诊断和治疗方法

诊断和治疗方法
【专利摘要】本发明涉及治疗或预防甲状腺素运载蛋白淀粉状变性的方法，用于所述治疗或预防的药物组合物，以及诊断方法和试剂盒。
【专利说明】诊断和治疗方法
发明领域
[0001]本发明涉及治疗或预防甲状腺素运载蛋白淀粉状变性的方法，用于所述治疗或预防的药物组合物，以及诊断方法和试剂盒。
[0002]发明背景
[0003]甲状腺素运载蛋白(TTR)是由4个14kDa的亚基组成的功能性血浆蛋白。TTR主要由肝脏合成，作为视黄醇和甲状腺素的转运蛋白发挥功能。除了它的生理学功能外，还发现TTR是若干种不同临床形式的淀粉状变性中的淀粉状蛋白原纤维的主要成分，包括家族性淀粉样多神经病(FAP)、家族性心脏淀粉状变性和散发的老年全身性淀粉状变性(SSA)。SSA是由于野生型(WT) TTR原纤维选择性沉积在心脏组织中导致的，影响几乎25%的80岁以上群体。
[0004]已经关联了约100种TTR的氨基酸突变与TTR淀粉状变性的家族性形式。研究显示:TTR通过由四聚体去稳定化起始的过程，形成淀粉状蛋白。去稳定化导致单体积累，后者可以错误折叠并聚集成原纤维结构。已投入了大量精力研究与疾病的家族性形式相关的TTR突变的淀粉状蛋白生成，但大部分TTR相关的淀粉状变性表现为由其他情况下稳定的WT蛋白质的聚集和沉积导致的散发病例。
[0005]硫酸乙酰肝素(HS)—由重复的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸单元组成的硫酸化多糖，与多种淀粉状变性中淀粉样沉积相关。虽然不断积累的证据提示HS在淀粉样沉积中发挥重要的作用，但仍未明确HS在淀粉状变性的病理学中的确切作用。
[0006]因此，本领域仍然需要详细阐述HS在TTR淀粉状变性中的作用，以及开发其药物。
[0007]发明简述
[0008]本发明是基于这样的研究，其中通过免疫组化染色检测到HS与TTR在心肌病心脏中的共沉积。体外研究揭示，HS和肝素促进了 TTR原纤维生成，这是与多糖硫酸化程度相关的效应，并通过TTR上的特异性结合序列实现。在表达人TTR的果蝇(Drosophila)模型中进一步检验了该促进效应。因此，TTR与肝素/ HS的相互作用是尺寸依赖性和选择性的，对具有更高程度硫酸化的多糖是优先的。
[0009]本发明提供了诊断TTR淀粉状变性的方法。方法包括步骤:(a)提供人对象的体液样品，(b)确定所述体液中的TTR浓度，(c)如果步骤(b)中的确定的TTR浓度高于对照样品，则确定所述人对象患有TTR淀粉状变性或处于发展TTR淀粉状变性的高风险。
[0010]本发明还提供了用于上述诊断方法的试剂盒，其包含抗TTR抗体，和用于检测体液样品中的TTR表达水平的一种或多种试剂。
[0011]本发明还提供了预防、减轻和/或治疗有需要的患者中的甲状腺素运载蛋白(TTR)淀粉状变性的方法，通过施用有效量的能够干扰TTR和硫酸乙酰肝素(HS)相互作用的活性剂。
[0012]此外，本发明涉及能够干扰HS和TTR之间的相互作用的活性剂的医药用途，用于预防、减轻和/或治疗TTR淀粉状变性。
[0013]本发明还提供了药物组合物，包含能够干扰HS和TTR之间的相互作用的活性剂，和可药用的载体。
[0014]所附权利要求中提出了本发明的具体实施方案。
[0015]本发明的其他目标、实施方案、细节和优点根据下列附图、详细说明和实施例是显而易见的。
[0016]附图简述
[0017]在下文中，本发明参考附图，通过优选的实施方案作出更详细的描述，其中:
[0018]图1显示了显微镜图像，证实TTR淀粉状蛋白和HS在心肌病心脏中的共定位。用刚果红对来自报道患有心肌病的70岁患者的心肌切片(15i!m厚)染色，在偏振光下观察该切片(A);相邻的切片用阿辛蓝染色(B)。(A)和⑶中的箭头表示相邻的位置。其他切片用抗TTR的抗体(C)和抗HS抗体⑶双免疫染色。荧光通道(A)和⑶的合并显示了患者标本中重叠的TTR和HS的阳性信号(E)，和年龄匹配的对照对象中的TTR的阴性染色(F)。DAPI对细胞核进行复染(蓝)。原始放大倍数:A-F:200X,比例尺:50 u M。
[0019]图2证实了野生型TTR的pH依赖性原纤维化。将TTR(50 u M)溶解在所示pH值的磷酸-柠檬酸缓冲液中，并在37°C温育48h。在温育后，使用ThT荧光分析样品的原纤维含量(A)。仅在pH2.7中温育的样品中检测到原纤维形成，形成量(200AU)明显小于在存在肝素条件下相同PH温育的样品(8000AU ;图3A)。在上述相同的条件下温育TTR(500 u M)，通过天然PAGE分析(B)。迁移到凝胶底部的强条带表示单体和二聚体。
[0020]图3显示了肝素和HS对WT TTR聚集的作用。(A，B)在37°C，单独温育，或与不同的肝素或HS (12 u M)温育溶解在磷酸盐缓冲液(50 u M，pH2.7)中的TTR48h。在温育后，将样品与ThT混合，并测量荧光。显示的数据代表3次重复的实验(平均值土SEM)。(C)用方法所述的天然-PAGE分析在相同条件下与肝素(0、5或20 ii M)温育的TTR(500 u M)。凝胶显示了与或不与肝素温育的TTR的不同的迁移模式。未显示在浓缩胶中迁移的原纤维。(D)显微镜分析与肝素温育后的TTR。将样品点在玻璃上，用刚果红染色。在荧光(原始放大倍数:20X ;比例尺:5iiM)和偏振光(嵌入图)下采集图像 。
[0021]图4证实了肝素整合到TTR原纤维中。在37°C，与肝素(3H-标记和未标记的混合物)共温育溶解在磷酸盐缓冲液(PH2.7)中的TTR48h。(A)用非变性PAGE分离TTR-肝素共温育样品和单独的肝素，并用阿辛蓝染色。(B)在上述非变性PAGE上分离相同组合的样品，将每条道切成6片(如A所示)。在H2O中温育凝胶切片2hr，提取肝素。通过闪烁计数测量放射性。
[0022]图5显示了对与预聚集的TTR温育的肝素分析。在不含肝素的条件下，37°C温育溶解在磷酸盐缓冲液(PH2.7)中的TTR48h。然后，加入肝素(3H-标记和未标记的混合物)，再在37°C温育TTR-肝素样品I小时。之后，通过非变性PAGE分离样品，将凝胶切成6片，如图4A所示。通过闪烁计数测量每个切片的放射性。数据代表重复3次的实验(平均值士 SEM)。
[0023]图6证实了 HS /肝素在温和酸性条件下结合TTR。⑷将溶解的TTR固定在Biacore传感器芯片上，使肝素(IOyM)与固定的TTR在中性或温和酸性条件下相互作用。(B)监控在不同pH下HS II(IOuM)与TTR的结合，每个样品的响应表示为响应单位(RU)。重复实验3次，图像显示了有代表性的结果。(C)通过ThT荧光分析在pH5.0或pH7.4与肝素或HS II温育7天的TTR(50 u M)。数据代表重复3次的实验(平均值土SEM)。[0024]图7证实了硫酸乙酰肝素(HS)和肝素与TTR的结合亲和力。将解离的TTR固定在Biacore传感器芯片上。在表面注射浓度梯度(范围在0.001-70 u M)的肝素(A)、HS II (B)或HS I(C)，pH5.0。在曲线的稳态区测量每个浓度的响应。通过绘制每个浓度的稳态响应vs肝素/ HS浓度，计算表观平衡解离常数(KD)。用等式:响应=(Rmax*C) / (KD+C)来拟合数据，其中C是肝素/ HS的浓度。测试两种分析物流速(20和30iU / min)，评估系统中潜在的质量运输限制效应。改变流速对获得的KD值没有显著的影响，提示质量运输效应不是测定中的限制因素。展示的值是三次独立实验的平均值。(D)在固定了解离型TTR的表面注射硫磺素(Thioflavin) T (50 PM)未导致任何结合。相反，在固定了聚集型TTR的表面注射硫磺素T揭示了显著的结合。
[0025]图8证实了在TTR中鉴别HS /肝素结合序列。(A)标注TTR氨基酸序列中的组氨酸“ (+) ”和其他碱性氨基酸“ + ”。(B)在pH5.0，温育等摩尔的TTR-肽或全长蛋白质(有或无酸解离)和3H-标记的肝素(1500cpm)。使用硝酸纤维素滤纸捕获方法，分析与肽结合的3H-标记的肝素的量。
[0026]图9显示了与肝素结合的TTR肽的SPR分析。使用表面硫醇偶联试剂盒(GEHealthcare)将肝素固定在Biacore传感器芯片(CM5)上。在pH5.0 (肽浓度25 ii g / ml ；流速20iU / min)，使源自TTR序列上含有组氨酸残基(24_35、51_61和84-94)的区域(图5A)的肽与肝素表面相互作用。与硝酸纤维素滤纸结合测定的分析结果(图5B) —致，仅aa24-35的肽与肝素相互作用(红)。
[0027]图10显示了与天然TTR降低的HS结合活性。(A)将等量的解离型或天然蛋白质固定在Biacore传感器芯片上，在pH5.0，允许HSII与固定的TTR相互作用。(B)使用3个具有不同配体密度(250-3000RU)的芯片的重复实验，获得HS I1-TTR相互作用信号的值。根据1000RU的配体密度将信号归一化，显示了平均值。通过t检验进行统计学分析。
[0028]图11显示了 HS对细胞培养中TTR原纤维形成的作用。向WT (CHO-WT)和HS-缺陷型(CHO-pgsD-677)细胞中加入解离型TTR，培养48hr。(A)在用PBS充分洗涤后，在1%NaOH中裂解细胞，提取细胞关联型TTR原纤维。裂解材料与ThT混合，测量荧光。值代表重复3次的实验(平均值士 SEM)。通过t检验进行统计学分析。(B)固定细胞，并用抗TTR抗体(HPA002550 ;绿色)免疫染色。DAPI复染显示为蓝色。原始放大倍数:20X，比例尺:20 u M0
[0029]图12显示了肝素对体内的TTR原纤维形成的作用。(A)在常规培养基(对照)或补充了低分子量肝素(K丨exane?)或肝素的培养基上培养TTR转基因蝇的卵。在羽化后9-17天，收集头部并在盐水中裂解。通过ThT染色分析提取物。值代表重复2次的实验的平均值。(B)用斑点印迹染色的阿辛蓝，分析果蝇头部裂解物中的肝素存在。使用肝素(25ng和50ng)作为阳性对照。将25微升裂解物(将相同样品用于ThT分析)用于尼龙膜(Hybond N+,GE Healthcare)，并用阿辛蓝染色(溶解在25%异丙醇和3%醋酸中的0.5%阿辛蓝)。
[0030]图13证实了天然TTR上的肝素/ HS结合结构域。PyMol程序(PDB登录号1DVQ，
(I))生成的TTR 二聚体模型显示了天然TTR上的肝素/ HS结合位点。品红标记了该结构域中的碱性氨基酸簇(31-HVFRK-35)，该氨基酸簇预期对TTR-肝素/ HS结合是关键的。结合位点部分包埋在天然TTR四聚体形式的结构中，为天然TTR的低HS结合活性提供了合理解释。
[0031]图14示例了从果蝇头部制备的冷冻切片的共聚焦显微镜分析，在TTR转基因蝇(A-G)中检测到的肝素-TTR共定位。(A)用DAPI (蓝色)染色的果蝇头部的概况图像，显示了脑(Br)、视叶(01)和视网膜(Re)。用抗TTR抗体(红色)染色从培养在标准培养基(B)或补充肝素的培养基(C)上的转基因蝇制备的切片。(D)用抗TTR抗体(红色)和抗肝素抗体(绿色)染色从培养在补充肝素的培养基上的转基因蝇制备的切片。在视网膜中观察到TTR和肝素的共沉积。(E)通过⑶中标记区域的z-stack，生成放大的3D图像，显示TTR和肝素的合并染色。(F)从饲养在常规培养基上的转基因蝇制备的切片的对于TTR和肝素染色，和(G)饲养在补充了肝素的培养基上的非转基因蝇的切片的对于TTR和肝素染色。原始放大倍数=AlOX ;B、C20X ;D-G63X。标出了比例尺。
[0032]图15示例了肝素/ HS对TTR聚集的作用。(A)四聚体去稳定化(受酸性条件促进)导致单体形成，其上暴露出肝素/ HS结合结构域。温和的酸性条件有利于TTR与肝素结合，为促进原纤维形成提供了支架。(B)心脏组织中的TTR淀粉状变性的假定机制。相比更年轻个体(右)中的正常HS结构，衰老心脏(左)中的HS结构的可能改变(硫酸化程度增加)可促进TTR-HS相互作用，导致TTR在心脏中与衰老相关的聚集和沉积。
[0033]图16证实了针对TTR的aa24_35产生的抗体是特异性针对单体型(即，解离型)的TTR，而不针对四聚体(即，天然型)TTR。
[0034]图17证实了抗体识别天然TTR的肽24_35，但不识别其变性形式。图还显示了抗体识别人血浆中的TTR。
[0035]图18示例了 HS对细胞培养中的TTR内化的作用。向WT (CHO-WT)和HS-缺陷型(CHO-pgsD-677)细胞中加入解离型TTR(5 iiM)，并在F12饥饿培养基(Gibco)中培养48hr。用抗TTR抗体(浅灰)染色细胞和DAPI染色核。(a)发现TTR-阳性信号与CHO-WT细胞的核相关。(b)对图a中的标记区域的放大图像。(c)CHO-pgsD-677细胞无TTR染色。用荧光显微镜捕获图像。原始放大倍数:40x。标出了比例尺。
[0036]图19示例了可以在野生型细胞的核内检测到的解离型TTR的快速内化。向WT (CHO-WT)和HS-缺陷型(CHO-pgsD-677)细胞中加入解离型TTR(5 y M)，并在F12饥饿培养基(Gibco)中培养1.5hr。用抗TTR抗体(浅灰)染色细胞和DAPI染色核。(a)在CHO-WT细胞的核周区观察到TTR。(b)对图a中的标记区域的放大图像。(c)对图b中的标记区域采集厚度I y m的共聚焦Z-扫描图像。使用Imaris Bitplane成像软件,将图像加工成3D模型。(d) CHO-pgsD-677细胞无TTR染色。用共聚焦扫描的荧光显微镜捕获图像。原始放大倍数:20x。标出了比例尺。
[0037]图20示例了聚集型TTR与野生型细胞相关。向WT (CHO-WT)和HS-缺陷型(CHO-pgsD-677)细胞中加入解离型TTR(5iiM)，并在F12饥饿培养基(Gibco)中培养
1.5hr。用抗TTR抗体(圆圈区域)染色细胞，并用DAPI染色核。(a)与聚集型TTR温育的CHO-WT细胞的代表性图像。(b)对图a中的标记区域的放大图像。(c)CHO-pgsD-677细胞无TTR染色。用共聚焦扫描的荧光显微镜捕获图像。原始放大倍数:20x。标出了比例尺。
[0038]图21证实了肝素与聚集型TTR结合。将重组的野生型TTR(500 U M)溶解在磷酸盐缓冲液(PH7.4或2.7)中，并在37°C温育所示的时间段。(a)用天然PAGE分析温育样品的聚集程度。(b)样品在室温与3H-标记的肝素温育30min。通过硝酸纤维素滤纸捕获方法，分析与具有不同聚集程度的样品结合的肝素的量。
[0039]发明详述
[0040]本发明基于这样的研究，所述研究的目的是确定肝素/硫酸乙酰肝素(HS)是否在甲状腺素运载蛋白(TTR)-相关的淀粉状变性的病理发生中发挥作用。
[0041]对诊断为淀粉样心肌病的患者的心脏标本的免疫组化检验揭示了实质性的HS积累和TTR淀粉样沉积(图1)，但一些TTR阳性信号不与HS重叠，这些信号大部分是在血管壁中的。高度HS-TTR共定位的这一发现促使我们探讨HS在TTR淀粉状变性中的潜在功能。为了解决这一问题，在体外和体内实验中使用重组的人WT TTR,来评估在缺少或存在肝素/ HS条件下的聚集作用。
[0042]已确定的是，TTR聚集/淀粉状变性由天然四聚体的解离起始，解离生成不稳定的单体，后者自发形成寡聚体。与更早期的报道一致，我们通过凝胶电泳分析，验证了在PH2.7下温育时重组WT TTR的解离。通过ThT荧光染色，定量淀粉状蛋白质样原纤维的形成，并通过非变性PAGE评估了寡聚体的形成。我们发现，在pH2.7中37°C温育48h，使WT TTR自发的聚集至一定程度，而在较高PH下则不自发聚集(图2)。然而，在温和的酸性条件下延长温育导致TTR聚集(图6C)，提示了在不同的pH条件下改变的TTR聚集动力学。不受任何理论约束，这可以反映体内状态，其中心肌病心脏中重复的氧供应短缺提供了可有利于TTR聚集的酸化环境。
[0043]添加肝素极大的促进了 pH2.7和5.0时的TTR原纤维化，肝素是常用的HS类似物(图3A和6C)。显著地，非变性PAGE分析证实，包括肝素导致了有差异的TTR聚集模式。保持在凝胶顶部的显著量的大分子反映了寡聚体的减少或缺失(图3C)。可能是肝素改变了单体/寡聚体原纤维装配的速率，或重新定位了聚集通路。
[0044]肝素整合在TTR原纤维中的发现(图4)提示了 HS /肝素可以发挥支架作用，其“集合”错误折叠的TTR单体，并被掺入到原纤维中。不受任何理论约束，可以反映体内的TTR-HS聚集，其中，细胞表面上的或胞外基质中的HS可作为支架/催化剂发挥作用，促进未折叠TTR单体的积累和聚集。图15中的方案示例了该HS介导的TTR原纤维化作用的假设。
[0045]HS还促进TTR原纤维生成，但比肝素的程度低(图3A和3B)，与近期的报道一致。令人感兴趣的是，HS的促进能力与硫酸化程度相关。含有5%三硫酸化二糖的HS I对TTR聚集具有边际效应，而含有45%三硫酸化组分的高度硫酸化的HS II对TTR聚集具有更强的效应。比较TTR与肝素或两种HS制品的结合，揭示了亲和力的差异与硫酸化程度相关。与HS II相比，针对肝素TTR表现出高10倍的亲和力，与低硫酸化HS I相比则表现出高1000倍的亲和力(图7)。然而，之前的结果显示，硫酸软骨素不能促进淀粉状蛋白肽的聚集，提示HS的精细结构对所述效应而言也是重要的。
[0046]有趣的是，已报道过HS硫酸化的程度是年龄依赖性的，发现老年个体的主动脉中的HS比年轻对象的HS更加硫酸化。与此同时，在所有的80岁以上的研究对象中，都发现了淀粉状蛋白的主动脉沉积。这可提示HS硫酸化的年龄依赖性改变与主动脉淀粉状变性的相关性。但仍然需要确定老年心脏中WT TTR淀粉状变性的高发生率是否与HS结构的类似改变相关。
[0047]一个长期未解决的问题是WT TTR为什么形成淀粉状蛋白，尽管其表现出良好的热动力学稳定性。出于该目的，本发明的结果显示WT TTR的aa24-35序列与肝素有效结合，这可能提供了一种解释。在TTR的天然类型中，该肽是隐蔽的(图13)，不能与HS相互作用。当蛋白质是解离型时，序列暴露，促进了与HS相互作用。具有紧密相邻的3个碱性氨基酸(31-HVFRK-35)的肽的基础特性通过静电相互作用容纳与带负电的HS /肝素结合。这是令人感兴趣的，因为针对其他淀粉状蛋白肽也鉴别出相似的HS /肝素结合基序，所述其它淀粉状蛋白肽如淀粉状蛋白(13-HHQK-16)和血清淀粉状蛋白A(34-KYFHARGN-41)。
[0048]此外，发现肝素与WT肽(aa24_35)的结合好于与含有V30M突变(与家族性淀粉样多神经病相关)(图8B)的相应肽的结合，这一发现为迄今为止尚未解释的清楚现象提示了潜在的机制，所述现象即V30M突变体和WT TTR表现出组织特异性沉积的差异。应该进一步探讨该不同的沉积模式是否与WT V.s突变体TTR的HS结合特性相关。检验来自WT和V30M TTR的淀粉样沉积物的HS结构对于建立TTR沉积与组织特异性HS表达之间的相关性是有价值的。
[0049]此外，我们想知道能否在细胞模型中复制HS /肝素对TTR原纤维化的效应。温育TTR和表达HS的WT CHO细胞生成了显著量的淀粉状蛋白样原纤维；与之相比，HS-缺陷型CHO-pgsD-677细胞仅产生了少量的原纤维(图11)。该结果与CHO-WT细胞中的强TTR免疫染色组合，明确证实了细胞的HS在TTR原纤维化中的潜在作用。在表达淀粉状蛋白生成性TTR的果蝇模型中进一步证实了这一效应。用肝素饲喂动物促进了 TTR淀粉状蛋白样原
纤维的形成，而在用肝素片段(Klexane?)饲喂的蝇中未观察到该结果。相应的，用抗TTR和HS的抗体免疫组化染色验证了 TTR和肝素的共沉积。
[0050]应该注意的是，18-mer肝素片段(Mr:4, 500Da)比全长肝素更好的促进体外TTR聚集(图3A)，而Klexane? (平均Mr:4，500Da)不能在体内促进TTR原纤维化。不受任何理论约束，这一明显的矛盾可能是由于Klexane?的分子异质性。制品中的较小片段可能已经干扰蝇类模型中的TTR聚集；而体外实验中使用的肝素18-mer是均质的制品。实际上，低分子量肝素和肝素样片段之前已表现出抑制SAA和淀粉状蛋白肽的淀粉状蛋白生成。这增加了最佳大小的肝素能够干扰TTR-HS相互作用的可能性，并减弱TTR聚集。
[0051]所述发现提示，HS在调控TTR代谢中可能具有双重作用。细胞(如巨噬细胞)表面上表达的HS促进了单体类型的TTR内化，阻止了它的聚集(图19);胞外基质上表达的HS则可能作为支架发挥功能以转移形成的毒性寡聚体至更稳定的原纤维(图20)。
[0052]总而言之，关于WT TTR原纤维化中的原淀粉状蛋白生成因子的信息是稀缺的。因为大部分TTR相关的淀粉状变性是由WT TTR沉积导致的散发案例，对WT TTR沉积的病理学机制的理解对于预防和治疗SSA是有价值的。我们的数据为HS与WT TTR在心肌病心脏中的共沉积提供了第一手证据，并通过与TTR的特定结构域的选择性结合，示例了 HS /肝素在TTR聚集中的原淀粉状蛋白生成作用。结果提示了 HS影响老年群体的心脏中的TTR聚集/淀粉状变性的潜在机制。所述发现与涉及其他淀粉状蛋白前体的报道相符，集合起来可以帮助设计用于淀粉状蛋白相关疾病的潜在治疗剂。
[0053]基于上述发现，通过干扰HS与TTR的相互作用，可以预防、减轻、缓解和/或治疗TTR淀粉状变性，包括但不限于家族性淀粉样多神经病(FAP)、家族性心脏淀粉状变性和散发的老年全身性淀粉状变性(SSA)。可以通过向需要这类预防、减轻、缓解和/或治疗的人患者施用具有干扰HS与TTR之间的相互作用的能力的、有效量的HS /肝素来源片段或模拟物、TTR来源肽或修饰肽、或抗TTR抗体来实现。
[0054]能够干扰HS与TTR之间的相互作用的活性剂的“有效量”意指至少缓解TTR的有害效应的水平。换言之，这类活性剂的有效量是足以阻断或部分阻断HS与TTR结合的量，其中这类结合是有害的或不想要的。治疗淀粉状变性的临床领域的普通技术人员可以容易的确定能够干扰HS与TTR之间的相互作用的活性剂施用的量或方案。一般而言，这类干扰剂的剂量将根据以下考虑而改变，例如:待被治疗患者的年龄、性别和总体健康；同时治疗的种类(如果有的话)；治疗频率和所需效应的性质；组织损坏程度；症状的持续期；和待被个体医生调整的其他变量。可以在一次或多次应用中施用理想的剂量，获得理想的结果。
[0055]可以将干扰HS和TTR的物理相互作用的活性剂配制成药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种可药用的载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物以单位剂型(dosage form)提供。
[0056]可以通过多种途径施用本发明的药物组合物，包括但不限于口服递送、静脉内、腹膜内、皮下、透皮、局部或局限施用。
[0057]出于肠胃外或局部施用的目的，可以将药物组合物配制成例如溶液剂、混悬剂或乳剂。需要时，制剂可以包含无菌的含水或不含水溶剂、共溶剂、增溶剂、分散剂或湿润剂、助悬剂和/或增粘剂。在一些实施方案中，将干扰HS与TTR之间的相互作用的活性剂溶解在用于注射的无菌水中，优选将PH调节至约6-8，优选将溶液调节为等渗。
[0058]在一些实施方案中，可以以浓缩形式或根据需要待被重构的粉末形式提供药物组合物。在冻干的情况下，某些冷冻保护剂是优选的，包括聚合物(聚维酮、聚乙二醇、葡聚糖)、糖(蔗糖、葡萄糖、乳糖)、氨基酸(甘氨酸、精氨酸、谷氨酸)和白蛋白。如果向包装中添加用于重构的溶液，所述溶液可以由例如用于注射的纯水、或氯化钠溶液、或右旋糖或葡萄糖溶液组成。
[0059]用于口服施用的固体剂量形式包括胶囊剂、片剂、丸剂、口含片、锭剂、散剂和颗粒齐U。在这类固体剂型中，可以将活性化合物与至少一种惰性稀释剂混合，例如蔗糖、乳糖或淀粉。如正常实践中的，这类剂型还可以包含药物辅料物质，例如硬脂酸润滑剂35或矫味齐U。还可以用肠包衣或其他包衣制备固体口服制品，所述包衣调节了活性成分的释放。
[0060]用于口服施用的液体剂型包括可药用的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂，其含有本领域常用的惰性无毒稀释剂，如水和醇。这类组合物还可包括辅料，例如湿润剂、缓冲剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂和矫味剂。
[0061]用于配制本发明药物制品的工具和方法是本领域技术人员已知的，可以以本身已知的方式生产，例如，通过常规的混合、制粒、溶解、冻干或类似方法。
[0062]在一些实施方案中，能够干扰HS和TTR的相互作用的活性剂是肝素/ HS片段或其模拟物。合适的肝素/ HS分子包括但不限于非抗凝性肝素(non-anticoagulantheparin)的二糖、四聚体、六聚体、八聚体、十聚体、12-mer、14-mer、16-mer和18_mer。然而，在一些实施方案中，可使用全长非抗凝性肝素。此外，肝素/ HS聚合物、寡聚体或片段的硫酸化程度可以在三硫酸化和单硫酸化单糖之间变化。在一些实施方案中，非抗凝性肝素的疗效可以变化，硫酸化程度越高，疗效越高。
[0063]术语“肝素/ HS模拟物”指与肝素/ HS相似但不同的硫酸化寡糖。这类寡糖包括但不限于硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸化K5多糖、硫酸化天然多糖和寡糖(来自植物和海产)，以及合成的硫酸化寡糖。在本发明的不同实施方案中，包括长度和硫酸化水平在内的结构也可改变。
[0064]在其他实施方案中，能够干扰HS和TTR的相互作用的活性剂是TTR-来源肽或其修饰肽。这类肽包括以下肽:包含SEQ ID N0.1所述氨基酸序列的肽或由SEQ ID N0.1所述氨基酸序列组成的肽，包含SEQ ID N0.1的氨基酸24-35的肽或由SEQ ID N0.1的氨基酸24-35组成的肽，包含SEQ ID N0.1的氨基酸50-61或10-24的肽或由SEQ ID N0.1的氨基酸50-61或10-24组成的肽，和包含氨基酸序列KvLDAVRGSPAINvAVHVFRK (SEQ ID N0.2)的肽或由氨基酸序列KVLDAVRGSPAINVAVHVFRK(SEQ ID N0.2)组成的肽，优选是包含氨基酸序列AVHVFRKAA(SEQ ID N0.3)的肽或由氨基酸序列AVHVFRKAA(SEQ ID N0.3)组成的肽，更优选是包含氨基酸序列VHVFRK (SEQ ID N0.4)的肽或由氨基酸序列VHVFRK (SEQ ID N0.4)组成的肽，及所述肽的任意组合。适用于本发明的修饰的肽包括这样的肽，所述肽相比SEQID N0.1所述序列或其片段，在其氨基酸序列中具有至少一个修饰，并保留了干扰HS和TTR之间的相互作用的能力。换言之，适用于本发明的肽包括这样的肽，所述肽与SEQ ID N0.1所述ITR的氨基酸序列具有至少80%，优选至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，条件是其仍具有干扰HS和TTR之间的相互作用的能力。
[0065]在其他实施方案中，能够干扰HS和TTR的相互作用的活性剂是阻断抗体，优选特异性结合SEQ ID N0.1所述TTR的氨基酸24-35的抗体，或特异性结合SEQ ID N0.1的氨基酸50-61或10-24的抗体，或其任意组合。可以通过本领域已知的任何标准方法生产治疗性抗TTR抗体。这类抗体可以是嵌合的、人源化的、全人的或重组的抗体。在一些优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。在其他一些优选的实施方案中，可以使用抗体片段，如Fab、Fab，、F(ab’)2、FV 或单链 FV 片段。
[0066]用于本发明的抗TTR抗体可以是通过化学或遗传改造与其它活性剂缀合的，所述其它活性剂使抗体靶向理想的作用位点。可选的，可以通过化学或遗传改造将其他化合物与本发明的抗体缀合，从而增强或提供针对抗体的额外特性，尤其是增强抗体促进减轻由HS和TTR之间的相互作用介导的有害效应的能力的特性。
[0067]在一些方面，本发明涉及用于预测和/或早期诊断TTR淀粉状变性的诊断方法。在一些实施方案中，抗TTR抗体可用于检测患者的血浆或脊髓液体中的天然TTR浓度，所述患者被怀疑患有TTR淀粉状变性，或有患TTR淀粉状变性的风险，所述TTR淀粉状变性如FAP、家族性心脏淀粉状变性和SSA。目前，TTR淀粉状变性的病因尚不清楚。不受任何理论限制，SSA的一个可能的病因是TTR增加的在肝脏中的生产和向血浆中的释放。在其他一些实施方案中，抗TTR抗体，尤其是选择性结合SEQ ID N0.1所述TTR的氨基酸24-35或SEQ ID N0.1的氨基酸50-61或10-24的抗体，或其任意的组合，可用于检测患者的血浆或脊髓液体中的TTR单体浓度，所述患者被怀疑患有TTR淀粉状变性，或有患TTR淀粉状变性的风险。一般而言，天然的TTR四聚体不被认为是病理性的。仍不受任何理论限制，认为天然四聚体可能受低PH触发，成为解离型，导致隐蔽位点暴露的单体，所述隐蔽位点由SEQ IDN0.1的氨基酸24-35组成。然后，这些隐蔽位点可以与HS相互作用，导致病理性的单体聚集。因此，增加的天然TTR四聚体浓度以及增加的TTR单体浓度可用于TTR的早期诊断或预测TTR的发作。[0068]可以通过本领域已知的常规方法确定体液(例如血浆或脊髓液体)中的TTR四聚体或单体的浓度。例如，抗TTR抗体，尤其是结合SEQ ID N0.1所述TTR的氨基酸24-35，或SEQ ID N0.1的氨基酸50-61或10-24的抗体，或其任意的组合，可用于ELISA测定或其他免疫学技术，用于检测单体TTR。此外，抗HS抗体和抗TTR抗体的组合可用于检测TTR-HS的复合物。这可以通过例如可商购的Duolink技术来实现，所述技术通过检测优选在血浆或脊髓液体或固定的组织或细胞中的HS和TTR的相互作用/复合物。本领域技术人员还可获得其他合适的方法。
[0069]在一些实施方案中，可以化学或通过遗传改造来标记抗TTR抗体，来提供可检测的抗体。这类标记的抗体可用于诊断TTR，并且是用于成像目的的有效工具。
[0070]本发明的另一方面涉及用于预测和/或早期诊断TTR淀粉状变性的试剂盒，包括一种或多种用于评估患者的体液(如血浆或脊髓液体)中的TTR量的试剂，所述患者被怀疑患有TTR淀粉状变性，或有风险患TTR淀粉状变性。待被评估量或浓度的TTR可以是TTR四聚体或单体的形式。待被用于评估的试剂可以是根据本文所述任何实施方案的抗TTR抗体，尤其是结合SEQ ID N0.1所述TTR的氨基酸24-35、氨基酸51-60、氨基酸10-24的单克隆抗体，或其任意的组合。试剂盒还包括一种或多种试剂，其用于通过例如免疫学方法、放射性或酶学方法，或本领域已知的其他方法，检测所述抗体与体液中(如果存在)的TTR，尤其是单体TTR的结合。在一些实施方案中，试剂盒包含用于通过ELISA测定检测(如果有的话)所述抗体的结合的工具。在其他一些实施方案中，试剂盒可包含用于检测TTR-HS复合物的抗HS抗体。可以以固定在固体支持物上的形式提供任何上述组分，所述固体支持物如微滴度板。
[0071]下列实施例用于进一步更详细的澄清本发明，而并非意在限制本发明的范围。本领域技术人员，即，熟悉炎性病症及其治疗的临床医生，可以方便的理解其他应用和用途。
实施例
[0072]对本领域技术人员显而易见的是，随着技术进步，可以以多种方式执行本发明的理念。本发明及其实施方案不限于下述实施例，而是在权利要求的范围内变化。
[0073]材料和方法
[0074]TTR的聚集
[0075]在细菌中表达重组的野生型TTR,并如上所述纯化(Furuya等人(1991)Biochemi stry30:2415-2421)。将纯化的蛋白质溶解在20mM磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH2.7、3.5、4.5 或 7.4)中，至终浓度 50 y M(用于 Thioflavin T 荧光)或 500 y M(用于非变性PAGE)。向TTR溶液中加入肝素(3H-标记的或未标记的)和HS，至附图标记所示浓度。样品在37°C温育所述时间。
[0076]TTR 肽
[0077]与不同TTR片段对应的合成肽购自商业资源，或由专业人员合成。通过MS / MS分析验证肽的纯度和序列。
[0078]肝素和HS
[0079]如Superosel2柱(GE Healthcare Biosciences)的凝胶层析所分析的，肝素具有14kDa平均分子量。从猪组织分离HS样品，并将其在用HS /肝素裂解酶酶促切割后，通过RPIP-HPLC表征。HS I含有5%三硫酸化二糖(IdoA2S-GIcNS6S)且HSII含有45%所述二糖。通过N-去乙酰化肝素，再用N-[3H]醋酸酐重新N-乙酰化，制备3H-标记的肝素。通过肝素的部分脱氨裂解(deaminative cleavage),再用NaBH4还原，生成肝素寡糖。在Bio-gel P-1O柱(Bio-Rad)上分离后，收集片段化的肝素样品。通过咔唑试剂反应定量糖的量。
[0080]检测TTR聚集物
[0081]Thioflavin T(ThT)荧光测定——在温育后，将5 yl样品与ThT在水中混合，至终浓度20 ii M ThT0将混合物转移至平底的黑96孔板(Grainer)中，分别在440nm激发波长和480nm发射波长测量荧光(Gain=55，FARcyte仪器)。在完成ThT染色前的温育后，将不同PH下聚集的样品调节至中性pH。重复两次或三次的进行实验。
[0082]非变性PAGE——在温育后，将10 ill样品与2.5 ill的5x样品缓冲液(0.3MTris-HCl, pH6.8,0.05%溴酚蓝，50%甘油)混合，上样到不合SDS的10%聚丙烯酰胺凝胶上。在100V电泳2.5h后，用考马斯蓝染色凝胶并扫描。为了检测肝素，用阿辛蓝染色凝胶。为了定量3H-标记的肝素，将包括浓缩胶在内的凝胶中的相应泳道切成6片(参见图4A)，将切片转移到闪烁瓶的3ml H2O中。温育2hr后，加入2ml闪烁混合物，测量放射性。
[0083]表面等离振子共振(SPR)分析
[0084]使用Biosensor系统(Biacore2000)，评估TTR与肝素/ HS的相互作用。TTR在酸性缓冲液(PH2.7)中是解离型，然后被稀释成50mM NaAc (pH5.0)偶联缓冲液，并使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)将其固定在CM5传感器芯片上,至3000RU的水平。对于结合和动力学分析，将肝素或HS注射到(浓度如图例所示)表面，并将其在不同PH下平衡。每个样品用0.5M NaCl的30s洗涤步骤后，再生表面。所有获得的传感图都是在Biacore评估软件2.0中减去双参照的，使用参照流式细胞和缓冲液空白样品。
[0085]细胞培养物中的TTR聚集
[0086]在补充了 10%胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(分别是60和50iig / ml)的F12培养基(Gibco)中，培养野生型中仓鼠卵巢细胞(CHO-WT)和HS-缺陷型CHO-pgsD-677细胞。在8孔LabTec室(Nunc)中接种密度为6000细胞/孔的细胞，并培养48h。TTR在酸性缓冲液(PH2.7)中是解离型，并将其在加入到细胞之前(终浓度5 ii M)用NaOH中和至中性，所述细胞是在饥饿培养基(0.1% FBS)中培养的。48h后，去除培养基，在PBS中充分洗涤细胞。然后，用1% NaOH裂解细胞。将裂解物离心(lOOOOrpm，IOmin)，并将上清液与ThT在水中混合，至终浓度20 u MThT。如上所述测量荧光。使用不添加TTR培养的细胞作为对照，从而减去背景荧光。对于免疫细胞染色，将细胞固定在冰冷的95%乙醇和5%醋酸中，并用PBS洗涤。用0.4% TritonX-1OO透化细胞，并用抗TTR抗体(I y g / ml，HPA002550，Atlas Antibodies)温育，再用 Alexa flour488 抗兔 IgG(8 U g / ml, Molecular probes)温育lh。用含有DAPI复染剂的Vectashield(Vector Labs)封固载玻片。用Carl Zeiss,AxioCam instrument 捕获 TTR 免疫信号。
[0087]检测心脏组织中的TTR沉积
[0088]在二甲苯中，将心肌病和对照的心脏组织的甲醛固定、石蜡包埋的切片(15 Pm)脱石腊(30min),并通过乙醇浸泡(99.9% -70% )以IOmin间隔再水合。对于刚果红染色，首先将切片温育在饱和的NaCl溶液(80%乙醇/ 0.1% NaOH ；30min)中，然后转移到过滤的0.4%刚果红(Sigma Aldrich)饱和NaCl溶液(30min)中。对于硫酸化糖胺聚糖染色，首先将切片温育在95%乙醇/ 10% AcOH(l-2min)中，然后用硫酸化阿辛蓝(0.45%阿辛蓝 8GX Sigma Aldrich)溶液(0.45% Na2SO4 / 45% 乙醇 / 10% AcOH ；45min)染色。对于TTR和HS免疫染色，在微波中将切片加热，进行抗原修复，然后在0.4% Triton X-100中透化(15min)。在4°C进行一抗温育过夜(抗TTR:如上所述；抗HS，I:25010E4:Dr.GuidoDavid Center for Human Genetics, University of Leuven, Belgium)。对于突光检测，用 4 Hg / ml 相关二抗 Alexa fluor488 或 594 (Molecular probes, USA)室温温育切片30min ;用DAPI复染细胞核。对于生色检测,用Vulcan Fast Red (Biocare Medical)将相关的Mach3碱性磷酸酶聚合物检测试剂盒(Biocare Medical)显色。用Nikon DXM1200F仪器(Nikon，Melville，NY，USA)捕获荧光和明视野图像。
[0089]分析转基因果蝇TTR模型
[0090]如所述(7),生成过表达突变TTR的转基因黑腹果蚬(Drosophila melanogaster)株(Dhet TTR-A)。研究使用 TTR 转基因(w ；GMR-Ga14 / + ；UAS-TTR-A / +)和非 TTR 转基因对照蝇(w;GMR-Gal4 /+;+/+)。TTR的表达处于GMR_Gal4驱动子的控制下，指导在眼发育阶段过程中TTR在光受体细胞中表达。在标准的土豆泥/酵母/琼脂培养基上，室温培养动物。用补充了 IOmg / ml肝素(Kabivitrum AB, Sweden)或低分子量肝素
(Klexane? )的标准食物饲养卵，所述肝素是与培养基混合的。在9-17天后，收集动物
用于分析。对于ThT染色，在75iil0.15M NaCl中将每组15头均质化。均质化后，将样品离心(10，000印111，101^11)，混合所获得的上清液与1111'(终浓度2011|1 ThT)。如上所述测量荧光。使用非TTR转基因蝇作为对照，减去背景荧光。对于免疫染色，空气干燥从果蝇(10-14天大)头部制备的恒冷箱切片(15iim)，固定在PFA(4% )中。在PBS中洗涤后，通过甲醇浸泡(25% -100% )以IOmin间隔将切片脱水。在H2O2-处理(2% )后，再通过甲醇浸泡再水合，用PBT (0.2% Triton-XlOO)中的5% BSA封闭切片。在封闭溶液中温育一抗(抗TTR和抗HS /肝素，如上所述)过夜。对于荧光检测，在封闭溶液中用2iig / ml的相关二抗Alexa fluor555和633抗体温育切`片lhr。在PBS中洗涤后，用封固基质中的DAPI染色切片。使用 PlanApochromat20x / 0.16 或 C_Apochromat63x / 1.2 物镜，用倒置的共聚焦显微镜(LSM700，Carl Zeiss)捕获图像。
[0091]结果
[0092]HS和TTR淀粉状蛋白在心肌病心脏中的共沉积
[0093]在偏振光下观察时，来自诊断为心肌病的患者的15 厚心脏切片的刚果红染色揭示了苹果绿色的双折射(图1A)，证实了样品中的淀粉样沉积。相邻切片的硫酸化阿辛蓝染色揭示了与刚果红阳性形态相似的模式(图1B)。双重免疫染色验证了 TTR沉积大部分与HS共定位(图1C、D和E)。与之相比，来自年龄匹配的对照的心脏切片染色没有产生TTR的免疫信号(图1F)。TTR和HS的共沉积在胞外空间是显著的，似乎与肌细胞膜紧密相关，而脉管中的共沉积则变化更大，一些缺少HS的血管壁也是染色阳性(图1C和E)。在对照组织中未检测到任何TTR沉积或HS积累(图1F)。
[0094]肝素和HS促进WT TTR的原纤维化
[0095]Thioflavin T突光分析揭示了在37°C温育48h的条件下，甚至在低pH(2.7)的条件下，在细菌系统中表达的重组人WT TTR表现出非常低的自发原纤维化(图2)。然而，在该条件下加入肝素(HS的类似物)促进了 TTR聚集，形成显著量的淀粉状蛋白样原纤维(图3A)。温育TTR与源自肝素的寡聚体揭示了肝素的尺寸依赖性效应，因为小于18-糖残基的片段(12-mer和6-mer)具有的效应明显低于较长聚合物。值得注意地，相比与全长肝素(?50-mer)温育的TTR，与18-mer温育的TTR导致更多的淀粉状蛋白样原纤维。具有较高硫酸化程度的HS (HS II)有效增强了 TTR的原纤维化，虽然程度低于肝素，而低硫酸化的HS (HS I)对TTR聚集具有边际效应(图3B)。
[0096]通过非变性PAGE分析与或不与肝素温育的TTR，显示了 TTR-肝素聚集物表现出不同的迁移模式。与不含肝素的TTR聚集物的连续涂抹状外观相反，与肝素共温育导致显著的大分子TTR聚集物迁移至凝胶顶部，与温育前观察到的未聚集条带分离，代表单体、二聚体和四聚体(图3C)。肝素对TTR聚集的这一效应在高浓度更明显，提示了剂量依赖性的效应。TTR肝素温育生成了在荧光和偏振光显微镜下可见的刚果红阳性原纤维(图3D)，而不与肝素温育的TTR是刚果红阴性的。
[0097]为了确定在所获得的TTR原纤维中是否整合肝素/与肝素共原纤维化，或者肝素是否仅作为原纤维化的催化剂发挥作用，将TTR与3H-标记和未标记的肝素的混合物温育。在非变性PAGE上分离共温育的肝素-TTR和单独的肝素的样品。阿辛蓝染色使肝素迁移模式可视化，该模式在两种样品之间是不可区别的(图6A)。通过计数凝胶切片(如图6A所示切割)中的放射性，分析3H-标记的肝素，显示了主要在切片4、5和6中回收单独温育的肝素(图6B)，与阿辛蓝染色一致。相反，除切片4、5和6外，基本上仅在切片I (浓缩部分)中回收了与TTR共温育的肝素。值得注意地，阿辛蓝不能对肝素-TTR共温育样品的切片I中的肝素染色，可能是由于所获得的TTR淀粉状蛋白样原纤维的遮蔽效应。
[0098]为了验证切片I中回收的肝素不是肝素与聚集型TTR相互作用的结果，将3H-标记的肝素与预先聚集的TTR温育。通过相同的方法分析产物，显示了 3H-标记的肝素的分布模式(图5)基本与单独的肝素相同(图4B)，提示没有或几乎没有肝素与聚集型TTR相互作用。
[0099]TTR-肝素/ HS相互作用的表征
[0100]为了进一步研究TTR-肝素/ HS相互作用的机制，应用了表面等离振子共振(SPR)光谱。在中性(PH7.4)和温和酸性(pH5.0)的条件下，在Biacore传感器芯片上固定解离型TTR，并且使肝素与配体相互作用。在温和酸性pH下，观察到与解离型TTR结合的肝素，但在中性条件下未观察到，证实了相互作用的pH依赖性(图6A)。也观察到了 HS 11(具有较高硫酸化程度的HS)的pH依赖性相互作用，其在pH5.0时表现出明显结合，而在pH5.5时表现出显著降低的结合(图6B)。SPR光谱分析还显示，HS /肝素的硫酸化程度在该相互作用中发挥作用，因为TTR对肝素的亲和力比对HS II的亲和力高10倍，比对低硫酸化的HS I高1000倍(图7A、B和C)。还通过测量在pH5.0和7.4下，用肝素和HSII温育7天的TTR的原纤维形成，进一步验证了这一 pH和硫酸化程度依赖性的相互作用(图6C)。
[0101]为了表征TTR-肝素相互作用，将TTR与其肽片段与3H-肝素温育。通过硝酸纤维素滤纸捕获方法(18)分析结合。在测试的16种肽中，仅aa24-35的肽(PAINVAVHVFRK)结合肝素(图8B)。该肝素结合肽含有3个碱性氨基酸，包括可能对TTR-肝素/ HS相互作用中观察到的PH依赖性有作用的组氨酸。通过SPR分析进一步验证了这一选择性结合特性(图9)。含有V30M突变的24-35肽表现出比WT肽显著更低的肝素结合(图8B)，所述24-35肽与家族性淀粉状蛋白神经病相关。
[0102]根据结合测定，注意到肝素优先结合解离型TTR(图SB)。为了验证，将解离型和天然TTR固定在Biacore芯片上，将HS II注射到pH5.0的表面上。获得的传感图揭示了 HSII与解离型TTR的结合更强(图10)。这些结果提示，TTR的肝素/ HS结合结构域在天然折叠的蛋白质中是隐蔽的。
[0103]在细胞培养中和在体内，HS /肝素促进TTR的原纤维化
[0104]为了研究HS /肝素在TTR原纤维化中的效应是否也可应用于细胞，将解离型TTR与中华仓鼠卵巢WT (CHO-WT)和HS-缺陷型(CHO-pgsD-677)细胞的培养物(19)温育48h。温育后，在PBS中充分洗涤细胞，去除游离的TTR。细胞裂解物的ThT荧光分析揭示了相比HS-缺陷型CHO-pgsD-677细胞，CHO-WT细胞中显著的淀粉状蛋白样原纤维的量(图11A)，证实了 HS对TTR原纤维化的效应。用抗TTR抗体对细胞进行免疫细胞染色，在HS-缺陷型细胞(CHO-pgsD-677)中检测到痕量的阳性免疫信号；与之相比，在CHO-WT细胞中发现了强阳性信号(图11B)。
[0105]为了评估体内肝素对TTR原纤维化的效应，应用表达改造的突变体形式的人TTR(16,20)的转基因果蝇模型。用补充了或未补充肝素或低分子量肝素(Klexane?)的标准培养基饲养转基因蝇。在盐水中提取的蝇头部裂解物(参见方法)的ThT荧光分析显示用肝素补充物喂养的蝇生成了 ThT阳性淀粉状蛋白样原纤维，而未给予添加剂或Klexane?的蝇则没有生成任何原纤维(图12A)。为了证实在用肝素喂养的蝇头部观察到实质性的原纤维形成，通过阿辛蓝染色的斑点印迹分析头部裂解物(图12B)。在用肝素饲养的蝇的头部裂解物中观察到了强染色，而在对照或Klexane喂养的蝇的相应样品中没有检测到任何染色。从培养在补充肝素的培养基上的TTR转基因蝇的头部制备切片，所述切片的免疫组化染色揭示出在视网膜中的TTR和肝素共染色(图15D ;E，TTR和肝素共沉积材料的3D图)。从常规培养基饲养的转基因蝇制备的切片(图15F)，和从补充肝素的培养基饲养的非转基因蝇制备的切片(图15G)都在视网膜中没有表现出针对TTR和肝素的共染色。
【权利要求】
1.诊断TTR淀粉状变性的方法，包括步骤: (a)提供来自人对象的体液样品， (b)确定所述体液中的TTR浓度， (c)如果步骤(b)中确定的TTR浓度高于对照样品，则确定所述人对象患有TTR淀粉状变性或处于发展TTR淀粉状变性的高风险。
2.根据权利要求1的方法，其中所述体液选自血浆和脊髓液体。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述体液中的TTR是单体的形式。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述TTR是四聚体的形式。
5.根据权利要求的方法，其在步骤a)和b)之间还包括另外的步骤，其中所述样品暴露于低pH，如pH2.7，从而将TTR四聚体解离为单体。
6.根据权利要求3-5的任一项的方法，其中TTR的浓度是使用抗TTR抗体确定的。
7.根据权利要求6的方法，其中所述抗体选择性的结合SEQID N0.1所述TTR的第24-35,50-61或10-24位氨基酸，或其任意组合。
8.根据权利要求1-7的任一项的方法，其中所述TTR淀粉状变性选自家族性淀粉样多神经病、家族性心脏淀粉状变性和散发的老年全身性淀粉状变性。
9.用于根据权利要求1-8的任一项的方法的试剂盒，其包括 a)抗TTR抗体，和` b)用于检测体液样品中的TTR表达水平的一种或多种试剂。
10.根据权利要求9的试剂盒，其还包含抗HS抗体。
11.根据权利要求9或10的试剂盒，其中所述一种或多种试剂选自二抗；和碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或其他酶报告子系统的比色的、化学发光的或化学荧光的底物。
12.预防、减轻和/或治疗有需要的患者中的甲状腺素运载蛋白(TTR)淀粉状变性的方法，所述方法通过施用有效量的能够干扰TTR和硫酸乙酰肝素(HS)相互作用的活性剂。
13.根据权利要求12的方法，其中所述活性剂选自硫酸乙酰肝素寡糖，硫酸乙酰肝素多糖、非抗凝性肝素寡糖，非抗凝性肝素多糖及其模拟物。
14.根据权利要求12的方法，其中所述活性剂是TTR肽，其包含SEQID N0.1所述氨基酸序列或其片段。
15.根据权利要求12的方法，其中所述活性剂是抗TTR抗体。
16.根据权利要求12-15的任一项的方法，其中所述TTR淀粉状变性选自家族性淀粉样多神经病、家族性心脏淀粉状变性和散发的老年全身性淀粉状变性。
17.能够干扰HS和TTR之间的相互作用的活性剂，其用于预防、减轻和/或治疗TTR淀粉状变性。
18.根据权利要求17的活性剂，其中所述活性剂选自硫酸乙酰肝素寡糖、硫酸乙酰肝素多糖、非抗凝性肝素寡糖、非抗凝性肝素多糖及其模拟物。
19.根据权利要求17的活性剂，其中所述活性剂是TTR肽，其包含SEQID N0.1所述氨基酸序列或其片段。
20.根据权利要求17的活性剂，其中所述活性剂是抗TTR抗体。
21.根据权利要求17-20的任一项的活性剂，其中所述TTR淀粉状变性选自家族性淀粉样多神经病、家族性心脏淀粉状变性和散发的老年全身性淀粉状变性。
22.药物组合物，其包含能够干扰HS和TTR之间的相互作用的活性剂，和可药用的载体。
【文档编号】G01N33/68GK103492882SQ201280019063
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年2月21日 优先权日:2011年2月21日
【发明者】U·林达尔, J·李, F·诺博恩 申请人:波利塞卡里德弗斯宁乌普萨拉有限公司