血，于4°C 3000转/分的无菌条件下离心20分钟，吸取呈灰黄色的中间层白细胞至血浆瓶内，用0.85% NH4Cl处理两次后离心，收集沉淀白细胞，用Hank' s液洗去残余NH4Cl,用培养液将沉淀白细胞稀释成悬液；
[0008]所述猪血清的制备方法为:无菌采集健康猪鲜血，自然析出，用0.2% CaCl2处理血浆，除去其中的纤维蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存备用；
[0009]所述启动干扰素的制备方法为:首次采用人白细胞干扰素作为启动干扰素，以后各次选用前批次效价最高的猪白细胞干扰素作为启动干扰素；
[0010]所述仙台病毒病毒液的制备方法为:于36-38°C受精鸡蛋孵化7-15天后，接种仙台病毒，再孵化65-79小时后，收获病毒液，该病毒液的血凝效价为1: 320-1280,置于-20°C保存备用；
[0011]所述培养液的制备方法为:向粉剂1640中加入蒸馏水配制成1-2%的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的浓度为3%，再加入青链霉素,使1640溶液中青链霉素达100-1000单位/晕升。
[0012]本发明中涉及的保护剂为蔗糖和脱脂牛奶溶于水制成的混合液，蔗糖和脱脂牛奶的浓度分别为0.356kg/L和0.711kg/L。
[0013]本发明还提供所述冻干粉针剂的制备方法，包括以下步骤:
[0014]步骤一、猪白细胞干扰素原液的制备
[0015](I)猪白细胞悬液的制备:无菌采集健康猪鲜血，于4°C 3000转/分的无菌条件下离心20分钟，吸取呈灰黄色的中间层白细胞至血浆瓶内，用0.85% NH4Cl处理两次后离心，收集沉淀白细胞，用Hank' s液洗去残余NH4Cl,用培养液将沉淀白细胞稀释成悬液；
[0016](2)猪血清的制备:无菌采集健康猪鲜血，自然析出，用0.2% CaCl2处理血浆，除去其中的纤维蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存备用；
[0017](3)启动干扰素的制备:首次采用人白细胞干扰素作为启动干扰素，以后各次选用前批次效价最高的猪白细胞干扰素作为启动干扰素；
[0018](4)仙台病毒病毒液的制备:于36_38°C受精鸡蛋孵化7_15天后，接种仙台病毒，再孵化65-79小时后，收获病毒液，该病毒液的血凝效价为1: 320-1280，置于-20°C保存备用;
[0019](5)培养液的制备:向粉剂1640中加入蒸馏水配制成1-2%的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的浓度为3%，再加入青链霉素,使1640溶液中青链霉素达100-1000单位/毫升；
[0020](6)将猪白细胞悬液加入培养液中，使每毫升培养液中含4X 17-1O X 17个猪白细胞，然后向每5000毫升培养液中加入猪血清250-350毫升，再加入启动干扰素，使每毫升培养液中含干扰素抗病毒活性50-150单位，最后加入仙台病毒病毒液，每5000毫升培养液中加入病毒液350-400晕升；
[0021](7)将上述混合液置于水浴搅拌装置中，以60-80转/分的速度搅拌，30°C诱导培养6小时后，再于37°C诱导培养14小时，其中诱导培养2小时后，用5% NaHCO3溶液调pH值7.2-7.4，诱导培养6小时后，再用5% NaHCO3溶液调pH值7.2-7.4，在诱导培养开始的第8小时，5分钟内通入无菌氧0.2升，每隔2小时通一次无菌氧，连续5次；
[0022](8)将上述诱导培养后的液体于4°C，3000转/分无菌条件下离心10_20分钟，收集含干扰素的上清液，用甲醛溶液灭活病毒，上清液中甲醛的终浓度为1%。，然后置于-20°C冻存；
[0023](9)从_20°C解冻后，离心取上清，无菌条件下先用澄清滤器澄清，然后用除菌滤器除菌，即得猪白细胞干扰素原液，于4°C保存；
[0024]步骤二、保护剂的制备
[0025]将蔗糖和脱脂牛奶溶于注射用水配制成混合液，其中，蔗糖和脱脂牛奶的浓度分别为0.356kg/L和0.711kg/L ;用200目纱网过滤，滤液于100°C蒸汽灭菌45min，即得保护剂；
[0026]步骤三、猪白细胞干扰素冻干粉针剂的制备
[0027]将上述制备的猪白细胞干扰素原液和保护剂按20:4-3的体积比混合后冻干，即得猪白细胞干扰素冻干粉针剂，其中水份含量〈4 %。
[0028]冻干操作步骤如下:
[0029]真空冷冻干燥箱预冻至箱内温度_40°C ±2°C，保温210min，抽真空至前后箱压力(10pa，真空度达99%以上；
[0030]升华:第一次升华温度设为_2°C，时间为1380min ；
[0031]第二次升华温度设为28°C，时间为60min ；
[0032]第三次升华温度设为-35°C，时间为120min ；
[0033]第四次升华温度设为48°C，时间为30min ；
[0034]保温:最后保温时间为240min，抽真空前压力上升6.5-7.5pa时，保温结束。
[0035]本发明提供的猪白细胞干扰素冻干粉针剂是一种广谱抗病毒制剂，主治猪瘟、猪病毒性腹泻、猪病毒性感冒等猪病毒性疾病。干扰素的抗病毒作用，不是直接抗病毒，而是与周围的细胞发生反应，并诱导细胞产生抗病毒蛋白，这种蛋白能改变病毒蛋白合成，使新病毒不能装配，病毒繁殖受到抑制，从而起到抗病毒作用，猪白细胞干扰素注射剂注入猪体内后，猪白细胞干扰素对猪病毒性疾病弱毒、强毒均有明显的抑制增殖作用。
[0036]本发明具有以下优点:
[0037](一)将本发明的猪白细胞干扰素冻干粉针剂配制成注射剂后，每毫升注射剂中干扰素的效价高达20000单位左右；
[0038]( 二)本品为冻干粉针剂形式，4_8°C贮存，有效期长达30个月左右；
[0039](三)本品有利于在常温下运输；
[0040](四)有效解决了液体注射剂型中容易出现的蛋白析出现象。
【具体实施方式】
[0041]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0042]实施例1猪白细胞干扰素冻干粉针剂及其制备方法
[0043]本实施例的猪白细胞干扰素冻干粉针剂的制备方法包括以下步骤:
[0044]步骤一、猪白细胞干扰素原液的制备
[0045]1、猪白细胞悬液的制备:无菌采集健康猪鲜血，于4°C 3000转/分的无菌条件下离心20分钟，先抽吸出血浆后，吸取呈灰黄色的中间层白细胞至血浆瓶内，用0.85% NH4Cl处理两次后离心，收集沉淀白细胞，用Hank' s液洗去残余NH4Cl,用培养液将沉淀白细胞稀释成悬液。
[0046]2、猪血清的制备:无菌采集健康猪鲜血，自然析出，用0.2% CaCl2处理血浆，除去其中的纤维蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存备用。
[0047]3、启动干扰素的制备:选用前批次效价最高的猪白细胞干扰素作为启动干扰素。
[0048]4、仙台病毒病毒液的制备:于36°C受精鸡蛋孵化7天后，接种仙台病毒，再孵化65小时后，收获病毒液，该病毒液的血凝效价为1: 320,置于-20°C保存备用。
[0049]5、培养液的制备:向粉剂1640中加入蒸馏水配制成1%的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的浓度为3%，再加入青链霉素，使1640溶液中青链霉素达100单位/晕升。
[0050]6、将猪白细胞悬液加入培养液中，使每毫升培养液中含约4X 17个猪白细胞，然后向每5000晕升培养液中加入猪血清250晕升,再加入启动干扰素，使每晕升培养液中含干扰素抗病毒活性50单位，最后加入仙台病毒病毒液，每5000毫升培养液中加入病毒液350晕升。
[0051]7、将上述混合液置于水浴搅拌装置中，以60-80转/分的速度搅拌，30°C诱导培养6小时后，再于37°C诱导培养14小时，其中诱导培养2小时后，用5% NaHCO3溶液调pH值7.2，诱导培养6小时后，再用5% NaHCO3溶液调pH值7.2，在诱导培养开始的第8小时，5分钟内通入无菌氧0.2升，每隔2小时通一次无菌氧，连续5次。
[0052]8、将上述诱导培养后的液体于4°C，3000转/分无菌条件下离心10分钟，收集含干扰素的上清液，用甲醛溶液灭活病毒，上清液中甲醛的终浓度为1%。，然后置于-20°C冻存。
[0053]9、从-20°C解冻后，离心取上清，无菌条件下先用澄清滤器澄清，然后用除菌滤器除菌，即得猪白细胞干扰素原液，于4°C保存。
[0054]步骤二、保护剂的制备
[0055]将蔗糖和脱脂牛奶溶于注射用水配制成混合液，其中，蔗糖和脱脂牛奶的浓度分别为0.356kg/L和0.711kg/L ;用200目纱网过滤，滤液于100°C蒸汽灭菌45min，即得保护剂。
[0056]步骤三、猪白细胞干扰素冻干粉针剂的制备
[0057]将上述制备的猪白细胞干扰素原液和保护剂按5:1的体积比混合后冻干，即得猪白细胞干扰素冻干粉针剂，其中水份含量〈4%。
[0058]冻干操作步骤如下:
[0059](I)真空冷冻干燥箱预冻至箱内温度_40°C ±2°C，保温210min，抽真空至前后箱压力< 10pa，真空度达99%以上。
[0060](2)升华:第一次升华温度设为-2 V，时间为1380min ；
[0061]第二次升华温度设为28°C，时间为60min ；
[0062]第三次升华温度设为-35°C，时间为120min ；
[0063]第四次升华温度设为48°C，时间为30min。
[0064](3)保温:最后保温时间为240min，抽真空前压力上升6.5-7.5pa时，保温结束。
[0065]将上述制备的猪白细胞干扰素冻干粉针剂配制成注射剂后，每毫升注射剂中干扰素的效价约20000单位，4-8°C贮存有效期为30个月。
[0066]实施例2猪白细胞干扰素冻干粉针剂及其制备方法
[0067]本实施例的猪白细胞干扰素冻干粉针剂的制备方法包括以下步骤:
[0068]步骤一、猪白细胞干扰素原液的制备
[0069]1、猪白细胞悬液的制备:无菌采集健康猪鲜血，于4°C 3000转/分的无菌条件下离心20分钟，先抽吸出血浆后，吸取呈灰黄色的中间层白细胞至血浆瓶内，用0.85% NH4Cl处理两次后离心，收集沉淀白细胞，用Hank' s液洗去残余NH4Cl,用培养液将沉淀白细胞稀释成悬液。
[0070]2、猪血清的制备:无菌采集健康猪鲜血，自然析出，用0.2% CaCl2处理血浆，除去其中的纤维蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存备用。
[0071]3、启动干扰素的制备:选用前批次效价最高的猪白细胞干扰素作为启动干扰素。
[0072]4、仙台病毒病毒液的制备:于38°C受精鸡蛋孵化15天后，接种仙台病毒，再孵化79小时后,收获病毒液,该病毒液的血凝效价为1: 1280,置于-20°C保存备用。
[0073]5、培养液的制备:向粉剂1640中加入蒸馏水配制成2 %的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的浓度为3%，再加入青链霉素，使1640溶液中青链霉素达1000单位/毫升。
[0074]6、将猪白细胞悬液加入培养液中，使每毫升培养液中含约1X 17个猪白细胞，然后向每5000晕升培养液中加入猪血清350晕升,再加入启动干扰素，使每晕升培养液中含干扰素抗病毒活性150单位，最后加入仙台病毒病毒液，每5000毫升培养液中加入病毒液400毫升。
[0075]7、将上述混合液置于水浴搅拌装置中，以60-80转/分的速度搅拌，30°C诱导培养6小时后，再于37°C诱导培养14小时，其中诱导培养2小时后，用5% NaHCO3溶液调pH值
7.4，诱导培养6小时后，再用5% NaHCO3溶液调pH值7.4，在诱导培养开始的第8小时，5分钟通入无菌氧0.2升，每隔2小时通一次无菌氧，连续5次。
[0076]8、将上述诱导培养后的液体于4°C，3000转/分无菌条件下离心10分钟，收集含干扰素的上清液，用甲醛溶液灭活病毒，上清液中甲醛的终浓度为1%。，然后置于-20°C冻存。
[0077]9、从-20°C解冻后，离心取上清，无菌条件下先用澄清滤器澄清，然后用除菌滤器除菌，即得猪白细胞干扰素原液，于4°C保存。
[0078]步骤二、保护剂的制备
[0079]将蔗糖和脱脂牛奶溶于注射用水配制成混合液，其中，蔗糖和脱脂牛奶的浓度分别为0.356kg/L和0.711kg/L ;用200目纱网过滤，滤液于100°C蒸汽灭菌45min,即得保护剂。
[0080]步骤三、猪白细胞干扰素冻干粉针剂的制备
[0081]将上述制备的猪白细胞干扰素原液和保护剂按20:3的体积比混合后冻干，即得猪白细胞干扰素冻干粉针剂，其中水份含量〈4 %。
[0082]冻干操作步骤同实施例1。
[0083]将上述制备的猪白细胞干扰素冻干粉针剂配制成注射剂后，每毫升注射剂中干扰素的效价约20000单位，4-8°C贮存有效期为30个月。
[0084]实施例1和2中制备的猪白细胞干扰素冻干粉针剂是一种广谱抗病毒制剂，主治猪瘟、猪病毒性腹泻、猪病毒性感冒等猪病毒性疾病，效果显著，无毒副反应。本品可与抗菌类药物同时使用。
[0085]用法用量:冻干粉针剂配制成注射剂后，进行肌肉注射，按猪体重用药，每20公斤每天注射10000单位，每天注射一次，病重者加量使用，或遵医嘱，连续使用3-5天为一个疗程。
[0086]实施例3田间控制治疗试验和田间推广治疗试验
[0087]实施例1中制备的猪白细胞干扰素冻干粉针剂作为一种广谱抗病毒药物，对治疗猪病毒性疾病疗效显著，共治疗病毒性疾病病例9843例(表I)。
[0088]表I本发明的猪白细胞干扰素冻干粉针剂治疗猪病毒性疾病的疗效
[0089]
疗效例数治愈率
【权利要求】
1.猪白细胞干扰素冻干粉针剂，其特征在于，所述冻干粉针剂是由猪白细胞干扰素原液和保护剂按20:4-3的体积比混合冻干制成； 其中，所述猪白细胞干扰素原液包括以下组成成分:猪白细胞悬液、猪血清、启动干扰素、仙台病毒病毒液和培养液；其中，猪血清、仙台病毒病毒液和培养液的体积比为.250-350: 350-400: 5000 ;猪白细胞悬液和启动干扰素是加入到培养液中的，每毫升培养液中含有4 X 17-1O X 17个猪白细胞，每毫升培养液中含有50-150单位的干扰素抗病毒活性； 所述猪白细胞悬液的制备方法为:无菌采集健康猪鲜血，于4°C 3000转/分的无菌条件下离心20分钟，吸取呈灰黄色的中间层白细胞至血浆瓶内，用0.85% NH4Cl处理两次后离心，收集沉淀白细胞，用Hank' s液洗去残余NH4Cl,用培养液将沉淀白细胞稀释成悬液； 所述猪血清的制备方法为:无菌采集健康猪鲜血，自然析出，用0.2% CaCl2处理血浆，除去其中的纤维蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存备用； 所述启动干扰素的制备方法为:首次采用人白细胞干扰素作为启动干扰素，以后各次选用前批次效价最高的猪白细胞干扰素作为启动干扰素； 所述仙台病毒病毒液的制备方法为:于36-38°C受精鸡蛋孵化7-15天后，接种仙台病毒，再孵化65-79小时后，收获病毒液,该病毒液的血凝效价为1: 320-1280,置于-20°C保存备用； 所述培养液的制备方法为:向粉剂1640中加入蒸馏水配制成1-2%的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的浓度为3%，再加入青链霉素,使1640溶液中青链霉素达100-1000单位/晕升； 所述保护剂为蔗糖和脱脂牛奶溶于水制成的混合液，蔗糖和脱脂牛奶的浓度分别为.0.356kg/L 和 0.711kg/L。
2.权利要求1所述冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一、猪白细胞干扰素原液的制备 (1)猪白细胞悬液的制备:无菌采集健康猪鲜血，于4°C3000转/分的无菌条件下离心.20分钟，吸取呈灰黄色的中间层白细胞至血浆瓶内，用0.85% NH4Cl处理两次后离心，收集沉淀白细胞，用Hank' s液洗去残余NH4Cl,用培养液将沉淀白细胞稀释成悬液； (2)猪血清的制备:无菌采集健康猪鲜血，自然析出，用0.2% CaCl2处理血浆，除去其中的纤维蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存备用； (3)启动干扰素的制备:首次采用人白细胞干扰素作为启动干扰素，以后各次选用前批次效价最高的猪白细胞干扰素作为启动干扰素； (4)仙台病毒病毒液的制备:于36-38°C受精鸡蛋孵化7-15天后，接种仙台病毒，再孵化65-79小时后，收获病毒液，该病毒液的血凝效价为1: 320-1280，置于-20°C保存备用； (5)培养液的制备:向粉剂1640中加入蒸馏水配制成1-2%的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的浓度为3%，再加入青链霉素，使1640溶液中青链霉素达.100-1000单位/毫升； (6)将猪白细胞悬液加入培养液中，使每毫升培养液中含4X 17-1O X 17个猪白细胞，然后向每5000晕升培养液中加入猪血清250-350晕升,再加入启动干扰素，使每晕升培养液中含干扰素抗病毒活性50-150单位，最后加入仙台病毒病毒液，每5000毫升培养液中加入病毒液350-400晕升； (7)将上述混合液置于水浴搅拌装置中，以60-80转/分的速度搅拌，30°C诱导培养6小时后，再于37°C诱导培养14小时，其中诱导培养2小时后，用5% NaHCO3溶液调pH值.7.2-7.4，诱导培养6小时后，再用5% NaHCO3溶液调pH值7.2-7.4，在诱导培养开始的第8小时，5分钟内通入无菌氧0.2升，每隔2小时通一次无菌氧，连续5次； (8)将上述诱导培养后的液体于4°C，3000转/分无菌条件下离心10-20分钟，收集含干扰素的上清液，用甲醛溶液灭活病毒，上清液中甲醛的终浓度为1%。，然后置于-20°C冻存； (9)从-20°C解冻后，离心取上清，无菌条件下先用澄清滤器澄清，然后用除菌滤器除菌，即得猪白细胞干扰素原液，于4°C保存； 步骤二、保护剂的制备 将蔗糖和脱脂牛奶溶于注射用水配制成混合液，其中，蔗糖和脱脂牛奶的浓度分别为.0.356kg/L和0.711kg/L ;用200目纱网过滤，滤液于100°C蒸汽灭菌45min，即得保护剂； 步骤三、猪白细胞干扰素冻干粉针剂的制备 将上述制备的猪白细胞干扰素原液和保护剂按20:4-3的体积比混合后冻干，即得猪白细胞干扰素冻干粉针剂，其中水份含量〈4% ； 冻干操作步骤如下: 真空冷冻干燥箱预冻至箱内温度_40°C ±2°C，保温210min，抽真空至前后箱压力(10pa，真空度达99%以上； 升华:第一次升华温度设为_2°C，时间为1380min ； 第二次升华温度设为28°C，时间为60min ； 第三次升华温度设为_35°C，时间为120min ； 第四次升华温度设为48°C，时间为30min ； 保温:最后保温时间为240min，抽真空前压力上升6.5-7.5pa时，保温结束。
【文档编号】A61K38/21GK104162149SQ201410367679
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】荣政 申请人:四川世红生物技术有限公司