用于治疗间皮瘤的雌激素受体β激动剂的制作方法

用于治疗间皮瘤的雌激素受体β激动剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种使用雌激素受体β亚型(ERβ)激动剂进行的间皮瘤——特别是恶性胸膜间皮瘤——的治疗，其中所述治疗包括将ERβ激动剂给予患者，然后在最长达24小时的时间t后，将含铂抗癌药物给予患者。本发明还提供了用于在患者中治疗间皮瘤的ERβ激动剂和含铂抗癌药物，其中所述治疗包括将ERβ激动剂给予患者，然后在最长达24小时的时间t后，将含铂抗癌药物给药患者；以及一种包括含铂抗癌药物和ERβ激动剂的试剂盒。
【专利说明】
用于治疗间皮瘤的雌激素受体β激动剂
技术领域
[0001 ]本发明涉及使用雌激素受体β亚型激动剂(ERP激动剂)和含铂抗癌药物治疗间皮 瘤，特别是恶性胸膜间皮瘤。
【背景技术】
[0002] 间皮瘤是肺和/或腹部的间皮细胞的癌症。恶性胸膜间皮瘤(MPM)是间皮瘤的最常 见形式，并且它与石棉暴露相关。目前，MPM发病率正在上升，并且估计表明，在西方国家MPM 发病率在未来的10-15年内将达到峰值，而在日本预计峰值直到从现在开始计40年后才会 出现（Robinson BM.，Ann Cardiothorac Surg 2012; 1(4) :491_6;Prazakova S，Thomas PS，Sandrini A，Yates DH.，Clin Respir J 2013;8(1) :1-10)。虽然石棉的使用已在世界 范围内的许多国家被禁止，但是石棉生产和暴露仍然与间皮瘤的地方性高发病率相关 (Stayner L，Welch LS，Lemen R.，Annu Rev Public Health2013;34:205_16)。碳纳米管也 已经成为引发间皮瘤的潜在顾虑，因为已经报道了它们表现出"石棉样"的致病性，具有诱 发间皮瘤的可能性（Donaldson K，Poland CA，Murphy FA，Macfarlane M，Chernova T， Schinwald A.,Adv Drug Deliv Rev 2013；65(15)：2078-86；Dumortier H.,Adv DrugDeliv Rev.2013;65(15):2120-26)。
[0003] MPM是一种非常难治疗的疾病，中位总生存期为9至17个月，不论处于哪一个疾病 阶段（Campbell NP，Kindler HL.，Semin Respir Crit Care Med 2011;32:102-10; Mossman BT等人，Am J Pathol 2013;182(4):1065-77)。顺铂和培美曲塞的组合已被确立 为目前的治疗标准（standard of care) (SOC)。然而，只有40%的受治疗患者显示对该疗法 的响应，总生存期为 12.1 个月（Vogelzang NJ等人，J Clin Oncol 2003;21:2636-44)。多种 化疗剂已经被用作MPM的二线治疗方案，其作为单一疗法或作为多药疗法的一部分，但均未 被成功证明有效。
[0004] 在Pinton，G.等人，Abstract Book of the 11th International Conference of the International Mesothelioma Interest Group，2012年9月，第104页-105页中，记载 了ERP激动剂KB9520,其通过在Gl处阻断细胞周期而抑制人ER即日性REN间皮瘤细胞系在培 养物中的增殖。在与该摘要相关的海报中，P inton等人提出了 E邸激动剂增强顺铂和培美曲 塞对体外和小鼠体内的人间皮瘤REN细胞的抗增殖作用的证据。
[0005] 仍然需要用于间皮瘤的临床治疗的改进疗法或替代疗法。

【发明内容】

[0006] 本发明提供了一种ERi3激动剂，其用于在患者中治疗间皮瘤，其中该治疗包括：
[0007] a)给予患者ERP激动剂，然后在最长达24小时的时间t后，
[0008] b)给予所述患者含铂的抗癌药物。
[0009] 本发明人出乎意料地发现，当在给予含铂抗癌药物前最长达24小时的时间t时给 予ERP激动剂时，ERP激动剂与含铂抗癌药物的组合对于恶性间皮瘤的治疗是特别有效的。 该出乎意料出乎意料的协同效应仅在首先给予ERi3激动剂时存在：当在ERi3激动剂之前给予 含铂抗癌药物时，所述效应不存在。
[0010] 本发明还提供了一种在患者中治疗间皮瘤的方法，其包括：
[0011] a)给予患者ERP激动剂，然后在最长达24小时的时间t后，
[0012] b)给予所述患者含铂抗癌药物。
[0013] 本发明还提供了一种ERP激动剂，其用于制备在患者中治疗间皮瘤的药物，其中该 治疗包括：
[0014] a)给予患者ERP激动剂，然后在最长达24小时的时间t后，
[0015] b)给予所述患者含铂抗癌药物。
[0016] 本发明还提供了用于在患者中治疗间皮瘤的ERP激动剂和含铂抗癌药物，其中该 治疗包括：
[0017] a)给予患者ERP激动剂，然后在最长达24小时的时间t后，
[0018] b)给予所述患者含铂抗癌药物。
[0019]本发明还提供了一种试剂盒，其包括含铂抗癌药物和ERP激动剂。
【附图说明】
[0020]图IA示出了与未经处理的细胞相比，采用不同剂量的化合物（I)(浓度范围1-IOOnM)处理24小时后，来自恶性胸膜间皮瘤的REN细胞的生长抑制百分比。每个柱代表平均 值+/_标准偏差(s. d);*P彡0.05。
[0021] 图IB示出了在来自间皮的细胞(MET5A)中，和在具有不同的内源性ERf3表达水平的 来自MPM的细胞（REN、MMB、H2596和MST0-211H)中，以及在采用ER0表达载体转染的MSTO-21把细胞(1^1'〇-211!1/^肋）中，采用化合物（1)(1〇1^)处理24小时和48小时后的生长抑制百 分比。还示出了REN细胞和MMB细胞，在这些细胞中已经采用ER0特异性siRNA(REN/siRNA ER β和MMB/siRNA ERi3)敲除了ERi3。柱状图下面的蛋白质印迹显示了各细胞系的ERi3蛋白表达 和荷载的对照微管蛋白。每个柱代表平均值+/-S. d广PS0.0 5。
[0022] 图2A示出了与未经处理的细胞相比，暴露于单独的化合物（I) (IOnM)或暴露于与 顺铂（100μΜ)和培美曲塞（22μΜ)组合的化合物（I)(10nM)24小时后的REN细胞存活。每个柱 代表平均值+/-S. d广P彡0.05。
[0023]图2B示出了体内实验的处理时间表。
[0024]图2C和图2D示出了4个不同处理组的箱线图，其示出了在处理的第21天评估的体 内平均肿瘤生长（图2C)和平均肿瘤生长抑制（图2D)。粗线代表中位数，而各矩形的上部和 下部边界代表四分位数。柱示出了每组的最大值和最小值，且通过小圆圈标出异常值。 [0025]图3A示出了在采用化合物（I) (IOnM)预处理1、2、4、8、16或24小时，随后洗掉并在 普通培养基(normal medium)中继续生长额外的24小时之后，REN细胞中的生长抑制百分 比。每个柱代表平均值+/-S. d; *P彡0.05。
[0026]图3B示出了预暴露于普通培养基(对照)或化合物(I)(10nM)2小时，随后洗掉并在 普通培养基中继续生长额外的24、48或72小时之后，REN细胞的存活。
[0027] 图4A示出了化合物（I) (IOnM)处理开始后2、4、8或12小时加入顺铂（100μΜ)对REN 细胞存活的影响。每个柱代表平均值+/-S. d广PS0.0 5。
[0028]图4B示出了采用化合物（I) (IOnM)预处理2小时，随后洗掉并在补充有不同浓度的 顺铂(20-100μΜ)的普通培养基中继续生长额外24小时之后，REN细胞的存活。每个柱代表平 均值+/_s.d;*P 彡 0.05。
[0029] 图4(：示出了顺铂（10(^]\〇处理开始后2、4、8或12小时加入化合物（1)(1〇11]\〇对1^^ 细胞存活的影响。每个柱代表平均值+/-S. d。
[0030] 图4D示出了采用化合物（I) (IOnM)预处理2小时，随后洗掉并在补充有不同浓度的 培美曲塞(5_22μΜ)的普通培养基中继续生长额外的24小时之后，REN细胞的存活。每个柱代 表平均值+/-S. d。
[0031] 图4E示出了采用化合物（I) (IOnM)预处理两小时，随后洗掉并在普通培养基或含 有顺铂（100μΜ)、培美曲塞（22μΜ)或顺铂（100μΜ)/培美曲塞（22μΜ)组合的培养基中继续生 长额外的24小时之后，REN细胞的存活。每个柱代表平均值+/-S. d广PS0.0 5。
[0032]图4F示出了图4B中所示的结果的等效线图分析的结果。
[0033] 图5A示出了采用顺铂（100μΜ)处理24小时或采用化合物（I) (IOnM)预处理2小时、 随后洗掉并在普通培养基±顺铂（1〇〇μΜ)中继续生长额外的24小时的REN细胞的细胞周期 阶段结果。
[0034]图5Β示出了在采用顺铂(25、50和100μΜ)处理24小时或采用化合物（I) (IOnM)预处 理2小时、随后洗掉并在普通培养基土顺铂(25、50和100μΜ)中继续生长额外的24小时的REN 细胞中，PARPl裂解和AKT磷酸化的蛋白质印迹分析和相对光密度测定法。将总AKT和微管蛋 白染色用于归一化。
[0035] 图6Α示出了在采用顺铂(25、50和100μΜ)处理24小时或采用化合物（I) (IOnM)预处 理2小时、随后洗掉并在普通培养基土不同浓度的顺铂（25、50和100μΜ)中继续生长额外的 24小时后，对ΜΕΤ5Α细胞存活的影响。每个柱代表平均值+/-S. d ;*Ρ<0.05。
[0036] 图6Β示出了在采用顺铂(25、50和100μΜ)处理24小时或采用化合物（I) (IOnM)预处 理2小时、随后洗掉并在普通培养基土不同浓度的顺铂（25、50和100μΜ)中继续生长额外的 24小时的ΜΕΤ5Α细胞中，PARPl裂解和AKT磷酸化的蛋白质印迹分析和相对光密度测定法。将 总AKT和微管蛋白染色用于归一化。
[0037]图7Α示出了采用顺铂(50μΜ)处理24小时或采用化合物（I) (IOnM)预处理2小时、随 后洗掉并在普通培养基土顺铂（50μΜ)中继续生长额外的24小时后的MMP细胞的存活。每个 柱代表平均值+/ _s. d。
[0038]图7B示出了在采用顺铂(50μΜ)处理24小时或采用化合物（I) (IOnM)预处理2小时、 随后洗掉并在普通培养基土顺铂(50μΜ)中继续生长额外的24小时的MMP细胞中，PARPl裂解 和AKT磷酸化的蛋白质印迹分析。
【具体实施方式】
[0039]本发明提供了一种ERi3激动剂，其用于在患者中治疗间皮瘤，其中该治疗包括： [0040] a)给予患者ERP激动剂，然后在最长达24小时的时间t后，
[0041] b)给予患者含铂抗癌药物。
[0042] 本发明人已发现，化合物（I) 一一一种选择性ERP激动剂一一在体外MPM细胞系中 具有抗增殖作用。已经发现，化合物（I)的抗增殖作用与其对ERP的作用相关，并且化合物 (I)的效力与内源表达的ERi3水平有关。化合物（I)对来自ER即日性间皮的MET5A细胞没有抗 增殖作用。
[0043] 本发明人现已另外发现，化合物（I) 一一一种选择性ERP激动剂一一在体外REN细 胞和小鼠体内REN细胞中引起增强的顺铂/培美曲塞的生长抑制作用。
[0044]本发明人出乎意料地发现，ERP激动剂和顺铂(或顺铂/培美曲塞的组合)的给药顺 序是该改善的治疗效果的关键:REN细胞在暴露于顺铂之前暴露于ERP激动剂导致恶性间皮 瘤细胞增殖和存活的协同抑制，而相反的药物暴露顺序不具有该增强作用。
[0045]此外，采用ERP激动剂预处理过的MPM细胞对低剂量顺铂的细胞毒性更敏感。当在 顺铂之前给予ERf3激动剂时，ERf3激动剂出乎意料地充当化学增敏剂，增加顺铂的细胞毒性。 因此，本发明可允许在患者中较温和的SOC(顺铂)给药方案而不损失抗肿瘤效力。由于顺铂 与严重的毒性相关，并且由于大多数被诊断患有MPM的患者超过65岁，他们的健康状况可能 不允许顺铂/培美曲塞的标准化疗给药方案。因此，本发现在不能耐受标准顺铂/培美曲塞 给药方案的患者中可能具有特别有用。
[0046] 本发明人还已发现，恶性和非恶性细胞对顺铂和ERP激动剂具有明显不同的响应： 在来自非恶性间皮的细胞中，对化合物（I)的响应是中性的，而化合物(I)抑制MPM细胞的增 殖和肿瘤生长。
[0047]此外，采用化合物(I)预处理再用顺铂处理导致在MPM细胞中对顺铂的细胞敏感性 显著增强，而在来自非恶性间皮的细胞中采用化合物（I)预处理抵消顺铂的细胞毒性。因 此，ERi3激动剂可用于降低含铂抗癌药物在患者正常细胞中的毒性，并由此保护正常细胞免 受含铂抗癌药物的有害作用。
[0048]因此，ERi3激动剂在降低含铂抗癌药物在患者中的毒性方面有用。因此本发明提供 了一种ERi3激动剂，其用于降低含铂抗癌药物在患者的非癌细胞中的毒性，其中所述治疗包 括：
[0049] a)给予患者ERP激动剂，然后在最长达24小时的时间t后，
[0050] b)给予所述患者含铂抗癌药物。
[0051] 本发明还提供了降低含铂抗癌药物的副作用的方法，其包括在给予含铂抗癌药物 前不久给予ER0激动剂的步骤。例如，在给予含铂抗癌药物之前最长达24小时(例如之前1至 4小时，例如之前2小时)给予ERB激动剂。
[0052]综上所述，本发明人已出乎意料地表明，ERP激动剂充当化学增敏剂，并且与顺铂 组合的给药顺序对于体外所观察的协同效应是至关重要的。
[0053]此外，他们出乎意料地发现，化合物（I)在表达ERP的非恶性间皮MET5A细胞中无细 胞毒性作用，而且，化合物(I)减少了顺铂在这些细胞中的细胞毒性。因此，存在向目前用于 MPM的顺铂治疗中添加 ER0激动剂而不增加显著的额外毒性的可能性。
[0054] ER0激动剂
[0055] "ER0激动剂"为对雌激素受体β亚型表现出EC5Q0.1 nM至1000 OnM的效力的化合物。 用于本发明的优选的ERP激动剂化合物对雌激素受体β亚型表现出在所述EC5q范围内的较低 浓度下的效力，例如EC 5qO · InM至IOOnM的效力。优选的本发明的ERP激动剂化合物是对雌激 素受体β亚型的选择性超过对雌激素受体α亚型的选择性的那些化合物。选择性ERP激动剂 是与对雌激素受体α亚型相比，表现出对雌激素受体β亚型的选择性为20或更大的化合物； 或更优选地，与对雌激素受体α亚型相比，表现出对雌激素受体β亚型的选择性为50或更大 的化合物。在某些优选的实施方案中，用于本发明的ERP激动剂化合物对雌激素受体β亚型 的选择性比对雌激素受体α亚型的选择性大100倍，大200倍，大300倍，或大500倍(基于EC 50 效力的值来计算）。
[0056] ERP激动剂是本领域已知的。例如，用于本发明的ERP激动剂可以是在以下任一篇 文献中被描述为ERP激动剂的化合物:WO 2002/072561、W0 03/044006、W0 2004/094401、W0 2006/0887UW0 2006/01983UW0 2006/044176^W0 2006/062876^ffO 2007/062876^EP 2143432、W0 2008/033894、W0 2008/043567、W0 2009/012191、W0 2009/012954、W0 2009/ 055734、W0 2009/124968、W0 2009/127686、W0 2010/031852、W0 2011/042473、W0 2011/ 042474、TO 2011/042475、TO 2011/042477和TO 2013/017619,它们的全部内容以引用的方 式纳入本文。
[0057] 优选地，所述ER0激动剂是在WO 2009/127686或WO 2006/062876中被描述为ER0激 动剂的化合物。例如，所述ERP激动剂可以为式（III)的化合物或其药学上可接受的酯、酰 胺、氨基甲酸酯、溶剂合物或盐，包括所述酯、酰胺或氨基甲酸酯的盐，以及所述酯、酰胺、氨 基甲酸酯或盐的溶剂合物，
[0058；
[0059] 其中R1选自卤素、氰基、硝基、OrWrbK(O)C 1-4烷基、-SO2C1-4烷基、C1-6烷基、 C2-6烯基、C2-6炔基、卤代&-6烷基、二卤代&-6烷基、三卤代&-6烷基、卤代C2-6烯基、二卤代C2-6 烯基、三卤代C2-6烯基、氰基Ci-6烷基、Ci-4烷氧基Ci-6烷基、C 3-S环烷基、C3-S环烷基Ci-6烷基、苯 基、苄基和5-10元杂环基，其中所述苯基、苄基或杂环基基团可为未取代的或被1-3个取代 基取代，各取代基选自〇R A、卤素、氰基、硝基、-C( 0) Ci-4烷基、Ci-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤 代&-6烷基、二卤代&-6烷基和三卤代&-6烷基；
[0060] R2选自卤素、氰基、硝基、(#、以妒):^(0!〇2、任选地被1至3个卤素取代的-(：(0)(： 1一4 烷基、-SO2Ci-4 烷基、-C (0) NH-OH、-C (NH2) = N-OH、-C (CO2H) = N-OH、-C (NH2) = NH、-C (NHCi-4 烷基）=NH、-C(〇-Ci-4 烷基）=NH、-C(NH2) =N-NHh-NH-C(Mfe) =NH、-NH-C(0)NH2、_N = C(-NH-CH2CH2-NH-)、-S-CN、-S-C(NH2) = NH、-S-C(NH2) = N-OH、-CO2H、-CH2-CO2H、-CH(OH) CO2H、-C(O)Co2ISO3HXH2SO 3HX1-6烷基、卤代C1-6烷基、二卤代&―6烷基、三卤代(^- 6烷基、氰基&一6 fei基、Cnfei氧基Cnfei基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环基、C3-8环基Cnfei基、苯基、苄基和 5-10元杂环基，其中所述苯基、苄基或杂环基基团可为未取代的或被1-3个取代基取代，各 取代基选自〇RA、卤素、氰基、硝基、Cp6烷基、C2-6烯基、C 2-6炔基、卤代Cp6烷基、二卤代(^-6烷 基和三卤代Ci-6烷基;条件是如果R 1和R2之一代表卤素，则另一个必须代表卤素以外的基团； [0061 ] R3、R4、R5和R6各自独立地选自氢、OR a、卤素、氰基、硝基、Ck烷基、C2-6烯基、C2- 6炔 基、卤代烷基、二卤代&-6烷基和三卤代烷基；
[0062] 各Ra独立地选自氢、&-6烷基、C2- 6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、C 3-8环烷基Ck烷基、 C6-1Q芳基和C6-K)芳基Cp6烷基，各自任选地被1至3个卤素原子取代;和
[0063] 各妒独立地选自氢、&-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-S环烷基、C 3-S环烷基Cp6烷基、 C6-1Q芳基和C6-K)芳基Cp6烷基，各自任选地被1至3个卤素原子取代；
[0064]条件是式（III)的化合物不为
[0065] 4-[3-(4,5_ 二氢-IH-咪唑-2-基)-2-(3,5-二甲基-异噁唑-4-基)-吲哚-1-基]-苯 酚；
[0066] 1-(4-羟基-苯基)-2-(4-甲基-咪唑-1-基)-1Η-吲哚-3-甲腈；
[0067] ^4-羟基-苯基)-2-( IH-吡唑-3-基)-1Η-吲哚-3-甲腈；
[0068] 1-(3-氯-4-羟基-苯基)-2-(1-甲基-IH-吡唑-4-基)-1Η-吲哚-3-甲腈；
[0069] 1-(4-羟基-苯基)-2_丙-1-炔基-IH-吲哚-3-甲酸酰胺;或
[0070] 1-(4-羟基-苯基)-2-噻唑-2-基-IH-吲哚-3-甲酸。
[0071] 优选地在式（I II)的化合物中，R1选自ORa、N ( Rb ) 2、-C (0) C1-4烷基、C1-6烷基、C2-6烯 基、C2-6炔基、卤代&―4烷基、二卤代&―4烷基、三卤代&―4烷基、卤代匕4烯基、二卤代C 2-4烯基、 三卤代C2-4烯基、苯基和5-6元杂环基，其中所述苯基或杂环基基团可为未取代的或如上所 述被1 -3个取代基取代，所述取代基选自ORa、卤素、氰基、-C (0) &-4烷基、&-4烷基、C2-4烯基、 C2-4炔基、卤代烷基、二卤代&-4烷基和三卤代烷基；
[0072] R2选自卤素、0RA、N(RB)2、任选地被1至3个卤素取代的-C(O)C 1-4烷基、-以順2)=^ 0H、-C02H、-CH2-C02H、C1-6烷基、C 2-6烯基、C2-6炔基、卤代C1-4烷基、二卤代&―4烷基、三卤代&―4 烷基、卤代烯基、二卤代&-4烯基、三卤代&-4烯基、苯基和5-6元杂环基，其中所述苯基或 杂环基基团可为未取代的或被1-3个取代基取代，所述取代基选自0R A、卤素、氰基、-C(O) &一4烷基、Ci-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、卤代Ci-4烷基、二卤代&-4烷基和三卤代Ci-4烷基；
[0073] 各R3、R4、R5和R6独立地选自氢、OR a、卤素、氰基、Ch烷基、卤代&-4烷基、二卤代&一4 烷基和三卤代d-4烷基；
[0074] 各Ra独立地选自氢、&-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6环烷基、苯基和苄基;和
[0075] 各妒独立地选自氢和&―4烷基。
[0076] 更优选地在式（I II)的化合物中，R1选自ORa、N ( Rb ) 2、-C (0) 烷基、烷基、C2-4 烯基、C2-4炔基、苯基和5-6元杂环基，其中所述苯基或杂环基基团可为未取代的或被1-3个 取代基取代，所述取代基选自卤素、氰基、Ch烷基、_C( 0) Ch烷基和ORa ;
[0077] 各Ra独立地代表氢或&―4烷基;和
[0078] 各妒独立地选自氢和(^-4烷基。在这样的实施方案中，优选地R2选自任选地被1至3 个卤素取代的-C (0) &-4 烷基、-C (NH2 )= N-OH、-CO2H、-CH2-CO2H、&-4 烷基、C2-4 烯基、C2-4 炔基 和5-6元杂环基，其中所述杂环基基团可为未取代的或被1-3个取代基取代，所述取代基选 自卤素、氰基、-C (0) C1-4烷基、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、卤代&―4烷基、二卤代&―4烷基和 三卤代C 1-4烷基，以及ORa，其中Ra代表氢或&―4烷基。更优选地，R 2选自-以0)〇13、-(：(順2)=1 0H、-C02H、-CH 2-CO2H、Ch烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和5-6元杂环基，其中所述杂环基基团可为 未取代的或被1-3个取代基取代，所述取代基选自卤素、氰基Xh烷基、-C(O)C 1^烷基和 ORa，其中Ra代表氢或&-4烷基。
[0079] 在另一优选的实施方案中，在式(III)的化合物中，R1为5-6元杂环基，其中所述杂 环基基团被1-3个选自卤素、氰基和&-4烷基的取代基取代；
[0080] R2 选自-C (0) CH3、-C (NH2 )= N-OH、-CO2H 和-CH2-CO2H;和 [0081 ] 各R3、R4、R5和R6独立地选自氢和卤素。
[0082] 在另一优选的实施方案中，在式（III)的化合物中，R1为5元杂环基，其中所述杂环 基基团被2个独立地选自甲基和乙基的取代基取代；
[0083] R2 为-C (NH2) =N-OH;和
[0084] 各R3、R4、R5和R6独立地选自氢和卤素。
[0085]更优选地，用于本发明的ERi3激动剂是具有下式的化合物：
[0086]
[0087]或其盐或酯。最优选地，ERi3激动剂为式（I)的化合物（"化合物（I)"）或其盐或酯。
[0088] 用于本发明的ERi3激动剂可以为盐的形式。适合用于药物的化合物的盐是其中反 荷离子是药学上可接受的那些盐。
[0089] 合适的盐包括与有机的酸或碱或者无机的酸或碱所形成的那些盐。具体而言，根 据本发明与酸所形成的合适的盐包括与无机酸、强有机羧酸所形成的那些盐，所述强有机 羧酸例如具有1至4个未取代的或取代(例如，被卤素取代）的碳原子的链烷羧酸，例如饱和 或不饱和的二羧酸，例如羟基羧酸，例如氨基酸;或与有机磺酸所形成的那些盐，所述有机 磺酸例如未取代的或取代(例如被卤素取代）的(C 1-C4)-烷基磺酸或芳基磺酸。药学上可接 受的酸加成盐包括由盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、 乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、高氯酸、富马酸、马来酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、草酰乙酸、甲磺酸、 乙磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸、抗坏血酸、苹果 酸、苯二甲酸、天冬氨酸以及谷氨酸、赖氨酸和精氨酸所形成的那些盐。
[0090] 药学上可接受的碱盐包括铵盐、碱金属盐(例如钾和钠的那些盐）、碱土金属盐(例 如钙和镁的那些盐）以及与有机碱所形成的盐，所述有机碱例如二环己基胺、N-甲基-D-葡 糖胺、吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷、单低级烷基胺、二低级烷基胺或三低级烷基胺(例如乙 胺、叔丁胺、二乙胺、二异丙胺、三乙胺、三丁胺或二甲基丙胺），或单羟基低级烷基胺、二羟 基低级烷基胺或三羟基低级烷基胺，例如单乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺。可以进一步形成 相应的内盐。
[0091] 有机化学/药物化学领域的技术人员将理解，许多有机化合物可与它们在其中反 应或它们从其中沉淀或结晶的溶剂形成络合物。这些络合物被称为"溶剂合物"。例如，与水 的络合物被称为"水合物"。当药物物质结合溶剂如水时，溶剂合物(例如水合物）以化学计 量的量或非化学计量的量而存在于晶格中。定期筛选药物物质水合物的存在，因为水合物 可在药品制备过程的任何阶段、或在药物物质或剂型的贮藏时出现。溶剂合物记载于 S.Byrn等人，Pharmaceutical Research 12(7)，1995,954_954,和Water-Insoluble Drug Formulation，第二版，R.Liu，CRC Press，第553页，它们以引用的方式纳入本文。因此，本领 域技术人员将理解，用于本发明的ERP激动剂及其盐因此可以以溶剂合物的形式存在。适用 于药物的本发明的ER0激动剂化合物的溶剂合物是其中结合的溶剂是药学上可接受的那些 溶剂合物。例如，水合物是药学上可接受的溶剂合物的实例。
[0092]有机化学/药物化学领域的技术人员也将理解，ERi3激动剂可以以前药的形式提 供。前药可被定义为在给予受试者后，能够在体内转化(例如通过在血液中的水解作用）成 其具有医学作用的活性形式的化合物。药学上可接受的前药记载于T.Higuchi和V. Stella， Prodrugs as Novel Delivery Systems,A.C.S.Symposium Series( 1976)的卷 14; "Design of Prodrugs''ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985;以及在 Edward B . Roche , ed ., Bioreversible Carriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987中，它们以引用的方式纳入本文。
[0093]本发明中的活性剂(ER0激动剂和含铂抗癌药物(加上任何其他治疗剂））可以通过 相同的或不同的给药途径来给予。
[0094]为达到治疗效果所需要的ERi3激动剂的量将根据特定化合物，给药途径，接受治疗 的受试者(包括受试者的类型、物种、年龄、体重、性别和医学状况，以及受试者的肾功能和 肝功能），和待治疗的特定病症或疾病及其严重性而变化。普通医师可以容易地确定并开出 预防、抵抗或阻止病症进展所需的有效量的药物。
[0095] 当用于所标明的作用时，本发明的ERi3激动剂对于成人的口服剂量为约0.1 mg每千 克体重每天(mg/kg/天)至约5mg/kg/天，优选0 · 3mg/kg/天至3mg/kg/天，更优选0 · 5mg/kg/ 天至2.0mg/kg/天，且最优选0.75mg/kg/天至1.5mg/kg/天。因此对于成人的口服日剂量为 5mg至约350mg，优选20mg至200mg，更优选35mg至150mg，且最优选50mg至约IOOmg，例如 75mg。可以有利地以单日剂量给予本发明的ERP激动剂，或可将总日剂量以每日二次、三次 或四次的分剂量给药。对于口服给药，优选地以片剂形式或其他呈现形式提供组合物，所述 形式以含有约〇. Olmg至500mg活性成分，优选约Img至约IOOmg活性成分，例如0.1 mg、0.5mg、 1 · Omg、2 · 5mg、5 · Omg、10 · Omg、15 · Omg、25 · Omg、50 · Omg、IOOmg 或 500mg 活性成分的分离单位 来提供。
[0096] 如果使用静脉内给药，在恒速输注过程中，优选的给药速率将为约0. lmg/kg/min 至约10mg/kg/min。通常的输注时间是5分钟至90分钟。
[0097] 用于本发明的ERi3激动剂的药物制剂包括适合于口服给药，肠胃外(包括皮下、真 皮内、肌内、静脉内[推注或输注]和关节内）给药，吸入(包括可借助于各种类型的计量剂量 加压的气雾剂、雾化器或吹入器而产生的细颗粒粉剂或雾剂)给药，直肠给药，腹膜内给药 和局部(包括皮肤、口腔、舌下和眼内）给药的那些药物制剂。
[0098] ERP激动剂的制剂可以便利地以单位剂量形式呈现，并且可以通过任何药学领域 公知的方法来制备。
[0099]适合于口服给药的ERi3激动剂的制剂可以以分离单位，例如各自含有预定量的活 性成分的胶囊剂、扁囊剂(cachet)、丸剂或片剂；以粉剂或颗粒剂；以在含水液体或非水液 体中的溶液或悬浮液，例如酏剂、酊剂、悬浮剂或糖浆剂;或以水包油液体乳剂或油包水液 体乳剂而呈现。活性成分还可以以大丸药(bolus)、干药糖剂(electuary)或糊剂呈现。
[0100] 用于肠胃外给药的制剂包括水性无菌注射液和非水性无菌注射液，其可含有抗氧 化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期受试者的血液等渗的溶质；以及水性无菌混悬剂和非 水性无菌混悬剂，它们可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以以单位剂量或多剂量容器(例 如密封的安瓿瓶和小瓶)呈现，并且可以贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立 即加入无菌液体载体(例如盐水或注射用水）。临时注射液和临时注射悬浮液可由之前所描 述的那类无菌粉剂、颗粒剂和片剂来制备。用于肠胃外给药的示例性组合物包括可注射溶 液或可注射悬浮液，其可含有例如合适的无毒的、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如甘露 醇、1，3_ 丁二醇、水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液或其他合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂， 包括合成的甘油单酯类或甘油二酯类，以及脂肪酸，包括油酸或Cremaphor。
[0101] 用于经鼻给药、气雾剂给药或吸入给药的示例性组合物包括盐水溶液，其可含有 例如苯甲醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂以提高生物利用率，和/或其他增溶剂或分散 剂，例如本领域公知的那些。
[0102] 用于直肠给药的制剂可以以含常用载体的栓剂呈现，所述载体例如可可脂、合成 甘油酯或聚乙二醇。这样的载体在常温下通常为固体，但是在直肠腔中液化和/或溶解以释 放药物。
[01 03]用于在口腔中局部给药(例如经颊给药或舌下给药）的制剂包括锭剂（lozenges)， 其包含混于调味基质中的活性成分，所述调味基质例如蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；以及软 锭剂(pastilles)，其包含混于基质中（例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)的活性成分。用 于局部给药的示例性组合物包括局部载体，例如Plastibase(用聚乙烯凝胶化的矿物油）。
[0104] 优选的ERP激动剂的单位剂量制剂是如上文所述含有有效剂量的ERP激动剂的那 些制剂，或含有其适当部分的那些制剂。
[0105] 应理解，除了上文特别提到的成分以外，考虑到所讨论的制剂类型，用于本发明的 制剂可以包括本领域的其他常规试剂，例如适于口服给药的那些试剂可包括调味剂。
[0106] 含铂抗癌药物
[0107] 含铂抗癌药物是用于治疗癌症的含有铂的化疗剂。认为它们作为单加成物引起 DNA的交联，链间交联、链内交联或DNA蛋白交联。它们包括，但不限于，顺铂、卡铂、奥铂 (oxaplatin)、奥沙利铂、沙铂、吡铂、奈达铂、三铂（triplatin)、奥马铂、四铂、洛铂 (]^(^]^1：；[11)和磷钼类化11(^1^131：；[118)，例如顺钼、卡钼、奥钼、奥沙利钼、沙钼、吡钼、奈 达铂或三铂、奥马铂、四铂和磷铂类。这些化合物可以通过本领域已知的方法来制备。
[0108] 用于本发明的含铂抗癌药物可以选自顺铂、卡铂、奥铂、奥沙利铂、沙铂、吡铂、奈 达铂、三铂、奥马铂、四铂、洛铂和磷铂类，例如顺铂、卡铂、奥铂、奥沙利铂、沙铂、吡铂、奈达 铂或三铂、奥马铂、四铂和磷铂类。优选地，含铂抗癌药物选自顺铂或卡铂。最优选地，含铂 抗癌药物是顺铂。
[0109] 用于本发明的含铂抗癌药物的药物制剂为，例如，用于静脉内给药的制剂(特别是 在顺钼、卡铂和奥沙利铂的情况下)或用于□服给药的制剂(特别是在沙铂的情况下）。 [0110]含铂抗癌药物的最佳剂量取决于给药时间表，所选择的特定药物的效力，患者的 年龄、大小、性别和状态，疾病的性质和严重性，以及其他相关的医学因素和生理学因素。因 此，药学上有效的量可容易地由看护者或临床医师来确定。通常，选择适合量的含铂抗癌药 物以达到化疗效果。在本发明中，含铂抗癌药物的静脉内剂量通常含有约IOmg至约500mg活 性成分，优选约50mg至约250mg活性成分。
[0111] 通常经静脉内（IV)给予含铂抗癌药物，例如顺铂和卡铂。在这种情况下，历时约10 分钟至约420分钟，例如约30分钟至约300分钟，例如约30分钟至约180分钟，例如约120分钟 的时间段给药。当含铂抗癌药物是顺铂时，通常历时约120分钟给药。例如，历时约120分钟 进行75mg/m 2静脉内输注。通常的输注速率为约0.005mg/kg/min至约0.05mg/kg/min。含钼 抗癌药物的有效静脉内剂量通常为约0. lmg/kg体重至约50mg/kg体重，优选约lmg/kg体重 至约5mg/kg体重。
[0112] 本发明中的含铂抗癌药物对于成人的口服剂量将为约Img每千克体重每天(mg/ kg/天）至约100mg/kg/天，优选2mg每千克体重每天(mg/kg/天）至10mg/kg/天，且最优选 3mg/kg/天至 6mg/kg/天。
[0113] 例如，可以以在医师案头参考(Physicians'Desk ReferenceJDR)中指示的量，或 者由本领域普通技术人员以其他方式确定的量来使用含铂抗癌药物。例如，对于成人而言， 通常的顺铂静脉内剂量为每天70-100mg/m2(相当于每天约125-185mg的剂量），其可以重复 最长达3天。例如，对于患有恶性胸膜间皮瘤的成人而言，通常的顺铂单剂量为历时2小时输 注7 5mg/m2。对于MPM而言，顺铂的标准治疗剂量为在21天周期的第一天历时2小时输注 75mg/m 2顺铂，随后休息20天，在这段休息时间内不再给予顺钼。根据MPM的阶段可将所述周 期重复一次或数次。
[0114] 在一个实施方案中，本发明的给药方案提供了用于在患者中治疗间皮瘤(例如用 于治疗MPM)的ERf3激动剂（例如化合物（I))和顺铂，其中ERf3激动剂以5mg至约350mg，优选 20mg至200mg，更优选35mg至150mg，且最优选50mg至IOOmg，例如75mg的剂量给药，然后在最 长达24小时的时间t后，例如在15分钟、30分钟、1小时、90分钟、2小时、4小时、8小时、16小时 或24小时后，在21天周期的第1天历时2小时输注75mg/m 2剂量的顺铂，随后休息20天，在这 段休息时间内不再给予顺铂。任选地，也可以在给予顺铂后的21天周期期间的一天或更多 天(例如也可在21天周期的第2天至第7天，或也可在21天周期的第2天至第21天)给予ER^t 动剂。根据MPM的阶段可将所述周期重复一次或数次。
[0115] 当含铂抗癌药物是卡铂时，其通常历时约30分钟给药。卡铂的通常剂量为在血浆 浓度-时间曲线(AUC)下的2至8个靶面积，更通常历时约30分钟静脉内输注4至6个AUC。卡铂 AUC的单位是mg卡钼/mL · min。可以使用Calvert等人(Calvert，A.H.等人，J Clin Oncol (1989)7:1748-56)的方法来计算卡铂的精确剂量。该方法为:卡铂剂量（以毫克计）=AUCX (肾小球滤过率+25)，即如果AUC = 5,卡铂剂量（以毫克计）=5 X (肾小球滤过率+25)。肾小 球滤过率基于肌酸酐清除率、EDTA清除率或Cockcroft-Gault公式(例如在Cockcroft D， Gault MD·Nephron，16:31-41，1976 ;Winter，Μ·Α·等人，Pharmacotherapy(2012)32(7): 604/12;Brown，D.L.等人，Ann Pharmacother(2013)47(7-8): 1039-44中所描述的；或参见 iSihttp：//nephron. com/cgi-bin/CGSI.cgi,http://www.clinicalculator.com/english/ nephrology/cockroft/cca.htm，或http://www.clinicalculator.com/english/ nephrology/cockroft/cca.htm上的计算工具）。
[0116] 对于患有恶性胸膜间皮瘤的成人，卡铂剂量的实例是在21天周期的第一天历时30 分钟输注4至6个AUC(例如5个AUC)，随后休息20天，在这段休息时间内不再给予卡铂(参见， 例如，Santoro Α·等人，J Thorac 0ncol(2008)3:756_63;Ceresoli G.L.等人，J Clin Oncol (2006)24:1443;和http: //chemoregimen · com/Mesothelioma-c-47-57 .html)。根据 MPM的阶段可将所述周期重复一次或数次。
[0117] 在一个实施方案中，本发明的给药方案提供了用于在患者中治疗间皮瘤(例如用 于治疗MPM)的ERP激动剂（例如化合物（I))和卡铂，其中ERP激动剂以5mg至约350mg，优选 20mg至200mg，更优选35mg至150mg，且最优选50mg至IOOmg，例如75mg的剂量给药，然后在最 长达24小时的时间t后，例如在15分钟、30分钟、1小时、90分钟、2小时、4小时、8小时、16小时 或24小时后，在21天周期的第1天历时30分钟输注5个AUC剂量的卡铂，随后休息20天，在这 段休息时间内不再给予卡铂。任选地，也可以在给予卡铂后的21天周期期间的一天或更多 天（例如也在21天周期的第2天至第7天，或也在21天周期的第2天至第21天）给予 剂。根据MPM的阶段可将所述周期重复一次或数次。
[0118] 应理解，除了上述特别提到的成分之外，考虑到所讨论的制剂的类型，本发明的制 剂可以包括本领域中的其他常规试剂，例如适于口服给药的那些制剂可以包括调味剂。
[0119] 其他治疗剂
[0120] 虽然在本发明的治疗中，ERP激动剂和含铂抗癌药物可被用作仅有的活性剂，但是 也可以将一种或多种其他治疗剂与ERP激动剂和含铂抗癌药物组合使用。所述一种或多种 其他治疗剂可与ERP激动剂和含铂抗癌药物之一或两者同时使用、依序使用或分开使用。这 样的其他治疗剂可为其他ERP激动剂，或者适用于预防或治疗癌症的不同药剂，例如化疗 剂。
[0121] 特别地，本发明的ERP激动剂和含铂抗癌药物可以与其他适用于治疗间皮瘤的试 剂(例如培美曲塞)组合使用。这种组合的单独组分可以在治疗过程中的不同时间点分别给 予，或以分开的或单一的组合物形式同时给予。
[0122] 在本发明的某些实施方案中，例如，在其中含铂抗癌药物是顺铂的实施方案中，给 予其他化疗药物。优选所述其他化疗药物是培美曲塞。例如，可以以在医师案头参考(PDR) 中指示的量，或者由本领域普通技术人员以其他方式确定的量给予培美曲塞。例如，在连同 顺铂一起的21天周期的第一天，历时10分钟静脉内输注给予500mg/m 2培美曲塞，在培美曲 塞给药结束后大约30分钟，开始以75mg/m2的剂量历时2小时输注顺铂。随后休息20天，在这 段休息时间内不再给予培美曲塞或顺铂。根据MPM的阶段可将所述周期重复一次或数次。这 是恶性胸膜间皮瘤的治疗标准。
[0123] 在 Vo g e I z an g，N · J ·等人，J CI i n On c 〇 1 ( 2 0 0 3 ) 2 1 : 2 6 3 6 和h 11 p : / / chemoregimen · com/Me so the lioma-c-47-57 .html中进一步描述了使用顺钼和培美曲塞的 治疗标准。除了其他治疗剂培美曲塞以外，在培美曲塞的首剂量之前1周直到培美曲塞的最 终剂量后21天可以给予维生素补充剂(每9周叶酸350-1000mcg Po qd;维生素 B12 1000 mcg I.Μ.)。在给予培美曲塞的前一天、当天和后一天，也可以每天给予两次4mg地塞米松(地卡 特隆）。
[0124] 在本发明的某些实施方案中，例如，在其中含铂抗癌药物是卡铂的实施方案中，给 予其他化疗药物。优选所述其他化疗药物是培美曲塞。例如，在连同卡铂一起的21天周期的 第一天，历时10分钟静脉内输注给予500mg/m 2培美曲塞，在培美曲塞给药结束后大约30分 钟，开始以5个AUC的剂量历时30分钟输注卡铂。随后休息20天，在这段休息时间内不再给予 培美曲塞或卡铂。根据MPM的阶段可将所述周期重复一次或数次。在Ceresoli G.L.等人，J Cl in Oncol(2006);24:1443和http://chemoregimen·com/MesotheIioma-c-47-57·html中 进一步描述了使用卡铂和培美曲塞的间皮瘤治疗。除了其他治疗剂培美曲塞以外，在培美 曲塞的首剂量之前一周直到培美曲塞的最终剂量后21天，可以给予维生素补充剂(每9周叶 酸350-1000mcg po qd;维生素 B12 1000 mcg I ·Μ·)。在给予培美曲塞的前一天、当天和后一 天，也可以每天给予两次地塞米松(地卡特隆)4mg。
[0125] 在一个实施方案中，本发明的给药方案提供了用于在患者中治疗间皮瘤(例如用 于治疗MPM)的ERP激动剂(例如化合物（I))和顺铂或卡铂，以及培美曲塞，其中在21天周期 的第1天以5mg至约350mg，优选20mg至200mg，更优选35mg至150mg，且最优选50mg至I OOmg， 例如75mg的剂量给予ERP激动剂，然后在最长达24小时的时间t后，例如在15分钟、30分钟、1 小时、90分钟、2小时、4小时、8小时、16小时或24小时后，历时2小时输注50-100mg/m 2 (例如 75mg/m2)剂量的顺铂或历时30分钟输注4-7.5 (例如5或6)个AUC剂量的卡铂，该输注在历时 10分钟静脉内输注给予500mg/m2培美曲塞后大约30分钟开始。随后休息20天，在这段休息 时间内不再给予培美曲塞或顺铂/卡铂。任选地，也可以在给予顺铂或卡铂后的21天周期期 间的一天或更多天(例如也可在21天周期的第2天至第7天，或也可在21天周期的第2天至第 21天)给予ERi3激动剂。根据MPM的阶段可将所述周期重复一次或数次。
[0126] 在一个实施方案中，本发明的给药方案提供了用于在患者中治疗间皮瘤(例如用 于治疗MPM)的ERP激动剂(例如化合物(I))，以及顺铂和培美曲塞，其中在21天周期的第1天 以5mg至约350mg，优选20mg至200mg，更优选35mg至150mg，且最优选50mg至I OOmg，例如75mg 的剂量给予ERi3激动剂，然后在最长达24小时的时间t后，例如在15分钟、30分钟、1小时、90 分钟、2小时、4小时、8小时、16小时或24小时后，历时2小时输注75mg/m 2剂量的顺铂，该输注 在历时10分钟静脉内输注给予500mg/m2培美曲塞后大约30分钟开始。随后休息20天，在这 段休息时间内不再给予培美曲塞或顺铂。任选地，也可以在给予顺铂后的21天周期期间的 一天或更多天（例如也可在21天周期的第2天至第7天，或也可在21天周期的第2天至第21 天)给予ERi3激动剂。根据MPM的阶段可将所述周期重复一次或数次。
[0127] 在一个实施方案中，本发明的给药方案提供了用于在患者中治疗间皮瘤(例如用 于治疗MPM)的ERP激动剂(例如化合物(I))，以及卡铂和培美曲塞，其中在21天周期的第1天 以5mg至约350mg，优选20mg至200mg，更优选35mg至150mg，且最优选50mg至I OOmg，例如75mg 的剂量给予ERi3激动剂，然后在最长达24小时的时间t后，例如在15分钟、30分钟、1小时、90 分钟、2小时、4小时、8小时、16小时或24小时后，历时30分钟输注5个AUC剂量的卡铂，该输注 在历时10分钟静脉内输注给予500mg/m 2培美曲塞后大约30分钟开始。随后休息20天，在这 段休息时间内不再给予培美曲塞或卡铂。任选地，也可以在给予卡铂后的21天周期期间的 一天或更多天（例如也可在21天周期的第2天至第7天，或也可在21天周期的第2天至第21 天)给予ERi3激动剂。根据MPM的阶段可将所述周期重复一次或数次。
[0128] 在其他化疗药物是培美曲塞的实施方案中，在给予培美曲塞的前一天、当天和后 一天，也可以给予地塞米松。为了降低毒性，也可指导采用培美曲塞治疗的患者每天服用低 剂量的口服叶酸制剂或含有叶酸的多种维生素。例如，可以从培美曲塞的首剂量前7天开 始，持续整个治疗过程，并在培美曲塞的最终剂量后21天中，每日一次经口服给予叶酸 400mcg至lOOOmcg。在培美曲塞的首剂量前一周和从那之后的每3个周期期间，患者也可以 接受一次维生素 B12的肌肉注射。可以在给予培美曲塞的同一天给予随后的维生素 B12注 射。因此，在治疗包括给予其他化疗药物培美曲塞的本发明的实施方案中，所述治疗可进一 步包括给予如下的一种或多种：地塞米松，叶酸制剂，含有叶酸的多种维生素，和维生素 B12〇
[0129]例如，可以以在医师案头参考(PDR)中指示的那些量，或者由本领域普通技术人员 以其他方式确定的量使用上述其他治疗剂。
[0130]间皮瘤的其他治疗方式可以与本发明结合使用，例如放疗。除了外科手术，例如胸 膜切除术/皮质剥除术(P/D)或胸膜外肺切除术(EPP)，可以使用本发明的治疗以除去肿瘤， 或者如果液体积聚在胸部或腹部，可以使用胸腔穿刺术/穿刺抽液术或胸膜固定术。
[0131 ]在本发明中被用作其他试剂的其他ERP激动剂可以是在以下任一篇文献中被描述 为ER0激动剂的化合物：WO 2002/072561、W0 03/044006、WO 2004/094401、W0 2006/08871、 WO 2006/019831、W0 2006/044176、W0 2006/062876、W0 2007/062876、EP 2143432、W0 2008/033894、W0 2008/043567、W0 2009/012191、W0 2009/012954、W0 2009/055734、W0 2009/124968、W0 2009/127686、W0 2010/031852、W02011/042473、W0 2011/042474、W0 2011/042475、W0 2011/042477和WO 2013/017619。
[0132] 用于本发明中的其他化疗剂可以选自其他含铂抗癌药物(例如选自顺铂、卡铂、奥 铂、奥沙利铂、沙铂，啦铂、奈达铂和三铂）；烷化剂（例如氮芥（包括二氯甲基二乙胺 (mechlorethamine)、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和白消安），亚硝基脲类 (包括亚硝基脲类，包括N-亚硝基-N-甲基脲(MNU )、卡莫司汀(BCNU )、洛莫司汀(CCNU)和司 莫司汀(MeCCNU)、福莫司汀和链脲菌素），四嗪类(包括达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺），氮 丙啶类(包括噻替派、丝裂霉素 C和地吖醌(AZQ))，以及非典型烷化剂(包括丙卡巴肼和六甲 嘧胺））；抗代谢药(例如抗叶酸剂(包括培美曲塞和甲氨蝶呤），氟嘧啶(包括氟尿嘧啶和卡 培他滨），脱氧核苷类似物(包括阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、阿扎胞苷、氟达拉滨、奈拉 滨、克拉屈滨、氯法拉滨和喷司他丁)和巯基嘌呤(包括硫鸟嘌呤和巯嘌呤））；抗微管剂(例 如长春花生物碱(包括长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁）和紫杉烷类(包 括紫杉醇、依托泊苷和替尼泊苷））；拓扑异构酶抑制剂（例如伊立替康、托泊替坎、多柔比 星、米托蒽醌、新生霉素、美巴龙(merbarone)和阿柔比星）；其他酶抑制剂(例如硼替佐米、 伊马替尼和丙卡巴肼）；和细胞毒性抗生素类(例如蒽环类(包括多柔比星、柔红霉素、表柔 比星、伊达比星、吡柔比星、阿柔比星和米托蒽醌)及放线菌素、博莱霉素、普卡霉素和丝裂 霉素)）。
[0133] 间皮瘤
[0134] 如本文所使用的术语"间皮瘤"包括但不限于上皮样间皮瘤、肉瘤样间皮瘤以及混 合性(双相性）间皮瘤。间皮瘤的类型包括但不限于，胸膜恶性间皮瘤、腹膜恶性间皮瘤、心 包恶性间皮瘤和鞘膜恶性间皮瘤。
[0135] 本发明的治疗适用于治疗间皮瘤，例如上皮样间皮瘤、肉瘤样(纤维性）间皮瘤以 及混合性(双相性）间皮瘤。本发明的治疗特别适用于治疗上皮样和混合性间皮瘤。本发明 的治疗适用于治疗例如恶性胸膜间皮瘤、恶性腹膜间皮瘤、恶性心包间皮瘤和恶性鞘膜间 皮瘤。本发明的治疗特别适用于治疗恶性胸膜间皮瘤。
[0136] 如本文所使用的，"患者"是易患有间皮瘤的任何哺乳动物(例如，人）。本发明所用 的化合物特别用于治疗人类患者。
[0137] 时间，t
[0138] 在本发明的治疗中，首先给予患者ERP激动剂，然后在最长达24小时的时间t后，给 予含铂抗癌药物。
[0139] 在某些优选的实施方案中，t为最长达约16小时;优选最长达约8小时;更优选最长 达约4小时;最优选最长达约2小时。
[0140] 在某些优选的实施方案中，t为约15分钟至约24小时；约15分钟至约16小时;优选 约30分钟至约8小时；更优选约30分钟至约4小时；更优选约1小时至约2小时；最优选约2小 时。
[0141 ]在包括给予ERP激动剂、含铂抗癌药物和培美曲塞的实施方案中，优选至少在给予 ERP激动剂后最长达约24小时给予含铂抗癌药物。在更优选的实施方案中，至少在给予ERP 激动剂后最长达约4小时给予含钼抗癌药物，且最优选在给予ERP激动剂后最长达约2小时 给予含铂抗癌药物。在这样的实施方案中，优选在给予含铂抗癌药物之前给予培美曲塞，例 如约10分钟至约60分钟之前，且更优选约30分钟前。优选地，所述含铂抗癌药物是顺铂或卡 铂。
[0142] 在包括给予ERP激动剂以及顺铂和培美曲塞两者的实施方案中，优选至少在给予 ERP激动剂后最长达约24小时给予顺铂。在更优选的实施方案中，至少在给予ERP激动剂后 最长达约4小时给予顺钼，且最优选在给予ERP激动剂后最长达约2小时给予顺钼。在这样的 实施方案中，优选在给予顺铂之前给予培美曲塞，例如约10分钟至约60分钟之前，且更优选 约30分钟前。
[0143] 在包括给予ERP激动剂以及顺铂和培美曲塞两者的实施方案中，优选至少在给予 ERP激动剂后约15分钟至约24小时给予顺铂。在更优选的实施方案中，至少在给予 剂后约30分钟至约4小时给予顺铂，且最优选在给予ERi3激动剂后约2小时给予顺铂。
[0144] 在包括给予ERP激动剂以及卡铂和培美曲塞两者的实施方案中，优选至少在给予 ERP激动剂后最长达约24小时给予卡铂。在更优选的实施方案中，至少在给予ERP激动剂后 最长达约4小时给予卡铂，且最优选在给予ERi3激动剂后最长达约2小时给予卡铂。在这样的 实施方案中，优选在给予卡铂之前给予培美曲塞，例如约10分钟至约60分钟之前，且更优选 约30分钟前。
[0145] 在包括给予ERP激动剂以及卡铂和培美曲塞两者的实施方案中，优选至少在给予 ERP激动剂后约15分钟至约24小时给予卡铂。在更优选的实施方案中，至少在给予 剂后约30分钟至约4小时给予卡铂，且最优选在给予ERf3激动剂后约2小时给予卡铂。
[0146] 在某些优选的实施方案中，所述ERP激动剂是化合物（I)，所述含铂抗癌药物是顺 铂，且t是，例如，最长达8小时、最长达4小时、最长达2小时或约2小时，且任选地还给予培美 曲塞。
[0147]在另一个实施方案中，所述ERi3激动剂是化合物（I)，所述含铂抗癌药物是卡铂，且 t是，例如，最长达8小时、最长达4小时、最长达2小时或约2小时，且任选地还给予培美曲塞。
[0148]在某些优选的实施方案中，首先将ERP激动剂给予患者，然后在最长达24小时，例 如最长达约16小时；最长达约8小时；最长达约4小时；或约2小时的时间t后，给予含铂抗癌 药物，且任选地给予培美曲塞;随后，在给予含钼抗癌药物后的一天或多天再给予一剂或多 剂ERi3激动剂。例如，可在给予含铂抗癌药物后最长达20天(且包括20天)每日给予 剂。
[0149] 在某些优选的实施方案中，首先将ERP激动剂给予患者，然后在15分钟至24小时， 例如30分钟至16小时;30分钟至8小时；1小时至4小时;或约2小时的时间t后，给予含铂抗癌 药物，且任选地给予培美曲塞;随后，在给予含钼抗癌药物后的一天或多天再给予一剂或多 剂ERi3激动剂。例如，可在给予含铂抗癌药物后最长达20天(且包括20天)每日给予 剂。
[0150] 实施例
[0151] 以下材料和方法适用于下面的一个或多个实施例。
[0152] 材料和方法
[0153] 试剂和抗体
[0154] 特异性针对α-微管蛋白、PARPl的单克隆抗体以及特异性针对ERf3的多克隆抗体购 自 Santa Cruz Biotechnology(Santa 〇1'112，〇厶，1]3厶）。磷酸-厶1(1'(卩36『473)来自〇611 Signaling Technology(Beverly，MA，USA)，抗小鼠和抗兔IgG过氧化物酶缀合的抗体和化 学试剂来自 Sigma-Aldrich(St LouisjCMJSAhECL来自 Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala，Sweden)。硝酸纤维素膜和蛋白测定试剂盒来自Bio-Rad (Hercules，CA，USA)。培 养基、血清、抗生素和LipofectAMINE转染试剂来自 Invitrogen(CarIsbad，CA，USA)。ERP选 择性激动剂化合物（I)可以按照WO 2009/127686中所记载的方法来制备。顺铂来自EBEWE Arzneimittel Ges.m.h.H(Unterach，澳大利亚）或EBEWE Italia SRL(Roma，意大利）。培美 曲塞来自EliLi Ily (Houten，荷兰）。
[0155] 细胞培养和转染
[0156] 来自上皮样 MPM 的 REN 细胞系由 Albelda S.M.博士（University of Pennsy I vania ,Philadelphia; PA，USA)分离、表征和提供。双相 MST0-21IH 和间皮MET5A 细胞 系从意大利Istituto Scientifico Tumori(IST)Cell_bank，Genoa获得;MMB和MMP细胞系 来自患有M P M的患者的胸腔积液并已被稳定在培养物中（C a c c i 〇 11 i P等人，P r 〇 c N a 11 Acad Sci U S A 2001 ;98:12032-7;Pinton G.等人，Cancer Res 2009;69:4598-604); H2 5 9 6细胞系是由H. I. P a s s博士从得自患有切除的M P M的患者的外科手术样本中制备的 (Pass H.I.等人，Ann Thorac Surgl995;59(4):835-44)。细胞在补充有 10%FBS、100μg/ml 链霉素和lOμg/ml青霉素的RPMI培养基中在37°C下在含有5%⑶2的潮湿环境中生长。通过 使用来自 Stratagene(La Jolla，CA，USA)的Mycoplasma PlusTM PCR Primer Set试剂盒来 排除支原体感染。对于MST0-211H/ERi3细胞，按照制造商的描述，使用LipofectAMINE试剂， 采用表达人野生型ER0的pCNX2质粒(Addgene ,Cambridge，MA，USA)瞬时转染在组织培养皿 中生长至80 %融合的细胞。使用来自Sigma(St Loui s，MO，USA)的ER0特异性shRNA慢病毒质 粒(pLKO· I-puro)或来自Qiagen(Hilden，Germany)的特异性siRNA实现了基因沉默。
[0157] 增殖测定
[0158] 将细胞以10\104细胞/孔的密度在6孔板中接种于补充有10^^85、10(^8/1111链霉 素和lOμg/ml青霉素的RPMI培养基中，并在37°C下在含有5%⑶ 2的潮湿环境中孵育过夜以 使细胞粘附。处理后，使细胞受胰蛋白酶作用并用台盼蓝染色。在染色后5分钟内，在Bilrker 血球计数器中对认为的活细胞(未染色细胞)的数量进行计数。
[0159] 洗掉实验
[0160] 将细胞培养物采用化合物(I)预处理1-16小时(取决于实验），随后洗涤，然后补充 普通生长培养基土顺铂、培美曲塞或顺铂/培美曲塞。总孵育时间为24-72小时（取决于实 验）。对照培养物保留在不添加药物的普通生长培养基中。按照增殖测定所述的方法测定活 细胞的数量。
[0161] 追加实验
[0162] 在追加实验中，不洗掉第一药物，将第二药物直接加入细胞培养基中。总孵育时间 为24小时。对照培养物保留在不添加药物的普通生长培养基中。按照增殖测定所述的方法 测定活细胞的数量。
[0163] 细胞裂解和免疫印迹
[0164] 采用含有新鲜加入的蛋白酶抑制剂（10μg/ml亮抑蛋白酶肽、4μg/ml胃蛋白酶抑制 剂和0.1 单位/ml抑肽酶）的 I %NP-40裂解缓冲液（I %NP-40、150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8、5mM EDTAUOmM NaF、IOmM Na4P2〇7、0.4mM Na3V〇4)来提取细胞。对于从组织中提取蛋 白，使用Potter-Elvehjem匀浆器装置，在1%ΝΡ-40裂解缓冲液中将约IOOmg每种样品匀浆 化。在4°C13,000 Xg下离心裂解物10分钟，收集上清液并用Bio-Rad蛋白测定方法来测定蛋 白浓度。
[0165] 在还原条件下通过SDS-PAGE分离蛋白。SDS-PAGE后，将蛋白转移至硝酸纤维素，与 特异性抗体反应，然后采用过氧化物酶缀合的二级抗体和化学发光ECL试剂进行检测。使用 GS 250 Molecular Image(Bio-Rad)进行光密度分析。
[0166] 细胞周期分析
[0167] 对于细胞周期/凋亡分析，在组织培养皿中接种5 X IO5个细胞并用100μΜ顺铂处理 24小时或用IOnM化合物（I)预处理2小时，随后洗掉并在普通培养基±100μΜ顺铂中在37°C 下、在5%C02空气中继续生长额外的24小时。孵育后，将分离的细胞和悬浮的细胞收集在完 全RPMI中，并在500 X g下离心10分钟。用PBS洗涤细胞沉淀，在4°C下将其固定在冰冷的75% 乙醇中，在37°C下用100mg/mL RNAse A处理1小时，用25yg/mL碘化丙啶染色，最后利用流式 细胞仪FACS(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)和Modfit软件（Verity Software House，Topsham，ME，USA)来分析。
[0168] 体内实验
[0169] 动物。CDl裸鼠（雄性，6周龄;Charles River，Calco,意大利)接受腹膜内（i.p.)注 射于0.5mL RPMI培养基中的2 X IO6个荧光素酶转染的REN细胞。在麻醉和腹膜内注射0.3mL 的 15mg/mL D-焚光素后，使用In Vivo Imaging System(lVlS?)'系统 100系列（Xenogen Corporation，Hopkinton，MA，USA)监测发光细胞的肿瘤尺寸和定位。使用Living Image软 件(Xenogen Corporation)在肿瘤位点周围确定目的区域，并将其定量为总光子计数。在接 种(治疗开始的天)后的第15天，获得肿瘤尺寸的值，以一个治疗组内所有动物的平均值计， 减去各个每周测量的发光信号。为了评估治疗毒性，在治疗开始时和治疗结束时称量小鼠 的重量。在治疗后20天，处死小鼠并进行尸检。体内实验经Istituto Scientifico Tumori (Genoa，意大利)伦理委员会批准，并符合相关规定的标准。将小鼠保持在无菌条件下并在 无菌条件下进行处理，并且允许其随意获得食物和水。
[0170] 给药。经过15天形成可通过IVIS?成像检测的肿瘤结节。然后将小鼠称重并分为 十只动物的治疗组。治疗方案从第15天至第35天实施，并且通过IVXS?成像每周对小鼠进 行分析以评估肿瘤生长。使用一个剂量的化合物（I)(l〇mg/kg/天）。将化合物（I)溶解在溶 媒(5 % DMS0/40 % PEG 400/55 %水）中，并通过皮下给药的方式每天给予一次（1-21天）。在 第4天和第11天分别经皮下给予5mg/kg顺钼溶液(EBEWE Italia srl，Roma，意大利），并且 在第5-9天和第12-16天分别经皮下注射150mg/kg培美曲塞(溶于等渗盐水中）（Eli Lilly， Houten，荷兰）。给予未治疗的动物空白溶媒。在第35天，对来自四组的小鼠实施安乐死并进 行尸检。切除在腹膜中生长的肿瘤，并将一部分肿瘤组织立即冷冻并储存在-80°C下用于以 后的分析。
[0171] 统计分析
[0172] 通过单因素方差分析和学生t检验来进行示差分析的统计评估。统计学显著性的 阈值设定在 Ρ^?〇·〇5。利用R Core Team .R:A language and environment for statistical computing.R Foundation for Statistical Computing?Vienna?Austria? 2012 ISBN 3-900051-07-0进行体内实验的统计分析。为了比较不同的组，使用了非参数 Kruskal-WalIis检验;如果发现差异是显著的(P<0.05)，随后用WiIkoxon秩和检验进行配 对比较。
[0173] 实施例1:化合物(I)对MPM细胞增殖的影响
[0174] (a)使用上述增殖测定，在ER即日性REN间皮瘤细胞上测试不同剂量的化合物（I) (范围I-IOOnM)的生长抑制作用。结果示于图IA中。化合物（I)以剂量依赖性方式显著地(P 彡0.05)降低了细胞生长和存活，在IOnM下效力最高。
[0175] (b)评估了化合物（I) (IOnM)作为单一药剂在24小时和48小时时在以下细胞中的 抗增殖活性:非恶性间皮MET5A细胞，恶性间皮瘤细胞REN、MMB、H2596和MST0-211H，被瞬时 转染以表达人ER0的MST0-211H细胞(MSTO_211H/ER0)，以及其中已经用ER0特异性siRNA敲 除了ER0的恶性间皮瘤细胞REN和MMB(REN/siRNA ER0和MMB/siRNA ER0)。结果示于图IB中。
[0176] 化合物（I)显著地(p彡0.05)抑制REN细胞和MMB细胞的增殖，而在MET5A细胞中没 有观察到抑制作用，尽管E邸的高内源性水平。这可能与它们的非恶性表型有关。由于H2596 细胞表达非常低水平的ERf3，H2596细胞对化合物（I)的响应弱。ERf3阴性MST0-211H细胞对化 合物(I)治疗无响应。然而，采用ERf3表达载体对MST0-211H细胞进行的瞬时转染增加这些细 胞对化合物(I)的敏感性。
[0177] 实施例2:化合物(I)在体外和体内对顺铂/培美曲塞的有效性的影响
[0178] (a)与普通培养基(对照）、仅化合物（I)以及顺铂/培美曲塞相比，在REN细胞中研 究了将化合物（I)(IOnM)加入顺铂/培美曲塞化疗组合(在它们各自的IC 5q浓度的）中的生长 抑制作用。按照增殖测定所述的方法测定了活细胞的数量。测定了 24小时后的细胞存活。结 果不于图2A中。
[0179] 化合物（I)/顺铂/培美曲塞(浓度分别为10ηΜ/100μΜ/22μΜ)的三联组合优于单独 的化合物(I)或单独的顺铂/培美曲塞治疗，这表明化合物（I)增强了顺铂/培美曲塞治疗的 效果。
[0180] (b)还在间皮瘤体内小鼠模型中评估了化合物（I)对顺铂/培美曲塞组合的影响。 对六周龄CD 1雄性裸鼠腹膜内接种2 X IO6个REN细胞(4组，每组10只动物）。在接种前，将MPM 细胞采用携带荧光素酶基因的慢病毒载体转染，以允许在活的小鼠内成像。在第15天时（当 在所有动物组中在腹膜腔中的肿瘤发生率为100%时），开始采用溶媒、化合物(I)、顺铂/培 美曲塞或化合物（I)/顺铂/培美曲塞治疗，并持续21天，如图2B中所示。通过皮下注射给予 IOmg/kg/天的化合物（I)。对未治疗的动物经皮下注射空溶媒。第4天和第11天采用5mg/kg 顺铂治疗两组，随后采用150mg/kg培美曲塞单独地或与化合物（I)组合治疗5天(第5-9天和 第12-16天）。在第35天处死小鼠，切割肿瘤并立即冷冻。结果示于图2C和2D中。
[0181] 在10天内，与溶媒对照相比，采用化合物（I)治疗的小鼠与顺铂/培美曲塞治疗组 产生了相似的肿瘤尺寸的减小(数据未示出）。治疗20天后，与溶媒组、化合物（I)组以及顺 铂/培美曲塞组相比，在采用化合物（I)/顺铂/培美曲塞治疗的组中观察到了统计学上显著 的肿瘤生长的减少。因此，在体内采用化合物（I)结合顺铂/培美曲塞的治疗比任一个的单 独治疗具有更高的效力，并且在治疗期结束时，与溶媒治疗的动物相比，产生了显著降低的 肿瘤负荷。此外，化合物（I)/顺铂/培美曲塞的三联组合缩小了肿瘤体积，甚至低于在治疗 开始时的肿瘤体积。采用化合物(I)的治疗不具有毒性，如通过在给药期间监测小鼠体重的 变化所评估的。因此，在实施例2(a)中所示出的体外生长抑制作用转化为在小鼠中的体内 抗肿瘤发生活性。
[0182] 实施例3:化合物（I)对REN细胞生长的影响
[0183] (a)在REN细胞中研究了短暂暴露于化合物（I) (IOnM) (1、2、4、8、16和24小时）的生 长抑制作用。将细胞培养物用化合物（I)预处理1-16小时，随后洗掉，然后补充普通生长培 养基。总孵育时间为24小时。对于24小时研究，将细胞保持在含有化合物（I)的培养基中24 小时的孵育时间。将对照培养物保持在普通生长培养基中。按照增殖测定所述的方法测定 了活细胞的数量。结果示于图3A中。
[0184] 相对于1小时暴露和超过8小时的暴露，暴露于化合物（1)2小时显著地(PS0.05) 增加生长抑制活性。
[0185] (b)在REN细胞中研究了短暂暴露于不同剂量的化合物（1)(0.4、2和10恤)2小时后 历时72小时的生长抑制作用。将细胞培养物用不同浓度的化合物(I) (0.4、2和IOnM)预处理 2小时，随后洗掉，然后在普通培养基(不含化合物(I))中继续生长额外的24小时、48小时或 72小时。将对照培养物只保持在普通生长培养基中。按照增殖测定所述的方法在0小时、24 小时、48小时和72小时测定活细胞的数量。结果示于图3B中。
[0186] 不论在2小时预处理期间所使用的化合物（I)的浓度如何，对REN细胞增殖的抑制 作用的持续时间持续至少24小时。采用最高的化合物(I)浓度观察到了最大的抗增殖作用。 24小时后，细胞慢慢地恢复增殖活性，并且从化合物（I)预处理后约48小时，它们的增殖速 率与从研究开始时在普通培养基中培养的REN细胞的增殖率相似。
[0187] 实施例4:采用化合物(I)的预处理对顺铂和/或培美曲塞对REN细胞的作用的影响
[0188] (a)将100μΜ顺铂加入采用IOnM化合物（I)预处理2、4、8和12小时的REN细胞培养物 中（追加实验）。按照上述增殖测定所述的方法测定了在24小时时的活细胞数量。将对照培 养物保持在普通生长培养基;加有化合物（I) (IOnM)的生长培养基;和加有顺铂（100μΜ)的 生长培养基中。结果示于图4Α中。
[0189] 顺铂的增强的抗增殖作用是时间依赖性的，当在化合物(I)预处理2小时后加入顺 铂时获得了最大的抑制作用。
[0190] (13)将不同浓度的顺铂(20、40、60、80和10(^)加入采用化合物（1)(101^)预处理2 小时的REN细胞培养物中。将细胞用化合物（I)(IOnM)预处理2小时，随后洗掉并在补充有不 同浓度的顺铂(20、40、60、80和1 ΟΟμΜ)的普通培养基中继续生长额外的24小时。按照上述增 殖测定所述的方法测定了所述额外的24小时后的活细胞数量。将对照培养物保持在普通生 长培养基中；采用化合物(I)(IOnM)预处理2小时，洗掉，然后在普通培养基中继续生长额外 的24小时；以及保持在加有顺铂（100μΜ)的生长培养基中。结果示于图4Β中。
[0191] 当将化合物（I)预处理与最高浓度的顺铂（100μΜ)组合时观察到了最有效的抗增 殖作用。然而，出乎意料的是，采用化合物（I)的2小时预处理与20μΜ顺铂的组合与单独的 100μΜ顺铂一样有效。
[0192] 对该实验的结果进行了等效线图分析（Tallarida RJ. ,Perspectives in Pharmacology 2001；298(3)：865-72；Tallarida RJ.,Perspectives in Pharmacology 2006;319:1-7)。结果示于图4F中。从该图中可以看出，化合物（I)与顺铂的组合具有协同效 应。
[0193] (c)将化合物（I) (IOnM)加入采用100μΜ顺铂预处理2、4、8和12小时的REN细胞培养 物中（追加实验）。按照上述增殖测定所述的方法测定了在24小时时的活细胞数量。将对照 培养物保持在普通生长培养基中；加有化合物(I) (IOnM)的生长培养基中；和加有顺铂（100 μΜ)的生长培养基中。结果示于图4C中。
[0194] 尽管采用顺铂和化合物（I)两者同时处理的细胞比只用一种试剂处理的细胞表现 出更大的生长抑制，但在加入化合物（I)之前采用顺铂进行预处理不导致细胞生长和存活 的协同抑制作用。这与在加入顺铂之前采用化合物（I)进行预处理不同，如实施例4(a)中所 示。因此，化合物⑴和顺铂对恶性间皮瘤细胞增殖和存活的协同抑制作用只出现在采用化 合物(I)进行预处理的情况中，相反的顺序则不出现。
[0195] (〇1)将不同剂量的培美曲塞(5、11、16.5和22以1〇加入采用化合物（1)(1〇1^)预处理 2小时的REN细胞培养物中。将细胞用化合物（I) (IOnM)预处理2小时，随后洗掉并在补充有 不同浓度的培美曲塞（5、11、16.5和22μΜ)的普通培养基中继续生长额外的24小时。按照上 述增殖测定所述的方法测定了在额外的24小时后的活细胞数量。将对照培养物保持在普通 生长培养基中；用化合物（I)(IOnM)预处理2小时，洗掉，然后在普通培养基中继续生长额外 的24小时；以及保持在加有培美曲塞(22μΜ)的生长培养基中。结果示于图4D中。
[0196] 当在化合物（I)预处理2小时后加入培美曲塞时，没有得到增强的抗增殖作用。这 与在加入顺铂之前用化合物（I)进行预处理不同，如实施例4a中所示。因此，采用化合物（I) 的预处理对培美曲塞不表现出其对顺铂所表现出的相同的有利的协同效应。
[0197] (e)将顺铂（100μΜ)或顺铂（100μΜ)和培美曲塞（22μΜ)加入采用化合物（I) (IOnM) 预处理了2小时的REN细胞培养物中。将细胞用化合物（I)(IOnM)预处理2小时，然后洗掉，并 在补充有顺铂（1〇〇μΜ)，或顺铂（100μΜ)和培美曲塞(22μΜ)的普通培养基中继续生长额外的 24小时。按照上述增殖测定所述的方法测定了在额外的24小时后的活细胞数量。将对照培 养物保持在普通生长培养基中；加有顺铂（1〇〇μΜ)的生长培养基中；加有培美曲塞(22μΜ)的 生长培养基中；加上顺铂（1〇〇μΜ)和培美曲塞（22μΜ)的生长培养基中；以及用化合物（I) (IOnM)预处理2小时，随后洗掉并在普通培养基继续生长额外的24小时。结果示于图4Ε中。
[0198] 在加入顺铂或顺铂/培美曲塞之前采用化合物（I)对REN细胞进行预处理导致了对 细胞生长和存活的强协同抑制作用。
[0199] 实施例5:采用化合物(I)处理的细胞的细胞周期分析
[0200] 将REN细胞采用100μΜ顺铂处理24小时，或采用IOnM化合物（I)预处理2小时，随后 洗掉，并在普通培养基±1〇〇μΜ顺铂中继续生长额外的24小时。如上所述进行细胞周期分 析。将对照培养物保持在普通生长培养基中。处理后，将细胞用碘化丙啶染色，并通过流式 细胞仪分析细胞的DNA含量。结果示于图5Α中。
[0201] 与任何其他处理相比，采用化合物（I)预处理2小时随后采用顺铂处理24小时导致 显著且高效地将细胞周期在G0/G1期阻断，并抑制细胞进入细胞周期的S期。此外，与所测试 的其他处理方案相比，在采用化合物（I)预处理随后采用顺铂处理的孔中发现了显著更高 的死细胞百分比。
[0202]对于在化合物（I)/顺铂处理的细胞中死细胞数量更高的一个似乎合理的解释是 细胞凋亡的诱导。
[0203] 还通过蛋白质印迹分析和相对光密度测定法测定了REN细胞中的PARPl水平、裂解 的PARPl水平、AKT水平和磷酸化的AKT水平，所述REN细胞采用顺铂（25、50和100μΜ)处理了 24小时或采用化合物（I) (IOnM)预处理了2小时，随后洗掉，并在普通培养基土顺铂（25、50 和100μΜ)中继续生长额外的24小时。将总AKT和微管蛋白染色用于归一化。结果示于图5Β 中。由于PARPl裂解是细胞凋亡的指标，因此，对它进行了分析。由于在增殖、细胞凋亡和顺 铂耐药性的控制中涉及增加的AKT活性(Pinton G.等人，PLoS 0ne(2012)7:e36856)，因此， 还分析了不同处理之后的AKT激活状态。
[0204]如从细胞周期分析和死细胞百分比中所预期的，在加入顺铂之前，采用化合物(I) 处理2小时对裂解的PARPl的出现影响最大（图5B)。有趣的是，单独的顺铂或化合物(I)均不 导致显著的PARPl裂解。在不存在顺铂和存在顺铂两种情况下，化合物（I)处理也显著地减 少了 AKT磷酸化(图5B)。
[0205]实施例6:在MET5A细胞中化合物(I)对顺铂毒性的影响
[0206]在来自正常间皮的细胞系MET5A中测试了化合物⑴对顺铂毒性的影响。将MET5A 细胞采用IOnM化合物（I)处理2小时，随后洗掉并在普通培养基中或在不同剂量的顺铂(25、 50、100μΜ)存在下继续生长额外的24小时。将对照培养物保持在普通生长培养基中；加有顺 铂（100μΜ)的生长培养基中；采用化合物（I) (IOnM)处理2小时，洗掉，然后在普通培养基中 继续生长额外的24小时。结果示于图6Α中。
[0207] 与REN细胞相比，ΜΕΤ5Α细胞对顺铂处理表现出更高的敏感性，IC5q为25μΜ。单独的 化合物(I)对ΜΕΤ5Α细胞增殖或存活没有影响。当化合物（I)预处理与低剂量的顺铂组合时， 观察到保护作用。
[0208]因此，与在恶性REN细胞中化合物（I)显著增加顺铂的细胞毒性的作用（参见实施 例4(a)、（b)和(e))不同，在非恶性间皮ΜΕΤ5Α细胞中化合物（I)减少和/或抵消了顺铂的毒 性。似乎ERi3激动剂发挥变阻器样的作用，试图在患病细胞或受激细胞中重建体内稳态。 [0209] 还通过蛋白质印迹分析和相对光密度测定法测定了在24小时时MET5A细胞培养物 中的PARPl水平、裂解的PARPl水平、AKT水平和磷酸化的AKT水平。
[0210]与所获得的关于细胞存活的数据（图6A)-致，化合物（I)预处理在暴露于所有浓 度的顺铂的细胞中减少了裂解的PARP1的百分比（参见图6B)。化合物（I)对MET5A对照细胞 中的基础PAKT水平没有影响，但是它拮抗顺铂介导的pAKT的抑制作用（也在图6B中示出）。 AKT途径激活与抗细胞凋亡作用以及细胞存活有关。与化合物（I)对减少的PARP1裂解的作 用一起，这可解释在非恶性MET5A细胞中化合物（I)介导的顺铂细胞毒性的降低。
[0211] 实施例7:采用化合物(I)和顺铂预处理对MMP细胞的影响
[0212] 将50μΜ顺铂加入采用IOnM化合物（I)预处理了两小时的MMP细胞培养物中（洗掉实 验）。按照上述增殖测定所述的方法测定了在24小时时的活细胞数量。将对照培养物保持在 普通生长培养基中；加有化合物（I)(IOnM)的生长培养基中；和加有顺铂(50μΜ)的生长培养 基中。结果示于图7Α中。
[0213]当将细胞采用化合物⑴预处理2小时时，观察到顺铂的增强的抗增殖作用。
[0214]还通过蛋白质印迹分析测定了在24小时时MMP细胞培养物中的PARPl水平、裂解的 PARPl水平、AKT水平和磷酸化的AKT水平。
[0215] 结果示于图7Β中。从该图中可以看出，在采用化合物（I)预处理两小时，随后洗掉 并在补充有50μΜ顺铂的普通培养基中继续生长的细胞中，裂解的PARPl的水平显示最显著 的增加。在不存在和存在顺铂的两种情况下，化合物（I)处理都显著降低了 AKT磷酸化，但是 当采用化合物（I)和顺铂处理细胞时最显著。
[0216] 因此，在第二种人恶性间皮瘤细胞系--MMP中，与体外单独的化合物（I)或顺铂 相比，与顺铂相组合的化合物（I)导致了协同生长抑制作用。此外，与在REN细胞中的作用相 似，化合物⑴和顺铂的组合在MMP细胞中降低了磷酸化的AKT的水平并增加了裂解的PARP1 的水平。
【主权项】
1. 一种用于在患者中治疗间皮瘤的ERi3激动剂，其中该治疗包括： a) 将ER0激动剂给予患者，然后在最长达24小时的时间t后， b) 将含铂抗癌药物给予患者。2. 用于如权利要求1所述用途的ERi3激动剂，其中所述含铂抗癌药物是顺铂。3. 用于如权利要求1或2中所述用途的ERi3激动剂，其中所述ERi3激动剂是式（III)的化 合物，或其盐或酯，其中R1选自卤素、氰基、硝基、〇RA、N( RB) 2、-C (0) Ci-4烷基、-SOA-4烷基、Ci-6烷基、C2-6烯 基、C2-6炔基、卤代&―6烷基、二卤代&―6烷基、三卤代&―6烷基、卤代(：2-6烯基、二卤代(：2-6烯基、 三卤代C2-6烯基、氰基&-6烷基、&-4烷氧基&-6烷基、C3-8环烷基、C3-8环烷基&-6烷基、苯基、苄 基和5-10元杂环基，其中所述苯基、苄基或杂环基基团可为未取代的或被1-3个取代基取 代，各取代基选自0R A、卤素、氰基、硝基、-C( 0 ) CP4烷基、CP6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤代 &一6烷基、二卤代&-6烷基和三卤代&-6烷基； R2选自卤素、氰基、硝基、〇#4(1^):^(0!〇2、任选地被1至3个卤素取代的-(：(0)(： 1-4烷 基、-SO2C1-4 烷基、-C (0) NH-OH、-C (NH2) = N-OH、-C (C02H) = N-OH、-C (NH2) = NH、-C (NHCi-4 烷 基）=NH、-C (O-Ci-4 烷基）=NH、-C (NH2) = N-NH2、-NH-C (NH2) = NH、-NH-C (0) NH2、-N=C (-NH-CH2CH2-NH-)、-S-CN、-S-C(NH2) =NH、-S-C(NH2) =N-〇H、-C〇2H、-CH2-C〇2H、-CH(OH)C〇2H、-C (Ο) C02H、S03H、CH2S03H、Ci-6烷基、卤代Ci-6烷基、二卤代&―6烷基、三卤代&―6烷基、氰基Ci-6烷 基、&-4烷氧基Ci-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、C3-8环烷基Ci-6烷基、苯基、苄基和5-10元杂环基，其中所述苯基、苄基或杂环基基团可为未取代的或被1-3个取代基取代，各取 代基选自〇R A、卤素、氰基、硝基、Ci-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤代Ci-6烷基、二卤代&-6烷基 和三卤代&-6烷基;条件是如果R 1和R2之一代表卤素，则另一个必须代表卤素以外的基团； 各R3、R4、R5和R6独立地选自氢、OR A、卤素、氰基、硝基、Ch烷基、C2-6烯基、C2- 6炔基、卤代 &一6烷基、二卤代&-6烷基和三卤代&-6烷基； 各RA独立地选自氢、&-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、C3-8环烷基&-6烷基、〇5- 10芳 基和C6-1Q芳基烷基，每个任选地被1至3个卤素原子取代;和 各妒独立地选自氢、&-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、C3-8环烷基&-6烷基、〇5-10芳 基和C6-1Q芳基烷基，每个任选地被1至3个卤素原子取代； 条件是式(III)的化合物不为 4-[3-(4，5-二氢-1H-咪唑-2-基)-2-(3，5-二甲基-异噁唑-4-基)-吲哚-1-基]-苯酚； 1-(4-羟基-苯基)-2-(4-甲基-咪唑-1-基)-1Η-吲哚-3-甲腈； 1-(4-羟基-苯基)-2-( 1H-吡唑-3-基)-1Η-吲哚-3-甲腈； 1-(3-氯-4-羟基-苯基)-2-( 1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1Η-吲哚-3-甲腈； 1-(4-羟基-苯基)-2-丙-1-炔基-1H-吲哚-3-甲酸酰胺;或 1-(4-羟基-苯基)-2-噻唑-2-基-1H-吲哚-3-甲酸。4. 用于如权利要求3所述用途的ERi3激动剂，其中所述ERi3激动剂是具有下式的化合物： 或其盐或酯。5. 用于如权利要求1至4中任一项所述用途的ERi3激动剂，其中所述间皮瘤是恶性胸膜 间皮瘤。6. 用于如权利要求1至5中任一项所述用途的ERi3激动剂，还包括给予其他化疗药物。7. 用于如权利要求6所述用途的ERi3激动剂，其中所述其他化疗药物是培美曲塞。8. 用于如权利要求7所述用途的ERi3激动剂，其中在给予ERi3激动剂之后且任选地在给 予含铂抗癌药物之前给予培美曲塞。9. 用于如权利要求1至8中任一项所述用途的ERf3激动剂，其中t最长达约8小时，例如最 长达4小时。10. 用于如权利要求9所述用途的ERi3激动剂，其中所述ERi3激动剂对雌激素受体β亚型 的选择性比对雌激素受体α亚型的选择性大200倍以上。11. 一种ERi3激动剂和含铂抗癌药物，其用于在患者中治疗间皮瘤，其中该治疗包括： a) 将所述ER0激动剂给予患者，然后在最长达24小时的时间t后， b) 将所述含铂抗癌药物给予患者。12. 用于如权利要求11所述用途的ER0激动剂，其中所述ER0激动剂为如权利要求3中所 定义的化合物，或其盐或酯。13. 用于如权利要求12所述用途的ERi3激动剂，其中所述ERi3激动剂是具有下式的化合 物： 或其盐或酯。14. 一种在患者中治疗间皮瘤的方法，其包括： a) 将ER0激动剂给予患者，然后在最长达24小时的时间t后， b) 将含铂抗癌药物给予患者。15. -种ERi3激动剂，其用于制备在患者中治疗间皮瘤的药物，其中该治疗包括： a) 将ER0激动剂给予患者，然后在最长达24小时的时间t后， b) 将含铂抗癌药物给予患者。16. -种试剂盒，其包括含铂抗癌药物和ER0激动剂，例如如权利要求3中所定义的化合 物或其盐或酯，以及顺铂或卡铂。17. 如权利要求16所述的包括含铂抗癌药物和ERi3激动剂的试剂盒，其中所述ERB激动 剂是具有下式的化合物：或其盐或酯，且所述含铂抗癌药物是顺铂。
【文档编号】A61K31/4045GK105960236SQ201480074885
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2014年12月4日
【发明人】S·尼尔森, L·莫洛, G·潘东, A·G·曼恩特
【申请人】卡罗医药股份公司