用作拮抗剂的抗促甲状腺激素受体的人单克隆抗体的制作方法

专利名称：：用作拮抗剂的抗促甲状腺激素受体的人单克隆抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及与促曱W^L素(TSH)受体(TSHR)^的胁，并且M而言，但非氺他l^涉;SJt样的抗体，即这种^t可与TSHR结^f且可通过TSH-刺激性^#^TSHR-刺^bht^阻断TS皿的激活。
背景技术：
：促曱状腺激素(Thyrotropin)或促甲状腺激素(thyroidsti咖latinghormone)(TSH)是一种通过TS服调节曱状腺功能的垂体激素(Szkudlinski匿，FremontV，RoninC，WeintraubBD2002Thyroid—stimulatinghormoneandTSHRstructure—functionrelationships.PhysiologicalReviews82:473-502)。TSHR是一种G蛋白>(!^1受体，由3个结构^^試富含亮氨酸的结构域(LRD)、切割结构域(CD)和跨膜结构域(TMD)(NunezMiguelR，SandersJ，JeffreysJ，D印raetereH，EvansMRichardsT，BlundellH，ReesSmithB,FurmaniakJ2004Analysisofthethyrotropinreceptor—thyrotropininteractionbycomparativemodelling.Thyroid14:991—1011)。TSH结合到TS服上引发受体信号传导，其皿甲^^:素甲^^素(T4)和^甲^^氨酸(T3)的形成与释改。有一种反^^制涉及循环中T4和T3的水平，这种机制控制雄下垂^#^TSH(和下丘脑分泌的促曱^^素#^1素)，TSH又控制曱^W:活和血清中曱^^L素的水平。本领域的很多资^H兌明，某些自身免疫性甲状腺病(AITD)的患者具有与TS皿反应的自身抗体(ReesSmithB，McLachlanSN^FurmaniakJ1988Autoantibodiestothethyrotropinreceptor.EndocrineReviews9:106-121)。在大多数情况下，这些自身^#^TSHR结^f模仿TSH的作用，从而刺激曱状腺产生高水平的T4和T3。这些自身抗^^称为曱:)W'J激性自身抗MTSHR自身M(TRAb)，具有刺激性活'赋TSH激动剂活性。上文提及的曱现曱状腺活动itJL或曱状腺毒症(血清中曱状^素过量)的患者中;l^效应的。这种病症被称为格雷^JJf病(Graves'disease)。人们认为，在一些患者中，具有刺激活性的TRAb在BI^组织中与TSHR相互作用，并且导致了格雷A^f病的眼部征状。作为强大的曱;^刺激因子的人单克隆M(hMAbTS服l)i^详细记载于专利申请W02004/050708A2中。与在一些患AITD的患者中不同，自身抗体可结合TSHR、阻止TSH结合于所述受体，^^殳有刺激TSHR的能力。这些类型的自身:^^皮称为具有阻断活性或TSH拮抗活性的TRAb，并JL^其血清中有阻断性TRAb的患者可能会出现曱状腺活性不足的症状(曱状腺功能减退症)(ReesSmithB，McLachlanSM，FurmaniakJ1988Autoantibodiestothethyrotropinreceptor.EndocrineReviews9:106-12D。具体地，如^/j^在于'I^女性的血清中，具有阻断活性的TRAb可穿过胎盘并且可以阻断胎儿的甲批腺TSHR,引起新生儿甲状腺功能减退^^严重的发育后果。再者，具有阻断活性的TRAb可出现于受感染母亲的母乳中，这可育化嬰儿中进一步导致临床的曱^^功能减退症。迄今为止，还尚^H得具有TSH拮抗剂活性的抗TSHR的人单克隆自身抗体。因此，针对这种类型的自身M怎样和TS服相互作用的详^^9f究，以及针对它们和TSHR的相互A^4J^促性^:素是一种在^it程中产生的具有温和曱W^^^的激素。对具有刺激活性或阻断活性的TRAb的'I^t的^^iE^下述研究中;^toJ"重治疗。在专利申请W02004/050708A2中描述的发明提供了关于具有强WJ激活性的人单克隆自身抗体的'M及其与TSHR的相互作用的详情。再者，专利申请W02006/016121A公开了一种包括至少一个点突变的突变的TSHR制品，它可用于在来自待筛查的患者的体液样品中，对患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身胁和TSH进行差异筛查和鉴定。专利申请WO2004/050708A2还描述了具有TSHR阻断活性的小鼠单克隆抗体(9D33)。9D33以高亲和力(2x10"L/mol)与TSHR结合，并JU1—种TSH、hMAbTSHR1(M22)和具有刺激活性或阻断活性的患者血清TRAb的有效拮抗剂(专利申请W02004/050708A2和SandersJ，AllenF，JeffreysJ，BoltonJ，RichardsT，DepraetereH，NakatakeN，EvansMKiddieA，PremawardhanaLD，ChirgadzeDY，MiguelRN，BlundellTL，FurmaniakJ，ReesSmithB2005Characteristicsofamonoclonalantibodytothethyrotropinreceptorthatactsasapowerfulthyroid-stimulatingautoantibodyantagonist.Thyroid15:672-682)。虽然小鼠单克隆M9D33至少可显示具有阻断活性的患者血清TRAb的一些特征，但它^1一种通过以TS服免疫实M物产生的小鼠抗体，并因此不能真正^(J(^体内对TSHR自身免C^答过程中产生的TS服的自身抗体。作为一种小鼠单克隆跳，为了应用于>^体内，需絲9D33人源化。考虑到AJH匕过程中涉及的^^复杂,来看，这可能是不利的。本发明起因于抗TSHR的人单克隆自身M(5C9)的产生和'J^，该:fe^在患者血清中是一种TSH和刺激性TRAb的有效拮抗剂。已^c具有甲^J!^功能减退症和高水平TSHR自身私昧的患者的外周淋巴细胞分离到了5C9。通过以下方式将该淋巴细l&7lc生化以爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)感染并将阳性克隆与小鼠/人细胞系融合，以形成稳定的克隆。从克隆培养物的上清液纯化IgG，评估5C9IgG结合于TSHR并影响TS服活性的能力。^^地，研究了5C9抑制TSH与TSHR结合的能力，及抑制TSH的环AMP刺激活性的能力。再者，还评估了5C9抑制刺激性或阻断性的患者血清TRAb与TS服的结合的能力，及抑制它们的生物活性的能力。另夕卜，研究了5C9^TSHRM、TSH和相关4^^的测定中的用途。对5C9的重链(HC)和雜(LC)的可变区(V区)基因进fr测序，并指定互补决定区(CDR)。
发明内容才艮据本发明的第一方面，提供了一种分离的TSHR的人抗体，该抗体是一种TSH的拮抗剂。根据本发明的第二方面，提供了一种分离的TS服的人源^^,该抗体是一种TSH的拮抗剂。才娥本发明第一方面或第二方面的M为"一种^^本发明的M"。才娥本发明的糾可为一种曱;)WJ激性胁的拮抗剂。才娥本发明的抗/^可具有患者血清TSHR自身:fe^---种TSH拮抗剂一一##本发明的M可具有患者血清TSHR自身M——甲^^激性^的拮抗剂一一的拮抗剂特征。才娥本发明的抗/^可以是一种TSH、M22或者对TSHR有刺激活性的^#^有阻断活性的絲与TSHR或其一^M合的抑制剂oTSHR部分可包括LRD或其相当大的部分。^to地，一种可阻断这种结合的抗体。才娥本发明的M可为单克隆M或重组^^，或者包含其片段或由其片^iaj成，是一种TSH的拮抗剂。,^^发明的抗^^可包^1样的Vh区，即该VH区包^-种或多种选自图2中显示的CDR1、CDR2或CDR3的CDR，或者一种或多种^i^这些CDR同源的JU^列。jtb^卜或另夕卜，才娥4^发明的^^可包^it样的Vl区，即该VL区包^^种或多种选自图3中显示的CDR1、CDR2和CDR3的CDR，或者一种或多种J^这些CDR同源的^J^序列。才Nt本发明的M与人4^:TSHR可具有约10lflL/mol的结合亲和力。地，根据本发明的M与人全长TSHR可具有约109L/mol的结合亲和力。和产生的免k学机制。另外，'本i明可帮助本领域技^A员理)^"有曱^^'J激活性的TSHR自身^^具有阻断活性的TSHR自身旨之间的分子差异。另外，本发明的治疗处理方法和药物组^^提供了新的曱W^目关病症疗法。一种舰的本发明胁为5C9。已意外iik^现5C9可抑制促曱状l^t素受体的纟誠型活性，也^iX^^^在促甲^^:素或M22的情况下，在测验系统中产生环AMP。这可f沐别有利于对曱g中剩余的或转移的曱;^l^癌细胞的治疗，尤其是在PJaL或^i^再生长方面，狄因为促曱^^:素受体的组成型活性可狄这些细胞更'^4^生长。本文^Jfl的术语"胁"及同系术i^^如"多种胁"才娥上下文包括基于免疫球蛋白的结飾分，例如单克紗多克隆胁、单链^^多特异性胁，并iLii包括本领域技^A员可用于^a^it种基于免疫^^蛋白的结^P分的结合部分，例如结构域糾、双链糾、IgGACH2、F(ab')2、Fab、scFv、VL、VH、dsFv、微型抗体、三链抗体、四链胁、(scFv)2、scFv-Fc和F(ab03(HolligerP，ProsperoT，WinterG1993"Diabodies:smallbivalentandbispecificantibodyfragments"ProcNatlAcadSciUSA90:6444-6448.),(CarterPJ2006"Potentantibodytherapeuticsbydesign"NatRevImmunol6:343-357)。术语"TS服，，是指具有显示于图4中的^J^序列的^A促曱^^L素受体，或者它的与促甲^^:素受体高度同源的变体或片段。^ffei^也，这种变体和片賴:与显示于图4中的^J^序列有70-99.9%的同源性。才N^^发明的另一方面，提供了一种核苷酸，所述核苷酸包括a)编石射l^本发明第一方面的:^的核苷,列；b)编码如图2或3中所示的抗体Vh結枸域、抗体W结构J^CDR的^J^序列的如图2或3中所示的核苦酸序列；或者c)与a)或b)的核苷酸序列高度同源并编码以至少约109L/mol的亲和力与TSHR结合的抗体的核苷酸序列。才娥4^发明的另一方面，4€供了一种包^##4^发明的以上方面的核苷酸的栽体。所ii^体可以为一种质粒、病毒或它们的片段。^4页域技^pv员已知多种不同类型的载体。才娥本发明的另一方面，提供了一种包含##本发明的抗体、核苷酸和/或载体的分离的细胞；所述分离的细胞可表达一种根据本发明的松体。^i^，所述分离的细胞分^—种^l^本发明的松体。^i^，^4^^发明的分离的细胞来自一个稳定的异源杂^l细胞系。才娥本发明的又一方面，提供了一种包含确定、M的TSHR自身M并包含才Nt^^发明的M的组^。这种组合物可包^-种确定泉变的具有TSH拮抗剂活性的TSHR自身M，并包括一种4緣本发明的:^。或者，根据本发明的该方面的组合物可包^—种确定浓度的TSHR自身抗体一一曱^1激性^#抗剂，并包括一种才娥本发明的胁。一种组^可包^""种确定M的具有TSH拮抗剂活性的TS服自身M—一甲:J^'J激性^#抗剂，并包括一种才N^本发明的M。才娥本发明的另一方面,^_供了一种用于给予哺乳动物受M进行曱^Nl关病症治疗的药物组合物，包^—种4艮据^^发明的M和一种可药用的载体。所述曱^W目关病症可选自曱:^活动it变、档^t夫斯眼病、新生儿曱状l^功能亢进症、Ai^l^促'l!il^L素诱导的甲状腺功能亢进症、胫骨前粘液水肿、甲^^癌和甲M炎。才N^^发明的药物组^可用于对A^药。M地，4娥本发明的药物组合物对受试者的免疫系MJt显著的不利效应。才娥本发明的药物组^可包含另外的促甲状:素受##抗剂。一种合适的另外的促曱状^1素受##抗剂为WO2004/050708中公开的9D33。已考虑到本发明的药物组合物可具有多种形式。用于治疗甲^f目关病症的才緣本发明的药物组^可以为一种可注射的形式。用于治疗胫骨前粘液7K肿的才Nt本发明的药物组^^i^也为一种局部给药形式。用于治疗格雷A^f目艮病的4Nt本发明的药物组^N^地为滴眼剂的形式。本发明的药物组^包4^#^本发明的4壬意:^^可药用的任意栽体、佐剂或运载体。可用于^^发明药物组合物的药用栽体、佐剂^载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、石tJJ旨酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如Ajk清白蛋白)、緩沖物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部^"油酯;^^、水、盐或电解质(如>^~蛋白)、磷^t^钠、磷^l^钾、t/ft#|、锌盐、硅溶胶、^:酸镁、聚乙烯p比咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡，聚乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。本发明的药物组^可通过口月峰药、非纟1M给药、通it喷雾PAA^药、局部给药、通过滴目ll^药或眼膏给药、JLM给药、鼻J^药、口,药、阴道给药或经由档入储存器给药。我们m口月峰药或注射给药。4^文所用的术语"非诊^"包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和烦内注射或％^液4支术。所述药物组合物可为无菌可注射制剂的形式，如无菌可注射的水悬浮M油悬浮液。这种悬浮液可歉照本领域中已知技术^J^合适的分散剂或润湿剂(如Tween80)和助悬剂制成。无菌可注射试剂也可是由无毒肠外可接受的稀释剂或溶剂制成的无菌可注射溶液或悬浮液，如溶于1，3-丁二醇的溶液形式。可^fM的可接受的运载体和溶剂是甘露醇、水、沐格氏液和等渗t/f^溶液。另外，无菌的不挥发性油通常^U1作溶剂或助悬介质。为此目的，可^J^^T温和的不挥;^性油，包括合成的单"^由S旨或双甘油酯。脂肪酸(如油酸及其甘油酯衍生物)可用于制备可注射剂，正如天然的药学可絲的油类(W^苋油或M^油)尤其是其IWL乙基化形式一样。这些油溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂如Ph.Helv或刻以的醇。本发明的药物组合物可以^^T口月良可接受的药剂形式口月良给药，包括但不限于胶嚢、片剂、水悬浮液和溶液。对于口月l用片剂，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂如^JJ旨酸镁。对于口月良用胶嚢形式，有用的稀释剂包括乳糖和干的玉米淀粉。当水悬浮液为口月M^药时，其活性成分与乳化剂和悬浮剂结合。如果需要，还可加入某些甜"未剂和/或调味剂和/或着色剂。本发明的药物组合物也可以直肠给药用栓剂形式给药。可通过将本发明的化合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备这些组合物，所逸陚形剂在室温下为固态但在直肠温度下为液体，因而会在直肠中溶解从而釋，放出活'Iil且分。这种材料包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。当所需治疗包括局部施药容易到达的区域或器官时，本发明药物组合物的局部给药尤其有用。对于局部皮肤给药，所述药物组合物应该用含有悬浮或溶解于栽体中的活性组分的合适软膏来配制。用于本发明化合物局部用药的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，所述药物组合物可以用含有悬浮或溶解于载体中的活性化合物的合适洗剂或霜剂来配制。合适的栽体包括但不限于矿物油、脱水山梨醇单柳旨酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、棕榈醇、2-辛基十二烷醇、苯曱醇和水。本发明的药物组合物也可通过直肠栓剂制剂或以合适的灌肠剂形式用于下肠道。本发明还包括局部经皮膏药。本发明的药物组合物可以鼻用喷雾剂或级人剂的形式给药。这些组#是按照药物制剂领域熟知的技术制备的，并可〗吏用苯甲醇或其他合适防腐剂、增强生物利用度的吸收ilii剂、碳氟化合物和/或其他本领域中已知的助溶剂或*剂来制备为盐水溶液。才娥^^发明的又一方面，提供了一种产生^^本发明的M的方法，所^法包^养一种或多种才Mt本发明的分离的细胞，从而由所述细I^J^斤述抗体。^^k，所述胁由所述细胞分泌。才娥本发明的又一方面,提供了一种在哺乳动物受絲中或者来源自该受试者的细胞中治疗甲W^目关病症的方法，所述方法包^^将所述受^r或所述细胞与4^发明的^N"^触。##本发明的另一方面，提供了一种在哺乳动物受试者的曱*中抑制甲状麟'J激性^^刺激TSHR的方法，所財法包括将所述受絲与本发明的4^目接触。>^^，fJ^甲;l^'激性^^TS皿的结合。才H^^^发明的另一方面，提供了一种在哺乳动物受M中抑制甲:^'Jit'性M与曱^^卜TSHR结合的方法，所述方法包括将所述受试者与本发明的,相接触。所述曱^U^卜TSHR可存在于所述受財的BI^组织和/或胫骨前组织中。当被应用于该方法中时，本发明的抗体M地阻断TSHR自身^^与曱*外TSHR的结合。才娥本发明的另一方面，提供了一种在受逸奮中或在源自受M的曱细胞中治疗曱M中的或转移的曱状腺癌的方法，所述方法包括将所述癌细胞与本发明的^M目接触，目的是在所述细胞中抑制M^型促甲^^L素受体活性。^fe，PJohil舰甲她癌细胞的再生长。还提供了一种在受试者中或在源自受试者的曱M细胞中治疗由组成型甲#活'1^成的甲*活动选变的方法，所述方法包括将所述受试者或曱M细胞与4^发明的^M目4^触，目的是抑制由组成型曱*活'^^的曱^^舌动狄。在上ii^发明的^^方法中治疗的受"^N^^为人。#^本发明的另一方面，提供了##本发明的^^治疗曱W^目关病症中的用途。或者，提供了根据本发明的抗体在制备用于治疗曱^Nl关病症的药剂中的用途。还提供了一种在医学疗法中^^的才緣本发明的胁。M而言，提供了根据本发明的M用于治疗曱^JI^目关病症的用途。所述曱^J!^目关病症可选自曱^^动it变、格雷夫斯眼病、新生儿曱^^功能亢进症、A^^J^促^J^激素诱导的曱*功能亢进症、胫骨前粘^7jc肿、曱状腺癌和甲;l^炎。#4^^发明的另一方面，提供了一种表征TS服M的方法，包括确定#^测验的TSHR^与具有TSHR相关^J^序列的多肽的结合晴况，其中所述方法涉及一个方法步骤，该步骤包括^^J本发明的抗体。>f^k*,所述方法包^r确定本发明的抗体对TSHRM与该多M合的效应。具有TSHR相关的^J^f列的多肽^i^包括4^ATSHR。才娥本发明的另一方面，提供了一种用于表征TSH;M目关分于的方法，包括确定#测验的TSH或相关W与具有TSHR相关^tJ^序列的多肽的结合清况，其中所述方法涉及一步包^f捐本发明抗体的方法步骤。用于表征TS肌^或TSH的方法以;SJiil描述的^目关方法可以为ELISA形式。才娥本发明的另一方面，提供了一种确定在结^ft为拮抗剂的TSHR自身抗^it程中涉及的TS服^J^的方法，所i^法包括提fr"条具有本发明M可结合的第一TSHR相关JLi^序列的多肽，在所述TSHR相关的^J^序列中#^至少一个#^以及确定这样的#^对所述*结合的#。一种##本发明胁的方法，所財法包^f辦所述糾的至少一个絲酸以及确定这样的修饰对于与TSHR相关序列的结合的效应。选择对TSHR的亲和力增强的经^^的TSHR。才娥本发明的另一方面，提供了一种鉴定可抑制曱W^激性胁与TS服结合的分子的方法，所述方法包括提供至少一种，本发明的抗体作为参照物。^4^,选择可卩ibli甲;l^^激性^^TSHR结合的幹测辆衬。还提供了一种鉴定可抑制甲旨阻断性松本与TS皿结合的分子的方法，所述方法包括提供至少一种^^本发明的抗体作为参照物。>^i^，选择可阻止曱M阻断性抗体与TS服结合的分子。Syaif过参考附图1-4、仅以例证的方^W本发明的抗体和方法进^f彌述，其中图1的3幅系列图示出了来自患格雷A^f病的患者(n=40)和健泉的捐血者(n=10)的血清对1251-509IgG、125I-TSH或125I~M22与经TS服涂覆的管结合a125I-5C9IgG结合与125I-TSH结合b125I-5C9IgG结合与125I~M22IgG结合c125I-TSH结合与125IHi!22IgG结合；图2给出的序列为5C9重链(HC)的可变区序列a以未^#^^#的形式显示的5C9HC的^fe苷酸序列。在注释的形式中，用于PCR引物的序列为框示的各个互补决定区(CDR);瓦繁体所示的恒定区。b源自以未:;^#^^^#^式显示的暮该苷#列的5C9HC的^J^列；图3给出的序列为5C9^(LC)的可变区序列a以未^#^^#(按照图2)的形式显示的5C9LC的募fe苷酸序列。b源自以未ii^注，式显示的S^苷^列的5C9LC的^tJ^列；图4显示了人TSHR的共有#^,列(射己号P16473,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=protein&val=62298994)。具体实施方式才法乂賴鏖萌々,絲^辦s勿粉絲^i靴^J1记载于W02004/050708A2中的方法，常皿分离单克隆自身M5C9。最初从收集自患产后曱^功能减退症并具有高水平TRAb的患者的j&^中分离到淋巴细胞(得到地方伦理委员会的批准)。如WO2004/050708A2中所述，以爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)(EuropeanCollectionofCellCultures-ECACC;PortonDown,SP40JG，UK)感染所述林巴细胞，并培养于小鼠巨噬细胞飼养层上。将分泌TS服自身抗体的永生化淋巴细胞与小鼠/人杂交细胞系K6H6/B5(ECACC)融合，通过有1:|1#释克隆4次，以得到单集落。通过抑制125I-才射己的TSH与TS服的结合，检测了处在不同克隆化阶度的细皿养上清液中TS服自身M(W02004/050708A2)的存在情况。将产生TSHR自身抗体的单克隆扩大，并M^^收ILh清^I于进行自身M纯化。^JI蛋白质A亲和色i普法在MabSelect(GEHealthcare,UK)上，4^L据(SandersJ，JeffreysJ,DepraetereH，EvansRichardsT，KiddieA，BreretonK，PremawardhanaU)，ChirgadzeDY，NunezMiguelR，BlundellTL，Fur咖niakJ，ReesSmithB2004Characteristicsofahumanmonoclonalautoantibodytothethyrotropinreceptor:sequencestructureandfunction.Thyroid200414:560-570)记^c培絲上清液中纯化5C9IgG,并通过SDS-聚丙烯Sfe^凝欧电泳(PAGE)评估纯度。使用径向扩散测定(TheBindingSite;Birmingham,B296AT，UK)确定5C9的重链同种型，通过蛋白质印迹法以^Ak链和M人链的特异性小鼠单克隆胁(Sigma-AldrichCompanyLtd,Poole，UK)确定i^同种型。在室温下，将溶于20咖ol/L乙酸钠溶液(pH4.5)的10mg/mL的5C9IgG与依照制造商i兌明书(PerbioScienceUKLtd,Cramlington，UK)制备的固定化胃蛋白酶振荡孵育4.5小时。jH^，通过离心(在室温下，1000xg,5^4中)除去固定化胃蛋白酶，并在41C下将上清^JU300咖ol/LNaCl，10咖ol/LTris-HC1(pH7.5)透析过l4捐SephacrylS-300HighResolutionMatrix(GEHealthcare,ChalfontStGiles,UK)，分离包含5C9F(ab')2和少量完整IgG的透析后〉V給物。以这〕种方式纯化的5C9F(ab02制品不包含完整的IgG,i^l通过SDS-PAGE和HPLC^01i^虑^^斤来判断的。再者，在37X:下，使用终浓度100咖ol/L的L-半JiJt^酸对F(ab02消减l小时。在室温下以终浓变50咖ol/L的琳r乙St^f止该反应30分钟。如上文所述，使用S邻hacrylS-300柱纯化F(ab')。以这种方式纯化的F(abO制品不包含F(ab')2,itl通过SDS-PAGE和HPLC^^±>虑^^斤来判断的。另外，用汞木;^Jl(mercuripapain)(Sigma，UK)以1:100的酶/蛋白质比处理5C9IgG、将其透析入50咖ol/LNaCl，Tris-HCl(pH9.O)中，絲过阴离子交换S印harose(购自GEHealthcare的Q-S邻haroseFastflow)柱，以从Fab制品分离完整的IgG或Fc。通过SDS-PAGE和^Mi^虑(S印hacrylS-300柱；如上必的分析表明，在所述Fab制品中没有检测到完整的IgG。如SandersJ，OdaY,RobertsS，KiddieA，RichardsT，BoltonJ，McGrathV，WaltersS，JaskolskiD，FurmaniakJ，ReesSmithB1999.TheinteractionofTSHrec邻torautoantibodieswith125I-labelledTSHreceptor.JournalofClinicalEndocrinologyandMetabolisnu199984:3797-3802中所述，以125I5C9IgG，或者以生物素sw(PerbioScience,Cramlington，UK)树己5C9IgG。#"/-ZSy、jfe'与7y朋潜合^^刺如W02004/050708A2中的描述，4吏用经TSHR涂覆的管进4亍了结合抑制测定。在该测定中，在室温下将IOOjiL试验样品(Mab制品、患者血清或未标记的TSH)和50jnL起始緩冲液(RSRLtd)在经TS服涂覆的管中轻轻振荡孵育2小时。在吸出后，将所述管洗涤，并iUn入100jaL的^I-标记的蛋白质(5x10、pm)并在室温下振荡孵育l小时。然后，将所述管吸出、洗涤并在Y计数器中计数。按照下式计算对经标记蛋白质的结合的抑制-inn「在存在测验材料的情况下结合的cpm—L在存在对照材料的情况下结合的cpi^对照材料为混合的^J:捐血者血清、个体的#^捐血者血清或在各个实验结果中指示的其他材料。#W7y朋潜合^5t"c力aiY/》、浙在室温下，将溶于50nL测定緩沖液(50mmo1/LNaC1，10mmo1/LTris(pH7.8)和1%TritonX-100)中未标记的5C9IgG和50jjL的1251-标记的5C9IgG(溶于测定緩冲液中30，000cpm)在经TSHR涂覆的管中振荡孵育2小时(在这些条件下出现最大结合)、吸出、以lmL测定緩冲液洗涤两次并在Y计数器中计数。对结合的IgG的浓度与结合的/游离的IgG的浓度进行作图(ScatchardG1949Theattractionofproteinsforsmallmoleculesandions.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences51:660—672)，以推导締合常数。养,y^聰麟俯如W02004/050708A2中所述，测验了5C9IgG和其他制品在以人TS服转染的中国仓鼠卵巢(CH0)细胞中刺激环AMP产生的能力。4^个细Ji^达大约5x104个或大约5x1()S个TSHR的CH0细胞以每个孔3x104个细^^种于96-孑Ul中，在无胎牛血清的DMEM(InvitrogenLtd，Paisley,UK)中进行适应，然后添加"^^样品(TSH、IgG或患者血清)(100pL稀释于环層测定緩冲液，即无NaCl的Hank，s緩冲盐溶液，包含lg/L葡萄糖、20咖ol/LHEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白和0.5咖ol/L的3-异丁基-l-曱基黄嘌呤(pH7.4))，并在371C下孵育1小时。在除去试验溶液后，将细胞裂解并通过以下两方法的一种测定所述裂解产物中的环層浓度l)使用来自GEHealthcare,ChalfontStGiles,UK的Biotrak酶免疫观'J定系统；和2)使用来自AssayDesigns;CambridgeBioscience,UK的DirectCyclicAMPCorrelateEIA试剂盒。结^^示为细胞裂解产物(200jiL)中pmol/mL的环AMP，或者表示为fmol/细胞孔。欣斷雜^被评估了5C9IgG和其他制品抑制猪(p)TSH、天然人(h)TSH和重组体人(rh)TSH、MAbM22和患者血清TRAb在表达TSHR的CH0细胞中的刺激活性的能力。这一点的实现是通it^存在及不存在5C9IgG(或其他试验制品)的情况下，比较TSH、M22或TRAb的刺激效应。按上文所述进行该测定，除了将50yL稀释于环層测定緩沖液中的5C9(或其他^^，J品)添加至所述细胞孔，然后添加50pL的TSH、M22或患者血清(在环AMP测定緩冲液中适当稀释)，并如上文所^'J激测定进行赙育和M。除了5C9"卜，在该测定中测验了其他MAb和来自具有阻断类型TRAb的患者的血清。如W02004/050708A2中所述，使用从lx107个分泌5C9IgG的异源杂交瘤细胞制备的总RNA以产生用于RT-PCR(逆转录PCR)反应的mRNA，确定了5C9重链和轻链的可变区基因。^J1MedicalResearchCouncil的V-base(http:〃vbase.mrc-cpe,cam,ac,uk/)设计特异性IgGlHC和kLC正义和反义链寡核苷酸引物，并由Invitrogen(Paisley，PA49RF，UK)合成这些引物。在以下条件下进行RT^^应50"C下15分钟；然后进行40个PCR循环，每个循环为94匸下15秒、50t:下30秒及72t:下30秒。将DNA产物克隆至pUC18中，并用Sanger-Coulson法进行测序(SangerF，NicklenS，CoulsonAR1977DNAsequencingwithchainterminatinginhibitors.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA74:5463-5467)。使用Igblas"http:〃丽.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)将V区序列与已有人Ig基因序列比较。#乂7y朋^^尹^絲邀^^对W夕承遂^^t^^》Vf用于将具体突变引入TSHR序列的方法已经被记载于专利申请W02006/016121A中。而且，使用Flp-In系统将突变的TS服构建体转染至CHO细胞中也被记载于W02006/016121A中。将表达野生型或突变TSHR的Flp-In-CHO细M种于96孑Ul中，并如上文所述用于测验5C9制品阻断TSH、M22或患者血清TRAb的刺激活性的能力。村7OT絲、OT弄被为、，差f将2.55mg/mL的5C9IgG透析至100咖ol/L磷酸钠緩冲液(pH8.5)中，并与EZ-LinkNHS-LC-Biotin(Perbio)进行反应，IgG与生物素的摩尔比为1/10。在室温下，将试验血清样品(75pL)在经TSHR-涂覆的ELISA板孔(RSRLtd)中振荡(每分钟振荡500次)孵育2小时。在除去所述^^样品并洗涤后，添加生物素标记的5C9IgG(100pL中2ng)，并在室温下不振荡继续孵育25分钟。将孔清空、洗涤并添加100pL链亲合素-过氧化物酶(100juL中10ng;RSRLtd),并在室温下不振荡继续赙育20分钟。然后，将孔洗涤3次，添加itfU匕物酶的底物四甲J^^^(tetramethylbenzidine)(TMB;100RSRLtd),并在避光且不振荡的条件下，在室温下孵育30分钟。然后，添加50juL的0.5mol/LH2S04以终止该反应，佳月ELISA板读lt仪在"0nm下读取每个板孔的吸光度。按照下式计算对5C9IgG-生物素结合的抑制-inn「,试验样品在450nm下的吸光度—lOOx1--阴性对照血清样品在450nm下的吸光度絲W为、必勿靡粉"^鋭将从20mL患者血液中获得的淋巴细胞(27x103以EBV感染，并在48孑U1中以每孔1x106个细胞铺展于小鼠巨噬细胞饲养层之上。在EBV感染后第13天，^孔上清液中监测对"I-TSH结合的抑制。将来自阳性孔的细胞扩大，与K6H6/B5杂交瘤细胞系融合，并在96孑M1中铺展。获得了一个稳定产生具有125I_TSH结合抑制活性的抗体的克隆，并进行4次再克隆。从异源杂交瘤培养物上清液中纯化的被命名为5C9的单克隆抗体是具有k轻链的亚类IgGl。W#7OT潜合承妙贿雜表1中显示了，不同浓度的5C9IgG抑制标记的TSH、标记的M22或标记的5C9自身与TS服结合的能力。如表1中所示，在4吏用少至0.005ng/mL的5C9IgG的情况下，125I-TSH的结合出现了12%的抑制，并且该抑制以剂量依赖的方式增大，在IOO]Lig/mL的5C9时抑制最高升至84。/。。这可与捐^MT的血清IgG对125I-TSH结合的抑制相似；在0.05mg/mL时抑制13%，并JL^1mg/mL时以剂量依赖的方式增大至抑制94%。在捐献者的血浆的情形下，在以1:160稀释^J:捐血者的^^血清时，"I-TSH结合出现了16%的抑制，在以1:IO稀释时抑制为95%。5C9IgG狄1251-1422IgG与涂覆在管上的TS服的结合有效应(表l)。在O.01pg/mL的5C9IgG时，125I-M22IgG的结合出现了9%的抑制，并且在增加浓度时引起该抑制以剂量依赖的方式增大，在IOOug/mL时最高达85%。捐a血清IgG在O.01mg/mL下是有效的，引起9%的抑制，并且在1mg/mL时以剂量依赖的方式增大至89y。的抑制。在以1:320稀释时，捐^T的血清血浆显示出对1251-M22IgG结合的13%的抑制，在以1:10稀释时抑制91%。未标记的5C9IgG能够以剂量依赖的方式抑制125I-5C9与经TSHR涂覆的管的结合(在0.005ng/mL时抑制11%，在100jig/mL时最多升至抑制88%)(表1)。125I-5C9的结合还被捐献者的血清IgG抑制(在0.05jig/mL时抑制15%，在1mg/mL时抑制91%)，以及被捐a血浆的稀释物抑制(在1:320的稀释度时抑制10%,在1:10的稀释度时92%)。表2a-c中显示了，5C9IgG在表达TS服的CH0细胞中阻断TSH和M22-介导的对环AMP的刺激的能力。猪TSH(3ng/mL)强烈地刺激环AMP的产生(19,020±2154fmol/细胞孔；平均值土SD;n=3)(表2a)。在存在0.1pg/mL的5C9IgG的情况下，猪TSH的刺激活性降低至11874±4214fmo1/细胞孔(平均值土SD;n=3)，并且该抑制效应于5C9浓度，在存在1jhg/mL的5C9时仅产生2，208±329fmol/细胞孔的环AMP(表2a)。淋巴细胞捐献者的血清ii^CH0-TSHR细胞中对TSH介导的环AMP刺激有强效应。如表2a中所示，在存在1:10稀释度的捐a血清的情况下(该稀释度下的总血清IgG浓度为1.43mg/mL)，对环AMP产生的抑制将其降低至大约6000fmol/细胞孔，这类似于不存在血清下的19000fmol/细胞孔。该效应对应于大约0.37mg/mL的纯化5C9IgG的效应(利用表2a中所示不同浓度5C9IgG的效应的稀释度曲线计算而得)。it4明，在阻断TSH刺激环AMP产生的能力这方面，纯化5C9IgG的活性比捐^T血清IgG高出大约3900倍。5C9的片段，例如5C9F(aV)2和5C9Fab也是有效的TSH刺激的抑制物。胁而言，5C9IgG、5C9F(ab。2和5C9Fab在100jag/mL时的TSH刺'激抑制活性是相同的(表2b)。在10mg/mL时，所有三种制品5C9IgG、5C9F(ab')2和5C9Fab也是TSH刺激活性的强效抑制剂，然而，5C9IgG似乎比5C9F(ab')2或5C9Fab更有效(表2b)。M22Fab(3ng/mL)是一种环層的强鈔!]激物(9，432±822fmol/细胞孑L)(表2c)，并iL^E存在5C9的情况下，M22Fab的刺激效应被以剂量皿的方式抑制，环AMP的水平在存在0.1pg/mL的5C9IgG的情况下降j氐至1,298±134fmol/细胞孔。M22刺激的完4^抑制出现于100jLig/mL的5C9时(表2c)。Scatchard分析表明了，1251-标记的5C9以4x101()L/mol的締合常数结合于TSHR。j^U6WiCP7y湖潜合耕斧/表3和图1中显示了，血清TRAb抑制125I-5C9IgG与经TSHR涂覆的管结合的能力。还为了比较之目的示出了相同血清TRAb对125I-TSH结合及125I-M22IgG结合的效应。125I-5C9IgG与TS服的结合没有被来自10个不同*捐血者的血清(Nl-N10，表3)明显抑制(抑制范围3.4-18.9%)。在125I-TSH和125I-M22抑制测定中(表3)，来自40名均为TSHR自身抗体阳性的格雷夫斯病患者的血清(Gl-G40，表3)对125I-5C9与经TS服涂覆的管结合(抑制范围22.0-85.2%)的抑制，达到了比来自Ai:捐血者的血清更大的程度(表3)。患者血清TRAb抑制化I-5C9IgG、125I-TSH或125I-M22IgG与TS服结合的能力是相当的，Pearson相关系数r=0.95(125I-5C9IgG与125I-TSH;图la)和r=0.95(125I-5C9IgG与"5l-M22IgG;图lb)。图lc显示相同血清对125I-TSH和125I-M22IgG抑制的比较(Pearson系数r=0.99)。这些实验表明，5C9IgG与TSHR的结合可被血清TRAb有皿抑制，并且血清TRAb对5C9IgG结合的抑制效应类似于它们对TSH或M22结合的抑制效应。表4显示了不同稀释度的具有TSH阻断活性的患者血清TRAb(Bl-B5)及具有强曱状腺刺激活性的患者血清TRAb(Sl、S2和S4)对^I-5C9IgG结合的抑制。125I-5C9IgG的结合被血清Bl-B5,以;Sjk清Sl、S2和S4以剂量依赖的方式抑制。同样这些阻断和刺激血清还以剂量依赖的方式抑制125I-TSH和1251-M22IgG结合，而且在同样的血清稀释度下所有三种经标记配体的抑制百分lbl相当的(表4a&b)。这些结a明，具有刺激活性和阻断活性的TSHR自身抗体可抑制5C9与TSHR的结合。舆,75^潜合丼浙;^遂^^/、扃旭6W^7-i^/^7^7y朋潜合^^命/测验具有125I-TSH结^^抑制活性的不同小鼠TSHRMab抑制125I-5C9与TS服结合的能力，并与对1251-M22IgG结合的效应进行比较(表5)。如表5中所示，具有抑制125I-TSH结合和125I-M22IgG结合的能力的所有Mab还抑制了125I-5C9结合，但在某些Mab的情况下对125I-5C9结合和125I-M22结合的抑制效应弱于对125I-TSH结合的^i:应。这些实验表明，5C9在TS服上的结合位点和小鼠TSHRMAb在TS肌上的结合位点之间有大量的重叠，所述小鼠TSHRMAb具有抑制TSH结合的能力。JC夕/^^4这7Sffi^勿應^^悉者j^^^^",/2^^^^遂^妓如表2中所示，5C9IgG能够在表达TSHR的CHO细胞中阻断TSH或M22对环AMP7jc平的刺激。在不同系列的实验中，测验了5C9IgG对患者血清TRAb的刺激活性的效应，结果显示于表6a中。血清Tl-T9和T11-T18在CHO-TS肌细胞中刺激了环AMP的产生，并且与对照MAbIgG(对人甲状llit氧化物酶特异性的2G4)的孵育对它们的刺激活性没有效应。然而，在存在5C9IgG(50nL的200jLig/mL)的情况下，所有测验血清的刺激活性都显著降低(表6a)。6种不同血清(T1、T6、T3、T19、T20和T21)的剂量响应效应显示于表6b-g中。在这些实验中，浓度范围O.lyg/mL-100jug/mL的5C9IgG导致了血清刺激活性的剂量依赖的降低，并JL^除血清T3^卜的所有测验^血清中，5C9IgG的效应都与9D33的效应相当，后者是具有阻断活性的抗TSHR的小鼠单克隆抗体(记载于W02004/050708A2中)。对于T3血清的情况(表6a&6d)，在存在100ng/mL的5C9IgG的情况下观察到对环AMP产生的约50%的抑制，而IOOng/mL的9D33IgG导致了几乎完全抑制。i^明，在5C9和9D33所识别的表位之间可能有一些微小差异。W7OT^C朋雄拃对J^W絲麟,豕厕/^絲除了抑制TSH和TS服抗体的剌激活性O卜，5C9在不存在这些甲状JW'J激物的情况下抑制了环AMP的产生量。M地，表6b显示了，在存在100jug/mL对照单克隆的IgG(2G4)的情况下所产生的1207±123fmol/细胞孔的环層，在存在100jig/mL的5C9IgG的情况下降低至301±38fmol/细胞孔。9D33IgG的效应较小，存在IOOpg/mL9D33IgG的情况下产生721±183fmol/细胞孔。在显示于表6d、6e、6f和6g的独立实验中得到了类似的结果。ii^明，5C9IgG对TSHR的基础活性或组成型活性具有显著的效应。iCP/W^4这逸含M磁^^^7^朋^C朋勿應9^^豕，,i辨_^图7中显示了，在CH0-TSHR细胞中，TSHR的单氨基酸突变对5C9阻断猪TSH的环AMP刺激活性的能力的效应。具体而言，在这样的CH0细胞中研究了5C9对环AMP产生的刺激的效应，即这种CH0细J^达以下残基突变成丙氨酸的TSHR:Lys58、lie60、Arg80、Tyr82、Thr104、Arg109、Lys129、Phe134、Asp151、Lys183、Gin235、Arg255、Trp258和Ser281。另外，在以下TS服戎基的情况下研究了对荷电突变进行改变的效应Arg80Asp、Aspl51Arg、Lysl83Asp和Arg255Asp,其中依照常规的表示法，被替换的氨基酸^J^其在原始序列的多肽中的位置被标明于替换氨基酸^t&之前。以前的研究已表明，对TSHRAspl60Lys的荷电突变进行改变导致TSHR失去了对TSH的响应性，而对M22的响应未受影响(专利申请W02006/016121A)。因此，使用M22作为环AMP的刺'激物，在CH0-TSHR细胞中研究了TSHRAspl60Lys突变对5C9生物活性的效应(表71)。在所研究的所有TSHR突变中，^现3个突变对5C9作为拮抗剂的能力有影响。Lysl29突变成Ala(表7h)导致5C9IgG完全丧失了阻断TSH对环AMP产生的刺激的能力。而且，TSHR突变Lysl83Ala引起了5C9IgG阻断活性的部分降低；在用TS服Lysl83Ala突变进行测验时，1jlig/mL时观察到对TSH刺激的28%#制，不同于l吏用野生型TSHR时的84。/浙制(表7m)。甚至在IOO/ig/mL的5C9IgG时，在用TSHRLysl83Ala突变的实验中仅检测对TSH刺激的部分抑制(43%),而在该浓度时，在用野生型受体的实验中观察到对TSH刺激活性的完全阻断(93%)(表7m)。如果正电荷的Lysl83突变成负电荷的天冬氨酸，那么对5C9生物活性的效应类似于使用Lysl83Ala突变时，见察到的效应(表7m)。这说明了，Lysl83对5C9的生物活性是重要的。在Aspl51Ala的情形下，观察到5C9IgG阻断活性出现了轻微的降低在lpg/mL时49。/浙制，不同于野生型的88。/。的抑制(表7j)。然而，在存在IOOjug/mL的5C9IgG的情况下，该活性与野生型TSHR相同。当负电荷的Aspl51突变成正电荷的精氨酸时，不会观察到5C9IgG阻断活性的显著降低(表7k)。可以将TS服突变对5C9活性的效应与TSHR突变对9D33活性的效应相比较。如专利申请W02006/016121A中所述，TSHR突变Lys58、Arg80、Tyr82、Arg109、Lys129和Phe134均对9D33活性有效应。然而，除了Lys129O卜，这些突变中没有一种狄5C9活性有效应。再者，如专利申请W02006/016121A中所述,在影响M22活性的突变(Arg80、Tyr82、Glu107、Arg109、Lys129、Phe130、Lys183、Tyr185、Arg255和Trp258)中，除Lys129之外没有一种影响了5C9活性。另外，Lys183突变对5C9活性和M22活性有部分的效应，但对9D33活性无效应。这些结^4明以下的TSHR戎基中存在不同，所述戎基即对于与曱状船'J激'I^A抗体M22、与小鼠阻断抗体9D33及与人阻断抗体5C9相互作用来i兌重要的TS肌■。因此，5C9与其他具有拮抗剂活性的TSHR抗体(如9D33)的结合可能是一种特别有效的方式，用于抑制患者血清TRAb的刺激活性、其他刺激物和/或TS服的组成型活性。对编码5C9的基因的序列分析表明，HCV区基因来自VH3-53家族，D基因来自D2-2家族，并且J基因来自JH4家族。在LC的情形下，V区基因来自012家族且J区基因来自JK2种系。HC的核苷酸和^J^^列分别显示于图2a和2b中，并且LC的核苷酸和^酸序列分别显示于图3a和3b中。与种系序列相比，HC基因序列中有体细胞突变；具体是FWR1中1个沉默突变、CDR2中2个替换突变、CDR3中1个沉默突变和1个替换突变以及FWR4中1个沉默突变。然而，HCV区序列的特征在于两个插入片段；一个在V基因和D基因之间长6个^i^JJft,另一个在D基因和J基因之间长15^Ntt对。因此，HCCDR1长5个氨基酸、CDR2长16个M酸且CDR3长18个氨基酸(图2b)。在LC序列中有FWR1中1个沉默突变、CDR1中1个替换突变、CDR3中1个替换突变;MLV基因和J基因之间6个>^1^长的插入片段。LCCDR1由11个M酸组成、CDR2由7个M酸组成且CDR3由10个^酸组成(图3b)。OT4'絲;fW#败表8中显示了用于检测TSHR自身抗体的ELISA实例，该ELISA基于5C9IgG-生物素与经TS服涂覆的板孔的结合。在该测定中，对于TSH-生物素结合的抑制呈阳性的所有样品均也对5C9IgG-生物素结合呈阳性。再者，TSH-生物素测定和5C9-生物素测定中的吸it^信号、抑制百分数和派生的单位/L值是相当的(表8)。"夕/W在或这7^朋^C朋勿應*#7、篇fn如表9中所示，5C9IgG能够阻断所有5种测验TSMAb(l、2、4、5和7)对环AMP产生的刺激。例如，TSMAbl(表9)刺激环AMP水平至18.94±7.4pmol/mL，而在存在IOOlag/mL的5C9IgG情况下仅产生1.24±0.07pmol/mL的环AMP。这可以与在存在100pg/mL的对照MAb2G4的情况下16.5±1.1pmol/mL的环層7JC平相比较(表9)。表9中以及下iL^10-15中显示的环AMP水平以pmol/mL表示，即每个细胞孔的环AMP水平为pmol/mL+5(>R^200iaL的来自每个测定孔的样品)。，7娜W哪滅9^义取OT々,iZAOT藉袭發遂絲^表2和表10中显示了5C9IgG阻断猪TSH对环AMP刺激的能力。另夕卜，5C9IgG显示了抑制天然人TSH(来自NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl,SouthMi咖s，PottersBarEN63QGUK的NIBSC参照制品81/565)和重组TSH(NIBSC参照制品94/674)两者对环AMP刺激的能力(表IO)。M而言，100ng/mL的重组或天然人TSH对环AMP产生的刺激需要O.1—1.0pg/mL的5C9IgG,以获得对环AMP产生的完全抑制。在采集用于分离5C9的血液时，捐"血清中的循环系统TSH的水平为160mU/L(大约32ng/mL),所得的结果(表2a和表10)表明，在血清中存在32-320ng/mL的5C9IgG的情况下将完全阻断该水平的循环系统TSH。使月对mI-M22与TSHR结合的抑制，评估了所述捐絲血清中TS服自身抗体的水平(如NakatakeN，SandersJ，RichardsT,BurneP，BarrettC，DalPraC，PresottoF，BetterleC,FurmaniakJ，ReesSmithB2006EstimationofserumTSHreceptorautoantibodyconcentrationandaffinity.Thyroid16:1077-1084中所述)，为1700ng/mL(120ng/mg),即比用于阻断TSH的曱状^^刺激所需的5C9浓度高出lt倍。iC夕/W叙^l^"絲奴W《7/、/柳r和，J/^T^朋^OT勿應^z^菱邀^;豕，话遂^放^在不存在曱状腺刺激物(即TSH或TS服抗体)时，5C9IgG在表达具有活化突变的TSHR的CHO细胞中能够降低环AMP的产生量。如表lla中所示，在不存在5C9的情况下，基础环AMP在表达具有活化突变S281I的TSHR的CHO细胞中的浓度为9.90±1.51pmol/mL，并JL^存在0.01jig/mL的5C9IgG的情况下它降低至4.17±0.60pmol/mL，JL^E存在1jng/mL的5C9IgG的情况下降低至3.44±0.63pmol/mL。阻断性小鼠TSHRMAb9D33和对照MAb2G4都几乎没有效果(表lla)。偵J1TS服活化突变1568T获得了类似的结果(表llb)，该结果显示了21.39±5.31pmol/mL的l^l;环層浓度。在添加1jag/mL的5C9IgG时它降低至5.29±0.75pmol/mL,不同于添加2G4IgG和5C9IgG的情形下分别至20.52±0.95pmol/mL和21.65±1.99pmol/mL。在_4>5*环AMP浓度为36.89pmol/mL的第三种TSHR活化突变研究(即A623I)的情形下，添加lpg/mL的5C9IgG将环AMP水平降低至16.43±1.27pmol/mL,这不同于^i4^无效应的ljag/ml的对照IgG2G4(28.96±2.29pmol/mL)或1jug/mL的9D33IgG(40.09±7.73pmol/mL)(表llc)。这些结W明，与小鼠阻断性MAb9D33不同，5C9对与TS服活化突变相关的环AMP产生具有显著的效应，即便是当所述突变在TSHR的不同部分时(即细胞外结构域中的S281I、跨膜结构域的第二细胞外环中的1568T及跨膜结构域的第三细胞内环中的A623I)。^或迷野jf7^朋^^朋^^9^#"7"妓^^^;凝.'iT夕、小^zy朋贿財2發絲卯"及这耕絲郝^#^洽yy踏,财豕,如前文的实验中和表12中所示，低至lMg/mL的浓度的人TSHR阻断性MAb5C9和小鼠TS服阻断性MAb9D33在CH0-TSHR细胞中具有阻断TSH的TSHR环鍵刺激活性的能力。如表12的实验l-5中所示，9D33IgG和5C9IgG对于由TSH介导的对环AMP的刺激的效应是可相加的。当两个不同浓度的TSH(3ng/mL和0.3ng/mL)用于刺激时(分别在表12的实验1-3及实验4和5中)，出现了同样的相加效应。在4这野i^7y朋WC朋勿^9^^"7"妓^^^凝iCP、V、^7y朋鹰4^^^^z^戎脊卯"及这席;^##^^遂^##于洽#"介爭^^f豕,如前文所示，5C9和9D33还能在CH0-TSHR细胞中抑制由M22Fab介导的对环AMP的刺激。9D33IgG和5C9IgG对于由M22介导的对环AMP的刺激的效应是可相加的(表13,实验l-4)。当两个不同浓度的M22Fab(3ng/mL和0.3ng/mL)用于刺激时(分别在表13的实验1和2及实验3和4中)，出现了同样的相加效应。5C9IgG和9D33IgG对于由TSH和M22两者介导的对环AMP产生的刺激的相加效应都是类似的(表12和13)。^每个勿^;^4迷义量野i^^朋WfiW*^^iT夕;^^&^伊或f每个细胞均表达大约5x1()S个受体的CH0细胞系与前文实验中(例如表9-13)使用的标准CH0细胞系(每个细胞表达大约5x1(T个TS肌)相比，显示了较高水平的基础(即未受激的)环AMP,即分别是47.1±11.7pmol/mL和大约1.0pmol/mL。使用每个细胞均表达大量受体的细胞系评估了5C9IgG和9D33IgG对野生型TSHR基础活性的效应。与9D33IgG和抗GAD(5B3)的阴性对照抗体的孵育导致了对基础环層活性的0-5.3%抑制(表14;实验1),表明该阻断性小鼠MAb9D33或对照MAb在表达野生型TSHR的CH0细胞中对基础环AMP产生没有效应。然而，在5C9IgG的情形下观察到对基础环AMP活性的明显抑制(表14;实验2)，0.1jig/mL和10ng/mL分别导致45.7%和74.6%的抑制。另外，在每个细胞均表达大量野生型TSHR的CHO细胞中，5C9Fab和5C9F(ab')也^础环AMP活性的有效抑制剂(表14实验3)。例如，1jLig/mL和100Mg/mL的5C9Fab分别显示了对基础环AMP产生的39%和61%的抑制，均不同于IOOjug/mL的5C9F(abO的48%的抑制(表14实验3)。#^"#戎浙^^錄乃矛#沐悉4^^75^々,戎雄"这舆才承化爻^/w《r邦7^朋^c朋勿應拃;^^a^伊4菱遂^^,^^^^t^在存在20.5±8.7pmol/mL的环AMP测定緩冲液的情况下，TS服I568T细胞的基础环AMP产生M上不会受到添加来自使豪捐血者的正常混合血清(NPS)或3种不同个体的^J:捐血者血清(N1-N3)的影响，所iiA清是以1/10和1/50的稀释度测验的。与在存在环AMP测定緩冲液的情况下的基础环AMP产生相比，在存在NPS和Nl-N3血清的情况下的基础环AMP产生显示了0-14%的抑制(表15)。然而，在存在具有高水平阻断型TRAb的4种不同血清(B2-B5)的情况下则观察到对基础环AMP产生的23-89%的抑制(表15)。在存在5C9IgG(ljug/mL)的情况下，》见察到对TSHR1568T基础环AMP活性的83%的抑制。表15中还显示了，2种阻断性血清(B3和B4)在表达具有I568T突变的TSHR的CH0细胞中对基础环AMP产生的剂量响应效应。这些结a明，5C9具有患者阻断性TSHR自身抗体的TSHR阻断活性特征，具体地有关TS服活化突变体I568T中对基础环AMP产生的抑制。#才潜#浙话遂沐惑4^#7^朋々^#戎#^4^#,承化^^W《7/^7y朋#OT滅^IU^尸4狄粉豕,承顯放^"在存在环AMP测定緩冲液的情况下，TSHRS281I细胞的基础环AMP产生为11.2±2.0pmol/mL，并且与*捐血者^^血清或个体的#^捐血者血清(1/10或1/50稀释)的孵育没有效应(表16)。相反，在存在具有高水平阻断类型TRAb的4种不同血清(B2-B5)的情况下，观察到对^5dl环AMP产生的31-56°/。的抑制(表16)。在使用TSHRS281I的实验中，1pg/mL的5C9IgG引起了对M环AMP活性的71%的抑制。:^才祟戎W;^^沐悉者j^,7y朋^,戎沐^4这4I發化^^J"J/^r腳^，雄付^^/^狄紛法絲淑在存在环AMP测定緩冲液的情况下，TSHRA623I细胞的基础环AMP产生为43.5±11.2pmol/mL，并JLi^不受与^^捐血者;^^血清或个体的血清的孵育的影响(表17)。在这些实验中，与具有高水平阻断型TRAb的4种不同血清(B2-B5)进行孵育引起了对环層的-1%-56%的抑制(表17)。这可以与在相同实验中由1|ig/mL的5C9IgG引起的49°/。的抑制相比较。^辜个勿^J^4迷Jx7《个野j^7^朋^C卵^^^,^^jf祟戎浙法遂沐惑者J^fW朋々,戎#考^^^^《邀^>豕,承#^妓^在该系列实验中，在每个细胞均表达较高数目野生型TSHR的CH0细胞中的J^环AMP产生为28.1±0.7pmol/mL。当所述细胞与1/10稀释度的健康捐血者〉'^^血清或个体血清(Nl-N3)进行孵育时，基础环AMP水平的范围是在存在环AMP测定緩冲液的情况下的环AMP7JC平的99%-146%,而该范围在1/50的稀释度时为93%-137%。在具有阻断型TSHR自身抗体的4种测验血清中，一种血清(B2)对基础环AMP产生无效应(表18)。在两种血清(B3和B5)的情形下，环AMP的水平高于在存在环AMP测定緩冲液的情况下观察到的水平(表18)。有充分理由的是，血清B3和B5包^—种具有刺激活性和阻断活性的TSHR自身抗体的混合物。相反，以1/10和1/50稀^^度的血清B4对基础环AMP产生有明显的抑制效应，即相与在存在环AMP测定緩冲液的情况下的水平相比分别为基础环AMP水平的31%和61%(表18)。与在存在环AMP测定緩冲液的情况下的水平相比，这可以与在存在lyg/mL的5C9IgG的情况下33%的水平相比较(表18)。总5C9IgG在以野生型TSHR或以具有活化突变的TS服转染的CHO细胞中对基础环AMP产生的效应，与使用来自对阻断型TS服自身抗体阳性的患者的血清时观察到的效应类似。然而，在不同突变的情形下个体患者血清的效应是不同的(表19)。在野生型TSHR的情形下，一些血清显示了刺激效应，19):'、；''1、化夕^或这逸含郝凝^^^7Sffi^C朋勿^7^AlCZJ^t^邀W放,在表达具有氨基酸突变的TSHR的CH0细胞中，将5C9对环AMP产生的刺激的效应扩展至包括以下至丙氨酸的突变Asp43、Glu61、Hisl05、Glul07、Phel30、Glul78、Tyrl85、Asp203、Tyr206、Lys209、Asp232、Lys250、Glu251、Thr257、Arg274和Asp276(表20a-p并总结于表21中)。将TS服的氨基酸Asp43、Glu61、Hisl05、Glul07、Tyrl85、Asp232和Thr275突变成丙氨酸，对5C9IgG抑制TSH刺激环AMP产生的能力没有效应。通过将TSHRPhel30、Glul78、Asp203、Tyr206、Lys250、Glu251和Asp276突变成丙氨酸，降低了5C9抑制TSH刺激环AMP产生的能力。在Lys209Ala和Asp274Ala这两个突变的情形下，5C9IgG抑制TSH刺激环AMP产生的能31力升高。总之(表7、20和21)，与野生型TS服比较，10个TSHR戎基Lys129、Phel30、Aspl51、Glul78、Lysl83、Asp203、Tyr206、Lys250、Glu251和Asp276都降低了5C9抑制TSH的环層刺激的能力。TSHR的Lysl29和Asp203突变显示了最大的效应并引起对5C9活性的完全抑制。^t迷野j^7y朋^fiW勿^f"^^^迷^^^W^朋v^/^。A/a^勿^尹化凝逸4^Wj&;^""^考,洽75^介寻^^/*^^^邀^放^92%的抑制)在TSHRAsp203Ala突变的情形下降低至4%(表22)。阻断'I;ijk清B4活性不受TSHRAsp203Ala突变的影响，而与野生型TSHR相比，在TS服Asp203Ala的情形下，使用阻断'hijfe清B2和B3时观察到对TSH诱导的环AMP刺激的抑制百分数稍低。在一种血清B5的情形下，观察到对TSH诱导的环AMP刺激的抑制百分数出现了显著降低；即在野生型和突变的TSHR中不同，分别抑制69%和30%。TSHRAsp203Ala突变对5C9活性的效应大于对阻断'I^血清活性的效应，然而3/4的测验血清的阻断活性被影响至不同的程度。这可能表明了，用于阻断TS服自身抗体的结合位点和5C9有重叠，但是与不同血清接触的实际TSHR氨基酸中存在一些差异。总结和结论上文描述的实验提供了这样的证据，即根据本发明的抗体(例如5C9)能阻断不同曱状腺刺激物的刺激活性，所述甲状船'J激物包括人和小鼠TSHR刺激性抗体、天然的人和动物TSH以及重IEATSH。再者，提供了这样的证据，即两种不同的阻断类型的抗体——人MAb5C9和小鼠MAb9D33,在被单的刺激的能力，并且在被混合在一块时显示出对TSH或M22刺激的可相加阻断效应。根据本发明的抗体(例如5C9)对TSHR基础(即未受激的)环AMP活性的新效应。已通过使用具有更高基础环AMP水平的TSHR转染CHO细胞的实验研究了这些效应，即已确证了根据本发明的抗体(例如5C9)对基础环AMP活性的阻断效应。再者，已表明，一些含有具有阻断(拮抗剂)活性的TSHR自身抗体的血清在这些TSHR转染的细胞中具有阻断基础环AMP活性的能力。这些实^ii提供了这样的证据，即根据本发明的抗体(例如5C9和血清TSHR阻断性抗体)对与活化TSHR突变相关的基础环AMP活性有阻断效应。这些结果强调，5C9是一种显示阻断类型的TSHR自身抗体的特征的人Mab，即它是与自身免疫曱状腺疾病相关的患者血清TSHR自身抗体的^R表。所述的实M使得可鉴定这样的一些TSHR氨基酸，即这些TSHR氨基酸对于根据本发明的抗体的阻断活性是重要的。总的来说，这些结a明，根据本发明的抗体(例如5C9)与在来自患自身免疫曱状腺疾病患者的不同血清中出现的TSHR阻断性抗体相比，显示出类似的TSHR结合活'J^类似的对TS肌功能的生物效应。因此，由于具有血清阻断性TSHR自身抗体的特征和生物活性，根据本发明的抗体(例如5C9)可在多种临床病症中用于将TSHR失活。这些病症包括TSH介导的TSHR活化、由曱状腺刺激性TSHR自身抗体介导的TS肌活化、^A(即未受激的、组成型)TSHR活性以及与活化性TSHR突变相关的TSHR活化。因此，梠4t本发明控制；例如格雷夫k病、格雷一夫斯眼:、由TSHR活化突变引起的曱状腺功能亢进症、由TSH水平异常(病理学的或药理学的)引起的甲状腺功能亢进症、曱状腺癌和曱状腺癌转移。33力5C9IgG、捐淋巴细胞者IgG、捐淋巴细胞者血浆对于mI-TSH、1251-M22IgG或1251-5C9IgG与经TSHR涂覆的管结合的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>标记的示踪物与经TSHR涂覆的管的平均结合%为:在用"5l-TSH的实验中14%;在用125I-M22IgG的实验中21%;并JL在用125I-5C9的实验中20%;HBD混合物=^J:捐血者血清的混合物；2G4=对照IgG(抗甲状腺过氧化物酶的人MAb)。或2a5C9IgG或捐、淋巴细胞者血清IgG在表iiATSHR的CH0细胞中对于环AMP产生的TSH刺激的效应<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>a按所示将捐^血清稀释于环AMP测定緩冲液b通过浊度法测定的未稀释血清IgG浓度为14.3mg/mL5C9IgG和TSH稀释于环AMP测定緩冲液中。5C9IgG、F(ab')2和Fab片M表iiATS服的CHO细胞中对TSH诱导的环AMP产生的抑制实施例1<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>样品<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>i^M0^羊品的平均值2G4=对照IgG(抗甲状lM:氧化物酶的人MAb)。抗体和TSH制品稀释于环AMP测定緩冲液中。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>9D33是一种可在表达TSHR的CHO细胞中阻断由TSH和TRAb介导的对环AMP产生的刺激的小鼠抗体。抗体和TSH制品稀释于环AMP测定緩沖液中。125I-5C9IgG、1251-TSH和125I-M22IgG与经TS肌涂覆的管的结合及患者血清样品对其的抑制血清样品'"I-5C9结合抑制(％)")I-TSH结合抑制(％)'"I-M22结合抑制(％)Nl15.709.3N23.31.27.2N315.31.90.7N44.04.20N518.96.311.4N65.92.91.4N717.17.29.4N85.500N911.24.22.9画10.56.55.8Gl79.683.680.5G275.877.573.5G382.277.578.1G477.774.974.8G577.073.671.5G664.771.669.1G775.674.366.0G873.774.77741G976.178.579.2G1075.975.869.9Gll81.682.579.7G1271.676.673.9G1372.371.170.2G1481.985.880.9G1584.985.384.4G1680.584.981.7G1785.086.985.3G1884.98584.2G1985.187.385.4G2084.489.387.7G2177.684.977.0G2267.159.761.5G2357.562.259.5G2465.767.164.4G2559.356.362.3G2638.467.769.4G2722.059.158.9G2868.369.772.8G2940.954.250.4G3071.269.172G3162.259.262.042<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>或比较具有阻断或刺激活性的患者血清对于,-5C9IgG、1251-TSH和I-M22IgG与经TS服涂覆的管的结合的抑制测定样品'"I-5C9结合抑制(％)结合抑制(％)"5I-M22结合抑制(％)测定校验物40U/L879084.48U/L626763.02U/L152725.61U/L4.31514.8阳性对照血清343538.7阻断性血清Bl1/5939591.71/10929489.21/20919185.91/40858078.8函675567.4l膽333345.91/320201726.444<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>Bl-B5为含有高水平的具有拮抗剂(阻断)活性的TRAb的患者血清。B3是来自捐淋巴细胞者的5C9血清S1、S2和S4为含有高水平的具有激动剂(刺船活性的TRAb的患者血清。测定校验物40U/L、8U/L、2U/L和1U/L为M22IgG在他豪捐血者血清混合物(HBD混合物)中的稀释物，以U/L的NIBSC90/672表示的活性是通it^t经标记的TSH与经TSHR涂覆的管的结合的抑制来进#^估。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>其中A=试^^样品；B=HBD混合物NT=未#1/5、1/10等表示"^^血清在HBD^^物中的稀释因子，纯品=未稀释的血清在存在HBD混合物的情况下，大约20%、17%和12%的经1251-标记的M22IgG、5C9IgG和TSH分别结合于经TSHR涂覆的管。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>抗体稀释于使泉捐血者血清混合物(HBD混合物)中,抑制％=100.百xlOO其中A=存在测验样品的情况下的结合％;B=存在HBD混合物的情况下的结合％。1具有曱状腺刺激活性的小鼠TSHRMAb2可阻断由TSH和TRAb介导的对环AMP产生的刺激的小鼠TSHRMAb(见表2)3抗曱状J!^itlU匕物酶MAb的人MAb(阴性对照)4具有TSH阻断活性的小鼠TSHRMAb(可识别由TS服氨基酸381-385形成的表位)5具有TSH阻断活性的小鼠TSHRMAb(可识别由TSHR氨基酸36-42形成的表位)6具有TSH阻断活性的小鼠TSHRMAb(可识别由TS服氨基酸246-260形成的表位)3小鼠TgMAb(阴性对照)在存在HBD混合物的情况下，大约13%、24%和15%的经1251-标记的5C9IgG、M22IgG和TSH分别结合于经TSHR涂覆的管。5C9IgG在表达人TS服的CH0细胞中对于由患者血清中TRAb对环AMP产生的刺激的效应实验la<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>T17+5C9IgGud仅T18910±126T18+2G4IgG830±21T18+5C9IgGud实验ld样品环AMP(ftnol/细胞孔平均值士SD;n=3)仅环AMP测定緩冲液487±75仅HBD混合物285±71HBD混合物+2G4IgG311±68HBD混合物+5C9IgG108±33仅Tll4052±233Tl1+2G4IgG4659±1260Til+5C9IgG154±33仅m4058±721T12+2G4IgG5556±593T12+5C9IgG145±241=两次测定HBD混合物为M捐血者血清的混合物；这些实验中所用的是在环AMP测定緩沖液中以1:10的稀释度稀释。Tl-T9和T11-T18为在表达TSHR的CH0细胞中刺激环層产生的血清。Tl-T9和Til-T18以1:10稀释于环AMP测定緩冲液中进行"^。2G4是一种抗曱状腺it!U匕物酶的人单克隆抗体(阴性对照)。2G4IgG和5C9IgG在lOOjig/mL下进行试验。58<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>Tl为在表达TS服的CHO细胞中刺激环AMP产生的患者血清样品；以1:10稀释于环AMP测定緩冲液中进行试验。2G4是一种抗甲状腺过氧化物酶的人单克隆抗体(阴性对照)。9D33为一种抗阻断由TSH和TRAb刺激的环AMP产生的TSHR的小鼠单克隆抗体(膽2)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>5C9IgG在表iiATSHR的CHO细胞中对于由患者血清TRAb对环AMP产生的刺激的剂量响应效应实验3<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>单次测定见表6a和6b的说明性脚注。《M5C9IgG在表iiATSHR的CH0细胞中对于由患者血清中TRAb对环AMP产生的刺激的剂量响应效应样品环AMP(finol/细胞孔平均值士SD;n-3)仅环AMP测定緩冲液622±79仅HBD混合物479±53仅T314023±2487仅100ng/mL2G4IgG745±136T3+100pg/mL2G4IgG12086±2613T3+10|ag/mL2G4IgG12862±250T3+1(jg/mL2G4IgG12931±891T3+0.1(xg/mL2G4IgG13853±1589T3+0.01pg/mL2G4IgG11939±131T3+0.001pg/mL2G4IgG13650±1679仅100Hg/mL9D33IgG616±U1T3+100|ag/mL9D33IgG1597±323T3+10ng/mL9D33IgG4262±367T3+1pg/mL9D33IgG7385±554T3+0.1pg/mL9D33IgG11960±13卯T3+0.01ng/mL9D33IgG12178±167662<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>或fe5C9IgG在表达人TSHR的CH0细胞中对于由TRAb患者血清对环AMP产生的刺激的剂量响应效应样品环AMP(finol/细胞孔平均值土SD;n=3)仅环AMP测定緩冲液616±161仅HBD混合物312±56仅T196014±280仅100pg/mL2G4IgG1058±75T19+100jig/mL2G4IgG7142±215T19+10ng/mL2G4IgG6182±46T19+1|ag/mL2G4IgG7280±1052T19+0.1ng/mL2G4IgG7275±145T19+0.01ng/mL2G4IgG6820±729T19+0,001pg/mL2G4IgG7620±870仅IOO(xg/mL9D33IgG592±168T19+100pg/mL9D33IgG550±65T19+10ng/mL9D33IgG448±76T19+1ng/mL9D33IgG404±36T19+0.1pg/mL9D33IgG23941T19+0.01pg/mL9D33IgG5765164<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>1xM^样品的平均值2单次测定参见表6a和6b的说a月性脚注。^U尸5C9IgG在表达人TSHR的CH0细胞中对于由患者血清中TRAb对环AMP产生的刺激的剂量响应效应样品环AMP(finol/细胞孔平均值±SD;n=3)仅环AMP测定緩冲液255±40仅HBD混合物200±82仅T214764±732仅100pg/mL2G4IgG835±94T20+100ng/mL2G4IgG6684±931T20+10|ig/mL2G4IgG4571±776T20+1ng/mL2G4IgG5744±727T20+0.1pg/mL2G4IgG4323±849T20+0.01ng/mL2G4IgG6396±1314T20+0.001ng/mL2G4IgG6789±893仅100pg/mL9D33IgG382±142T20+100jag/mL9D33IgG287±164T20+10pg/mL9D33IgG204±49T20+1ng/mL9D33IgG9801T20+0.1|ag/mL9D33IgG5362±574T20+0.01jag/mL9D33IgG5389±113966<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>^紐5C9IgG在表达人TSHR的CHO细胞中对于由患者血清中TRAb对环AMP产生的刺激的剂量响应效应样品环AMP(finol/细胞孔平均值土SD;n=3)仅环AMP测定緩冲液466±65仅HBD混合物390±118仅T219781±1672仅100ng/mL2G4IgG999±55T21+100|^g/mL2G4IgG10848±373T21+10ng/mL2G4IgG10355±469T21+1|ig/mL2G4IgG廳l±140T21+0.1pg/mL2G4IgG12215±793T21+0.01|ag/mL2G4IgG13014±855T21+0細jxg/mL2G4IgG10500±162仅100pg/mL9D33IgG534±89T21十100ng/mL9D33IgG442±32T21+10ng/mL9D33IgG605±254T21+1pg/mL9D33IgG1383±66T21+0.1pg/mL9D33IgG8719±389T21+0.01ng/mL9D33IgG10772±79968<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>参见表6a和6b的说明性脚注。47a在表达野生型TSHR和Lys58突变成丙氨酸的TSHR的CH0细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>1xM^样品的平均值pTSH浓度=3ng/mL所有稀释都于环AMP测定緩冲液中2G4是一种抗甲状J^it!U匕物酶的人单克隆抗体(5C9的阴'l^照)。在表达野生型TSHR和Ile60突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>在表达野生型TSHR和Arg80突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。试验样品产生的环AMP(finol/细胞孔；平均值土SD,n=3)突变/野生型(%)野生型TSHR突变TSHR仅环AMP测定緩冲液775±661165±32150仅TSH12467±51012930±1791042G410pg/mL+TSH13600±155514849±4621092G400|ag/mL+TSH11726±17713539±3141155C90.01pg/mL+TSH14410±133114273±1845995C90.1ng/mL+TSH11256±16279278±837825C91.0pg/mL+TSH6704±7911358±500205C910ng/mL+TSH2107±2641163±415555C9100ng/mL+TSH2234±540518±13323仅5C9100ng244±92494±163202参见表7a的说明'I":iJ鄉注。72在表达野生型TSHR和Arg80突变成天冬氨酸的TS服的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>参见表7a的说明，I;iJ御注。在表达野生型TSHR和Tyr82突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>在表达野生型TSHR和Argl09突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>参见表7a的说明性脚注。《7力在表达野生型TS服和Lysl29突变成丙氨酸的TSHR的CH0细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>参M7a的说明性脚注。《7/在表达野生型TSHR和Phel34突变成丙氨酸的TS肌的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>参见表7a的说明性脚注。^7_/在表达野生型TS服和Aspl51突变成丙氨酸的TSHR的CH0细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula>在表达野生型TS服和Aspl60突变成赖氨酸的TS服的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>参膽7a的其他说明',注。<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>47/7在表达野生型TSHR和Lysl83突变成天冬氨酸的TSHR的CH0细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>参见表7a的说明性脚注。47o在表达野生型TSHR和Gln235突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>参见表7a的说明性脚注。或7;在表达野生型TSHR和Arg255突变成丙氨酸的TSHR的CH0细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>或7《在表达野生型TSHR和Arg255突变成天冬氨酸的TSHR的CH0细胞中TSHi秀导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>参见表7a的说明性脚注。在表达野生型TS服和Trp258突变成丙氨酸的TSHR的CH0细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9IgG的效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage89</formula>比较使用基于对TSH-生物素结合或5C9IgG-生物素结合的抑制的ELISA获得的血清TRAb测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>重组体人TSH100ng/mL和0.1ng/mL5C9IgG7.39±1.74重组体人TSH100ng/mL和1.0ng/mL5C9IgG0.07±0.01重组体人TSH100ng/mL和10pg/mL5C9IgG0.07±0.01重组体人TSH100ng/mL和100pg/mL5C9IgG0.11±0.03仅天然的猪TSH0.3ng/mL40.2±4.0天然的猪TSH0.3ng/mL和O週|ag/mL5C9IgG.32.7±4.0天然的猪TSH0.3ng/mL和0.01ng/mL5C9IgG28.2±2.04天然的猪TSH0.3ng/mL和0.1pg/mL5C9IgG18.0±1.36天然的猪TSH0.3ng/mL和1.0pg/mL5C9IgG2.14±0.85天然的猪TSH0.3ng/mL和10pg/mL5C9IgG0.20±0.14天然的猪TSH0.3ng/mL和0.18±0.13100ng/mL5C9IgG95<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>477a5C9IgG和9D33IgG对具有活化突变S281I的TSHR的组成型活性的效应稀释于环AMP测定緩冲液中的试验样品表达TSHRS281I的CHO细胞中的环AMP浓度(p迈ol/mL平均值土SD;n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>a2G4是一种对照的抗曱状腺过氧化物酶的人单克隆抗体。5C9IgG和9D33IgG对具有活化突变I568T的TSHR的组成型活性的效应<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>力7c5C9IgG和9D33IgG对具有活化突变A623I的TSHR的组成型活性的效应稀释于环AMP测定緩冲液中的试验样品表达TSHRA621I的CH0细胞中的环AMP浓度(pmo1/mL平均值±SD;n=3)仅緩冲液36.89a0細|ig/mL2G4IgG28.46±2.310.01ng/mL2G4IgG33.44±1.120.1jiig/mL2G4IgG30.40±7.931)ng/mL2G4IgG28.96±2.290遍pg/mL5C9IgG26.52±1.330.01pg/mL5C9IgG27.03±2.130.1jng/mL5C9IgG19.79±0.481pg/mL5C9IgG16.43±1.270扁pg/mL9D33IgG29.55±3.150.01)ig/mL9D33IgG27.64±3.490.1pg/mL9D33IgG31.78土9.181pg/mL9D33IgG■9±7.73两次测定100<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>实验3环AMP测定緩冲液中的试验样品环層浓度(pmoI/mL平均值±SD;n=3)仅緩冲液0.99±0.03TSH3ng/mL51.3+5.0100pg/mL9D331.14±0.13100ng/mL5C90.50±0.04100pg/mL9D33+100^g/mL5C90.66±0.9100ng/mL9D33+TSH10.53±0.84100pg/mL5C9+TSH1.4±0.18100pg/mL9D33+100pg/mL5C9+TSH1.3±0.3610ng/mL9D33+TSH13.5土2.9lOpg/mL5C9+TSH1.9±U10ng/mL9D33+10|ag/mL5C9+TSH1.2±0.11Mg/mL9D33+TSH27.8±2.21ng/mL5C9+TSH5.4土1.81ng/mL9D33+1|ag/mL5C9+TSH5.2±0.30.1ng/mL9D33+TSH35.1土2.30.1ng/mL5C9+TSH18.7±3.40.1lig/mL9D33+0.1ng/mL5C9+TSH14.4土1.00.01ng/mL9D33+TSH47.1±1.90.01^g/mL5C9+TSH33.9±7.80.01jag/mL9D33+0.01ng/mL5C9+TSH27.8±1.3102<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>环AMP测定緩冲液中的试验样品环AMP浓度(pmol/mL平均值士SD;n=3)仅緩冲液1.83+0.64TSH0.3ng/mL17.26±1.5lO^g/mL9D332.07土0.5210pg/mL5C90.38±0.210jig/mL9D33+10Mg/mL5C90.96±0.14lO^g/mL9D33+TSH3.57±0.5810|ag/mL5C9+TSH1.17±0.0010ng/mL9D33+10pg/mL5C9+TSH1.58±0.205pg/mL9D33+TSH3.71±0.105|ig/mL5C9+TSH1.21±0.361(ag/mL9D33+TSH6.38±1.351pg/mL5C9+TSH2.57±0.651jag/mL9D33+1|a^mL5C9+TSH1.46±0.590.1pg/mL9D33+TSH14.67±4.690.1ng/mL5C9+TSH12.43±1.590.1pg/mL9D33+0.1jag/mL5C9+TSH9.99±3.781044"5C9加9D33在表达野生型TSHR的CH0细胞中对于阻断由M22Fab介导的对基础环AMP产生的刺激的效应实验l环<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>环AMP测定緩沖液中的试验样品环AMP浓度(praol/mL平均值土SD;n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>环AMP测定緩冲液中的试验样品环AMP浓度(pmol/mL平均值土SD;n-3)仅緩冲液1.29+0.68M220.3ng/mL31.1+9.4100ng/mL9D332.38±1.11雨iag/mL5C90.12±0.09100ng/mL9D33+100ng/mL5C90.81±0.15100pg/mL9D33+M222.00±0.87100ng/mL5C9+M220.22±0.11100pg/mL9D33+100ng/mL5C9+M220.40±0.1810pg/mL9D33+M221.25±0.0910pg/mL5C9+M220.40±0.1710ng/mL9D33+10(ig/mL5C9+M220.45±0.311ng/mL9D33+M222.66±0.641pg/mL5C9+M220.21±0.181pg/mL9D33+1ng/mL5C9+M220.14土0.070.1ng/mL9D33+M2227.6土2.50.1pg/mL5C9+M226.0±2.60.1pg/mL9D33+0.1pg/mL5C9+M227.2±3.90.01ng/mL9D33+M2238.9±6.40.01ng/mL5C9+M2231.5±4.00.01jig/mL9D33+0.01jag/mL5C9+M2220.6±5.30細|ag/mL9D33+M2243.2±7.90.001pg/mL5C9+M2233.1±4.00.001jag/mL9D33+0.001pg/mL5C9+M2225.3±6.01084"5C9和9D33IgG在表达野生型TSHR的CHO细胞(每个细胞大约5x10个受体)中对基础环AMP产生的效应实验l<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>在不表达TSHR的对照CHO细胞中，在存在环AMP测定緩冲液的情况下基础环層产生量为l.02±0.06pmol/mL(平均值土SD;n=3),站存在3ng/mL的TSH的情况下为0.74±0.32pmol/mL(平均值±SD;n=3)。-ve=阴性，即不抑制环AMP产生。<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>5C9Fab和F(ab')在表达野生型TSHR的CHO细胞中对基础环AMP产生的效应环AMP测定緩冲液中的试验样品环AMP浓度P,VmL(平均值±SD;n=3)基础环AMP产生量的抑制X仅环AMP测定緩冲液59.4±8.609D33IgG100ng/mL67.8±1.09D33IgGlOiag/mL79.4±9.8-V69D33IgG1jxg/mL71.5±8.8-V69D33IgG0.1|xg/mL75.6±8.9-V69D33IgG0.01ng/mL60.5±7.5-V69D33IgG0.001ng/mL52.3±6.3125C9IgG100pg/mL26.2±1.8565C9IgG10pg/mL24.5±5.859111<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>力J具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体(B2-B5)在表达TSHRI568T活性突变的CHO细胞中对基础环AMP水平的效应实验l<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>实验2试验样品和血清稀释度环AMP浓度pmol/mL(平均值±SD;n=3)基础环AMP产生量的抑制M仅环AMP测定緩冲液19.7±3.70HBD混合物/1028.0±1.6-V6HBD混合物/5018.1±3.98HBD混合物膽18.0±1.69HBD混合物/50017.8±1.310HBD混合物/100020.7±2.9-V6HBD混合物/500015.6±2.120B3/1014.7±2.225B3/5013.7±1.331B3細12.6±0.636B3/50019.0±0.84B3細O18.4±4.67B3/500017.6±0.911B4/104.0±0.580B4/503.6±0.881B4膽3.8±1.181B4/5007.2±2.664B4/100012.0±0.639B4/500017,7±2.710-ve=阴性，即不抑制环AMP产生。HBD混合物-#^捐血者血清的混#114Nl-N3=个体的^J:捐血者血清所有血清都稀释于环AMP测定緩冲液中。幻f具有拮抗剂活性的患者血清TS服自身抗体(B2-B5)在表达TSHRS281I活性突变的CHO细胞中对基础环AMP水平的效应试验样品和血清稀释度环AMP浓度pmol/mL(平均值±SD;n喝基础环AMP产量的抑制4仅环AMP测定緩冲液11.2±2.00HBD/1012.1±0.6-8HBD/5010.0±2.011Nl/108.0±1.628Nl/5010.8±3.34N2/108.8±1.421N2/508.8±2.322N3/1010.0±0.817N3/509.3±1.717B2/107.7±03931B2/505.7±1.349B3/105.4±0.552B3/506.6±1.141B4/105.4±1.152B4/504.910.756B5/109.1±2.518B5/507.610.832115参M15的说明性御注。在用TSHRS281I的实验中，1pg/mL的5C9IgG引^hi^环層活性的71%#制。^t〃具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体(B2-B5)在表达TSHRA623I活性突变的CHO细胞中对基础环AMP水平的效应<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>参Ml5的说明性脚注。在用TS服A623I的实验中，1pg/mL的5C9IgG引^t基础环AMP活性的49%#制。《7《具有拮抗剂活性的患者血清TS肌自身抗体(B2-B5)在表达野生型TSHR的CHO细胞(每个细胞大约5x105个受体)中对基础环雄水平的效应<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>基础环AMP产生量的改变(%)=存在试验样品的情况下的环AMP产生量、:存在环AMP测定缓冲液的情况下的环AMP产生量XM在1pg/mL的5C9IgG的情况下，基础环AMP水平降低至在存在环AMP测定緩冲液的情况下的水平的33%。《"具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体(B2-B5)在TSHR转染的CHO细胞中对基础环AMP水平的效应的总结CHO细胞存在以下物质的情况下环AMP的浓度(fmol/细胞孑L;平均值士SD，n=3):.<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>。HBD混合物=健康捐血者血清的混合物所使用的HBD混合物和血清B2-B5为以1:10稀释于环AMP测定緩冲液中。所使用的5C9IgG为以lpg/mL的浓度溶于环AMP测定緩冲液中。B2-B5在表达野生型TSHR的CHO细胞中阻断由TSH或M22对环AMP产生的刺激。或2&5C9IgG在表达野生型TSHR和Asp43突变成丙氨酸的TSHR的CH0细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>1两次测定的平均值2单次测定pTSH浓度=3ng/mL所有稀释都是在环AMP测定緩冲液中a5B3是一种抗谷氨酸脱羧酶(GAD)的人单克隆抗体(5C9的阴性对照)。《2卵5C9IgG在表达野生型TSHR和Glu61突变成丙氨酸的TSHR的CH0细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应试验样品<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>雀厕5C9IgG在表达野生型TSHR和Glu107突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应实验l<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>参见表20a的说明性脚注。<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>参见表20a的说明性脚注。<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>5C9IgG在表达野生型TSHR和Tyr185突变成丙氨酸的TSHR的CH0细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应<table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>UD=低于测定检测的限值。参见表20a的说明性脚注。衷2处5C9IgG在表达野生型TSHR和Asp203突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>参见表20a的说明性脚注。5C9IgG在表达野生型TSHR和Tyr206突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应试验样品<table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>4W5C9IgG在表达野生型TSHR和Lys209突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>参见表20a的说明性脚注。<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>5C9IgG在表达野生型TSHR和Lys250突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应试验样品产生的环AMP(finol钿胞孔；平均值士SD，n=3)突变/野生型(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>参见表20a的说明性脚注。5C9IgG在表达野生型TSHR和Glu251突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>参见表20a的说明性脚注。《，5C9IgG在表达野生型TSHR和Thr257突变成丙氨酸的TSHR的CH0细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>参见表20a的说明性脚注。<table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table>4卿5C9IgG在表达野生型TSHR和Asp276突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应实验l试验样品产生的环AMP(finol钿胞孔；平均值士SD,n=3)突变/野生型(％)野生型TSHR突变TSHR仅环AMP测定緩冲液365±1661454±258398仅TSH17500±72722416±25701285B3alOpg/mL+TSH19354±179425180±56091305B3a100ng/mL+TSH21671±206425707±41011195C90.01ng/mL+TSH17236±270526212±25971525C90.1ng/mL+TSH5594±72316856±21103015C91.0pg/mL+TSH759'4788±5536315C9lO^g/mL+TSH366±1451384±6023785C9lOOjig/mL+TSH344±566565±176164仅5C9100ng/mL300±242602±274201参见表20a的i兌明性脚注。实验2试验样品产生的环AMP(finol/细胞孔；平均值士SD，n=3)突变/野生型(％)野生型TSHR突变TSHR仅环AMP测定緩冲液156±30601±190385仅TSH13852±75614616±4531065B3a10|ig/mL+TSH13025±329217706'1365B3a100jig/mL+TSH14245±1024I翻±45611275C90.01|ig/mL+TSH14066±229121213±34431515C90.1n咖L+TSH4462±3637320±16141645C91.0|ag/mL+TSH657±2571513±8352305C910pg/mL+TSH541±2241301±9112405C9100ng/mL+TSH286±184288±87101仅5C9100pg/mL208±15314±69151参见表20a的说明性脚注。137<table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>所使用的pTSH浓度=3ng/mL。TSHR突变的相对效应表示为使用野生型所观察到的百分数，如下一+++++=100%的野生型活性；++++=〈100-80%的野生型活性；+++=<80-60%的野生型活性；++=<60-40%的野生型活性；+=<40-20%的野生型活性；0=<20%的野生型活性，以及相对于野生型的升高活性>100%=+++++++。NT=未试验。a由于对TSH无应答，使用M22测验该实验中对环AMP的刺激(详见正文)。139TSHRAsp203Ala突变对以下方面的效应具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体(B2-B5)阻断由TSH对环AMP产生的刺激的能力试验样品和血清稀释度a野生型TSHR环AMP浓度finol/细胞孔。平均值±SD;n=3野生型TSHR对TSH刺激的环AMP水平的抑制％&TSHRAsp203Ala环AMP浓度fino1/细胞孔。平均^LhSD;n=3TSHRAsp203Ala对TSH刺激的环AMP水平的抑制f环AMP测定緩冲液242±130292±89TSHC9357±11557591±832TSHC+1pg/mL1110±811929400145C9HBD混合物/10183±67496±76TSHC+HBD13303±18190975610pool/10B2/10110±36270±72TSHC+B2/10454±381971963±35780B3/10329'582±74TSHC+B3/103407±1341744027±27859B4/1059±22161±36TSHC+B4/10278±7398150±4198B5/10647±1701064±228TSHe+B5/104173±515696871±618301稀释于环AMP测定緩冲液中。b对TSH诱导的环AMP刺激的抑制W存在试验样品/10和TSH(3ng/mL)的情况下产生的环AMPX|_—存在/10HBD混合物和TSH(3ng/mL)的情况下产生的环AMP1双份样品的平均值epTSH以3ng/mL的终浓度使用。HBD混合物=健康捐血者血清的混合物。140权利要求1.一种分离的抗促甲状腺激素受体(TSHR)的人抗体，所述抗体是一种促甲状腺激素(TSH)的拮抗剂。2.—种分离的抗TSHR的人源化抗体，所述抗体是一种TSH的拮抗剂。3.根据权利要求1或2的抗体，所述抗体是一种甲状腺刺激性抗体的拮抗剂。4.根据权利要求1、2或3的抗体，所述抗体具有患者血清TSHR自身抗体的TSH拮抗剂特性，所述患者血清TSHR自身抗体是TSH拮抗剂。5.根据权利要求3或4的抗体，所述抗体是一种TSH的拮抗剂，并且是一种曱状腺刺激性抗体的拮抗剂。6.根据任一项前逸权利要求的抗体，所述抗体具有患者血清TSHR自身抗体的拮抗剂特征，所述患者血清TSHR自身抗体是甲状腺刺激性抗体的拮抗剂。7.根据任一项前it^利要求的抗体，所述抗体是一种TSH、M22或者对TS肌有刺激活性的抗体或有阻断活性的抗体与TSHR或其一部分结合的抑制剂。8.根据权利要求7的抗体，其中所述TSHR部分包括TSHR的富含亮氨酸的结构域(LRD)或其相当大的部分。9.根据权利要求7或8的抗体，所述抗体阻断这种结合。10.根据任一项前i^K利要求的抗体，所述抗体是一种单克隆抗体或重组抗体，或者包含其片段或由其片^i且成。11.根据任一项前逸&利要求的抗体，所述抗体包含一个Vh区，所述VH区包含一个或多个选自以下的互补决定区(CDR):a)S證S(CDR1);b)VTYSGGSTSYADSVKG(CDR2);或c)GGRYCSSISCYARSGCDY(CDR3)或者一种或多种基本与这些CDR同源的M酸序列。12.根据任一项前述权利要求的抗体，所述抗体包^-~个Vl区，所述VL区包含一个或多个选自以下的CDR:a)RASQSISNYLN(CDR1);b)AASSLQS(CDR2);或c)QQSYSSPSTT(CDR3)或者一种或多种基本与这些CDR同源的M酸序列。13.根据任一项前*利要求的抗体，具有约101。L/mol的对^v全长TSHR的结合亲和力。14.根据ii^利要求1-12任一项的絲，具有约109L/mol的对人全长TS服的结合亲和力。15.—种核苷酸，包括a.—种编码根据权利要求1-14任一项的抗体的核苷酸序列；b.选自以下的核苷酸序列或其一部分gaagtgcagctggtggagtctggaggaggcctgatccagcctggggggtceetgagactctcct^gcagcctctgggtteaecgtcagtageaaetacatgag邻ggtccgcc鄉eteeagggaagggget,gtgggtctcagttaettategcg织ggtagMcatcctacgcagactccgtg鄉ggccgattea^catctccagagacaattccaapacacgctgtatctteaaatgaacagcctga鹏ccgagg纖鄉ccgtgtattaet跑cgagaggggggcgatattgtagtagtataagctgctacgcgaggagcgggtgtgactact鹏gcoagg接aacectggtcacc^ctcctcagcctceaccaagggcceateggtottccccctggcaccctcctccaagageacctctgggggcaeagcggccetgggd:g<xtggteaaggactacttcccc,ccggtgacggt:gtcgtggaactcaggcgccctgacc8gcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctoaggactetact(xetcagcagegtggtgacc魄ecctccagcagcttgggcacccagacctacatetgcaaGgtgaateacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactagt;或gccatocagatgacccagtaccttcctccctgtet接catetgtag^tgacagagteaccateaettgccgggcaagtca鹏cattageaacta飾aatt敏atcagcagaaaeca鹏aaagccGctaagetcctgatetatgctgeatccagtttgcaaagtggggtoccateaaggttca魏geagtggatccaacttaetactgtcaacagagtt織gttecccctccaceaettttggecaggggaccaagctggagat備acgaactgtggctgcaecatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataaettetatcccagagaggccaaagtaeagtggaaggtggateacgccetecaatcgggtaacteccag鹏敏gtoacagagcagpicagcaaggacagcacctacagccteagcagcaccctgacgct伊gcaaagcagactacgagaaacac繊梦etacgcctgcgaagtcaeecatcagggcctgagetcgcccgt所述核苷酸序列或其一部分编码抗体Vh結枸域;以及抗体Vl結枸域或者选自以下的CDR:i.SNYMS《CDIU);",VTYSGGSTSYADSVKG(CDR2);iii.GGRYCSSISCYARSGCDY(CDR3);iv.RASQSISNYLN(CDR1);v.AASSLQS(CDR2);或vi.QQSYSSPSTT(CDR3);或者C.一种与a.或b.的核苷酸序列高度同源的核苷酸序列，以及一种编码以至少约109L/mo1的亲和力与TS服结合的抗体的核苷酸序列。16.—种包含根据权利要求15的核苷酸的栽体。17.—种包含根据权利要求1-14任一项的抗体的分离的细胞。18.—种表达根据权利要求1-14任一项的抗体的分离的细胞。19.一种分泌根据权利要求1-14任一项的抗体的分离的细胞。20.根据权利要求17、18或19的分离的细胞，所述细胞来自一种稳定的杂交瘤细胞系。21.—种组合物，所述組合物包含确定浓度的TS服自身抗体，并包含一种根据权利要求1-14任一项的抗体。22.—种组合物，所iy且合物包^^确定浓度的具有TSH拮抗剂活性的TS肌自身抗体，包括一种根据权利要求1-14任一项的抗体。23.—种组合物，所述组合物包含确定浓度的TS肌自身抗体，包括一种根据权利要求1-14任一项的抗体，所述TSHR自身抗体为甲状動'J激性抗体的拮抗剂。24.—种组合物，所i^i且合物包含确定浓度的具有TSH拮抗剂活性的TS肌自身抗体，包括一种根据权利要求1-14任一项的抗体，所述TSHR自身抗体为甲状腺刺激性抗体的拮抗剂。25.—种用于给予哺乳动物受试者以治疗一种甲状糾目关病症的药物组合物，包含根据权利要求1-14任一项的抗体和可药用载体。26.根据权利要求25的药物组合物，其中所述曱状糾目关病症选自甲状腺活动过度、格雷夫斯眼病、新生儿甲状腺功能亢进症、M毛膜促性腺激素诱导的曱功能亢进症、胫骨前粘液水肿、甲状腺癌和曱状腺炎。27.根据权利要求25或26的药物组合物，所述药物组合物适^^对A^药。28.根据权利要求25、26或27的药物组合物，其中所述抗体对所述受试者的免疫系统没有显著不利影响。29.根据权利要求25-28任一项的药物组合物，所i^J且合物包括一种或多种另外的促曱状^素受⑩抗剂。30.根据权利要求29的药物组合物，其中所述另外的促甲W^激素受体拮抗剂为9D33。31.根据权利要求25-30任一项的药物组合物，用于以一种可注射形式治疗一种甲状l^目关病症。32.根据权利要求25-30任一项的药物组合物，用于以一种局部给药形式治疗胫骨前粘液水肺。33.根据权利要求25-30任一项的药物组合物，用于以滴眼剂的形式治疗格雷夫斯眼病。34.—种产生根据权利要求1-14任一项的抗体的方法，所述方法包括培养一种根据权利要求17-20任一项的细胞，从而通过所述细胞表达所述抗体。35.根据权利要求34的方法，其中通过所述细胞分泌所述抗体。36.—种在哺乳动物受试者中或者在源自所述受试者的细胞中治疗一种曱状糾目关病症的方法，所述方法包括将所述受试者或所述细胞与4艮据权利要求1-14任一项的抗体相接触。37.根据权利要求36的方法，其中所述甲状斜目关病症选自甲状腺活动过度、格雷夫斯眼病、新生儿甲状腺功能亢进症、人绒毛膜促性g素诱导的曱M功能亢进症、胫骨前粘液水肿、曱状腺癌和甲炎。38.—种在哺乳动物受试者的曱状腺中抑制甲状腺刺激性自身抗体剌激TSHR的方法，所述方法包括将所述受试者与根据权利要求1-14任一项的抗体相接触。39.根据权利要求38的方法，其中甲旨刺激性自身抗体与TSHR的结^s故阻止。40.—种在哺乳动物受试者中抑制曱状腺刺激性自身抗体与甲状腺外TSHR结合的方法，所述方法包括将所述受试者与根据权利要求1-14任一项的抗絲接触。41.根据权利要求40的方法，其中所述甲状腺外TSHR位于所述受试者的眶后组织和/或胫骨前组织。42.#4§权利要求40或41的方法，其中所述抗体可阻断TS服自身抗体与曱状J!^卜TS服的结合。43.—种在受试者中或在源自受试者的甲#细胞中治疗甲状腺中的甲状腺癌或者转移的甲状腺癌的方法，所述方法包括将所述癌细胞与^^据权利要求1-14任一项的抗体相接触，目的是在所述细胞中抑制组成型促甲状腺激素受体活性。44.根据权利要求43的方法，其中所述甲状腺癌细胞的再生长被12Uh或者fel迟。45.—种在受试者中或在源自受试者的甲状腺细胞中治疗由组成型甲状腺活'l^it成的曱状腺活动it^的方法，所述方法包括将所述受试者或细胞与才艮据权利要求1-14任一项的抗体相接触，目的是抑制这种甲状腺活动it^。46.根据权利要求36-45任一项的方法，其中所述受试者是人。47.根据权利要求1-14任一项的抗体用于治疗一种曱状IM目关病症的用途。48.,权利要求1-14任一项的抗体在制备用于治疗一种曱状糾目关病症的药剂制品中的用途。49.根据权利要求1-14任一项的抗体，用于医学疗法。50.根据权利要求l-14任一项的抗体用于治疗一种甲状糾目关病症。51.根据权利要求50的抗体，其中所述甲状糾目关病症选自甲状腺活动过度、格雷夫斯眼病、新生儿甲M功能亢进症、人绒毛膜促性腺激素诱导的甲状腺功能亢进症、胫骨前粘液水肿、甲状腺癌和甲状腺炎。52.—种表征TS服抗体的方法，所述方法包括确定一种待测验TSHR抗体与一种具有TSHR-相关^酸序列的多肽的结合情况，其中所述方法涉及一步使用根据权利要求1-14任一项的抗体的方法步骤。53.根据权利要求52的方法，所述方法包括确定根据权利要求1-14任一项的抗体对于TSHR抗体与所述多肽的结合的效应。54.根据权利要求53的方法，其中所述TS服-相关多肽包含全长的人TSHR。55.—种^^征TSH和相关分子的方法，包^^确定待测验的TSH或一个相关分子与一种具有TSHR-相关^酸序列的多肽的结合情况，其中所述方法涉及一步使用根据权利要求1-14任一项的抗体的方法步骤。56.—种ELISA形式的根据权利要求55的方法。57.—种确定参与结合作为拮抗剂的TS服自身抗体的TSHRJL^酸的方法，所述方法包括提供一条具有根据权利要求1-14任一项的抗体可结合的TSHR-相关第一^J^酸序列的多肽、在所述TSHR-相关的^J^酸序列中修饰至少一个氨基酸，以及确定这样的改变对所述抗体结合的效应。58.—种改变一种根据权利要求1-14任一项的抗体的方法，所述方法包括修饰所述抗体的至少一个氨基酸，以及确定这样的修饰对结合于一条TS肌-相关序列的效应。59.根据权利要求58的方法，其中选择对所述TSHR的亲和力增强的经修饰TSHR抗体。60.—种鉴定可抑制甲状腺刺激性抗体与TSHR结合的分子的方法，所述方法包括提供至少一种根据权利要求1-14任一项的抗体作为参照物。61.根据权利要求60的方法，其中选择阻止甲状腺刺激性抗体与TSHR结合的分子。62.—种鉴定可抑制甲状腺阻断性抗体与TS肌结合的分子的方法，所述方法包括提供至少一种根据权利要求1-14任一项的抗体，作为参照物。63.根据权利要求62的方法，其中选择阻止甲状腺阻断性抗体与TS服结合的分子。全文摘要本发明提供了一种分离的TSHR抗体，所述抗体是一种TSH的拮抗剂。本发明还涉及应用本发明的抗体的方法。文档编号C07K16/18GK101657468SQ200880011577公开日2010年2月24日申请日期2008年2月14日优先权日2007年2月15日发明者B·瑞斯史密斯,J·桑德斯,J·福尔曼克申请人:Rsr有限公司