专利名称：小带素的肽拮抗剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及小带素(zonulin)的肽拮抗剂，以及其使用方法。所说的肽拮抗剂可与闭锁小带受体结合，但在生理上不调节哺乳动物紧密连接的开放。
背景技术：
I.肠紧密连接的功能和调节紧密连接(“tj”)或闭锁小带(此后称为“ZO”)是吸收和分泌性上皮的标志物之一(Madara，J.Clin.Invest.，831089-1094(1989)；和Madara，Textbook of Secretory Diarrhea Eds.Lebenthal等，第11章，125-138页(1990))。作为顶部和基底侧部分之间的屏障，它们选择性地调节离子和水溶性溶质通过细胞旁通路的被动扩散(Gumbiner，Am.J.Physiol.，253(Cell Physiol.22)C749-C758(1987))。这个屏障维持着由跨细胞途径的通路活性产生的任何梯度(Diamond，Physiologist，2010-18(1977))。
跨上皮传导的变化通常引起细胞旁通路通透性的改变，因为肠细胞浆膜的阻力相对较高(Madara，见前)。ZO代表着在这种细胞旁通路中的主要屏障，上皮组织的电阻似乎依赖于跨膜蛋白链的数量及其在ZO内的复杂性，如用冷冻蚀刻电镜所观察到的那样(Madara等，J.CellBiol.，1012124-2133(1985))。
具有充足证据的是ZO，曾被认为是稳定的结构，实际上是动态的，很容易地适应各种发育的(Magnuson等，Dev.Biol.，67214-224(1978)；Revel等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Boil.，40443-455(1976)；和Schneeberger等，J.Cell Sci.，32307-324(1978))、生理的(Gilula等，Dev.Biol.，50142-168(1976)；Madara等，J.Mebr.Biol.，100149-164(1987)；Mazariegos等，J.Cell Biol.，981865-1877(1984)；和Sardet等，J.CellBiol.，8096-117(1979))、和病理的(Milks等，J.Cell Biol.，1032729-2738(1986)；Nash等，Lab.Invest.，59531-537(1988)；和Shasby等，Am.J.Physiol.，255(Cell Physiol.，24)C781-C788(1988))环境。构成这种适应的调节机制仍不完全清楚。但是，可以明确的是，在Ca2+的存在下，ZO的集合是细胞相互作用的结果，这种相互作用触发了一个复杂的生化过程级联反应，最终导致了一个有组织的ZO元件网络的形成和调节，这些元件的组成仅部分地被阐明(Diamond，Physiologist，2010-18(1977))。一个跨膜蛋白链的候选物，闭合素(occludin)，最近已经被鉴定(Furuse等，J.Membr.Biol.，87141-150(1985))。
在构成膜接触基础的细胞浆膜下斑块中已经鉴定了6种蛋白，但它们的功能仍有待确定(Diamond，见前)。ZO-1和ZO-2作为一个杂二聚体(Gumbiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，883460-3464(1991))与一个未确定的130kD蛋白质(ZO-3)一起存在于一个对去垢剂稳定的复合体中。大多数免疫电镜研究已经将ZO-1精确定位于膜接触点之下(Stevenson等，Molec.Cell Biochem.，83129-145(1988))。两个其他的蛋白质，cingulin(Citi等，Nature(London)，333272-275(1988))和7H6抗原(Zhong等，J.Cell Biol.，120477-483(1993))则位于距膜更远的位置，但尚未被克隆。Rab13，一个小的GTP结合蛋白最近也被定位在连接区(Zahraoui等，J.Cell Biol.，124101-115(1994))。其他小的GTP结合蛋白已知可调节皮质细胞骨架，也就是，rho可调节肌动蛋白—膜在局灶接触点的附着(Ridley等，Cell，70389-399(1992))，rac可调节生长因子诱导的膜皱褶(Ridley等，Cell，70401-410(1992))。根据对已经较好定性的细胞连接、局灶接触点(Guan等，Nature，358690-692(1992))和粘附连接(Tsukita等，J.Cell Biol.，1231049-1053(1993))中斑块蛋白已知功能的推理，可以假设与tj相关的斑块蛋白在跨越细胞膜的两个方向和在调节与皮质肌动蛋白细胞骨架的连接中，参与信号的转导。
为适应上皮所受到的许多不同的生理和病理刺激，ZO必须能发生迅速和协调的反应，因此需要一个复杂的调节系统的存在。涉及ZO集合和调节的机制的精确特性是目前一个活跃的研究领域。
现在有大量的证据表明，在肌动蛋白细胞骨架和吸收性细胞的tj复合体之间存在tj结构和功能的联系(Gumbiner等，见前；Madara等，见前；和Drenchahn等，J.Cell boil.，1071037-1048(1988))。肌动蛋白细胞骨架是由一个微丝的复杂网络组成，微丝的精确几何构型是由大量的肌动蛋白结合蛋白骨架调节的。一个肌动蛋白结合蛋白的磷酸化状态如何调节细胞骨架与细胞浆膜结合的实例是肉豆蔻酸盐的、富含丙氨酸的激酶C底物(此后称为“MARCKS”)。MARCKS是一个特殊的蛋白激酶C(此后称为“PKC”)底物，伴随于浆膜的胞浆面(Aderem，Elsevier Sci.Pub.(UK)，438-443页(1992))。以其非磷酸化形式，MARCKS与膜肌动蛋白相互交联。因此，很可能肌动蛋白网络经MARCKS与膜相联系是相对刚硬的(Hartwig等，Nature，356618-622(1992))。活化的PKC使MARCKS磷酸化并从膜上释放(Rosen等，J.Exp.Med.，1721211-1215(1990)；和Thelen等，Nature，351320-322(1991))。与MARCKS相连的肌动蛋白很可能在空间上与膜分离并变得更有弹性。当MARCKS去磷酸化时，它重新回到膜上并在此再与肌动蛋白交联(Hartwig等，见前；和Thelen等，见前)。这些数据表明纤维肌动蛋白(F-actin)网络可能通过一个涉及肌动蛋白结合蛋白(MARCKS是其中之一)的PKC依赖的磷酸化过程进行重排。
多种的细胞内调节因子已显示改变tj功能和/或结构。两栖动物胆囊(Duffey等，Nature，204451-452(1981))，和金鱼(Bakker等，Am.J.Physiol.，246G213-G217(1984))及比目鱼(Krasney等，Fed.Proc.，421100(1983))肠的紧密连接，当细胞内cAMP升高时，均显示了对被动离子流的阻力增强。而且，将两栖动物胆囊暴露于钙离子载体似乎可增加tj的阻力，并导致tj结构的改变(Palant等，Am.J.Physiol.，245C203-C212(1983))。此外，用佛波醇酯激活PKC可增加肾(Ellis等，C.Am.J.Physiol.，263(Renal Fluid Electrolyte Physiol.32)F293-F300(1992))和肠(Stenson等，C.Am.J.Physiol.，265(Gastrointest.LiverPhysiol.，28)G955-G962(1993))上皮细胞系的细胞旁通透性。
II.血—脑屏障血—脑屏障(BBB)是一个极薄的膜屏障，对溶质的自由扩散有高度地阻力，并将血液和脑分隔开。药物或溶质以分子大小通过此膜的移动几乎为零，除非该化合物具有包含在BBB膜中的几个特异类酶样转运机制之一的通路。BBB由多种细胞组成，而不是单一的上皮细胞层。在组成BBB的四种不同的细胞类型(内皮细胞、外膜细胞、星形胶质细胞和神经细胞)中，毛细血管的内皮细胞成分代表了BBB通透性的限制因素。在脊椎动物脑和脊髓中的毛细血管内皮具有tj，关闭了内皮细胞之间的孔，该孔正常存在于外周组织的微血管内皮细胞屏障中。最后，内皮的tj在BBB有限的通透性中起作用。
III.闭锁小带毒素大多数通过删除编码霍乱毒素(CT)的ctxA基因而构建的霍乱弧菌疫苗候选物，能够引起高度的抗体反应，但超过一半的疫苗接受者仍然发生轻度的腹泻(Levine等，Infect.Immun.，56(1)161-167(1988))。根据在缺乏CT的条件下所引起的腹泻程度，可以假设霍乱弧菌可以产生其他的产肠毒的因子，这些因子仍然存在于去除了ctxA序列的菌株中(Levine等，见前)。结果，发现了由霍乱弧菌产生的第二个毒素，闭锁小带毒素(此后称为“ZOT”)，它可以解释残余的腹泻现象(Fasano等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，85242-5246(1991))。zot基因直接位于ctx基因旁边。在霍乱弧菌菌株中zot基因和ctx基因共同出现的高百分比(Johnson等，J.Clin.Microb.，31/3732-733(1993)；和Karasawa等，FEBSMicrobiology Letters，106143-146(1993))表明ZOT在导致霍乱典型的急性脱水性腹泻中可能有协同作用。最近，zot基因也已在其他肠病原体中得到鉴定(Tschape，2nd伤寒热和其他沙门氏菌病亚洲-太平洋研论会，47(摘要)(1994))。
以前曾发现，当在兔回肠粘膜上进行试验时，ZOT通过调节细胞间tj的结构增加肠通透性(Fasano等，见前述)。发现作为细胞旁通路调节的结果，肠粘膜变得更易通透。还发现ZOT并不影响Na+-葡萄糖偶联的活性转运，是非细胞毒性的，且不能完全消除跨上皮的阻力(Fasano等，见前述)。
最近，已发现ZOT能可逆性地开放肠粘膜的tj，因此当用作口服药处方以肠道药物输送，与治疗药物共同使用时，ZOT能够影响治疗药物的肠道输送(WO 96/37196；1995年5月24日提交的美国专利申请序列号第08/443,864申请；和美国专利5,665,389；和Fasano等，J.Clin.Invest.，991158-1164(1997)；其中每一个均在此整体引用作为参考)。也已发现ZOT能够可逆性地开放鼻粘膜中的tj，因此当ZOT与一个治疗药物共同使用时，能够增强治疗药物的鼻粘膜吸收(1997年1月9日提交的美国专利申请序列号第08/781,057申请，；在此整体引用作为参考)。
在此整体引用作为参考的、1997年2月20日提交的美国专利申请08/803,364中，一个ZOT受体从一个肠细胞系，即CaCo2细胞中被鉴定并纯化。进一步，在此整体引用作为参考的、1998年2月17日提交的美国专利申请09/024,198中，ZOT受体从人肠、心和脑组织中已被得到鉴定和纯化。ZOT受体代表了涉及肠和鼻通透性调节的细胞旁通路的第一个步骤。
IV.Zonulin在未授权的于1997年5月21日提交的美国专利申请098/859,931中，，在此整体引用作为参考，免疫学和功能上与ZOT相关的哺乳动物蛋白，作为哺乳动物紧密连接的生理调节物，已被鉴定和纯化。这些哺乳动物蛋白，称为“zonulin”，可用于增强治疗药物通过肠和鼻粘膜tj以及通过血脑屏障tj的吸收。
在本发明中，zonulin的肽拮抗剂首次被鉴定。所述的肽拮抗剂与ZOT受体结合，但并不在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放。肽拮抗剂竞争性地抑制ZOT和zonulin与ZOT受体的结合，因此抑制ZOT和zonulin生理性调节哺乳动物紧密连接开放的能力。
发明概述本发明的一个目的是鉴定zonulin的肽拮抗剂。
本发明的另一个目的是合成和纯化所述的肽拮抗剂。
本发明的另一个目的是应用所述的肽拮抗剂作为在胃肠道炎症治疗中的抗炎剂。
本发明的另一个目的是应用所述的肽拮抗剂抑制血脑屏障的破坏。
本发明的这些和那些目的，将很明显地表现在下面提供的本发明详细描述中，在一个实施方案中是通过zonulin的肽拮抗剂实现的，该zonulin的肽拮抗剂包括选自如下序列的氨基酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQID NO15，SEQ IDNO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ IDNO24，和SEQ ID NO35，其中所述的肽拮抗剂与一个ZOT受体结合，但并不在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放。
图表的简要描述
图1显示了从兔肠中纯化的zonulin(■)与各种阴性对照相比(从Q-琼脂糖柱中得到的片断2(◇)；片断3(●)；片断4(▲)；和片断5(□))，对CaCo2单层细胞的组织阻力(Rt)的作用。
图2显示了从兔肠中纯化的zonulin(■)与阴性对照(□)相比，对置于Ussing室中的兔回肠的组织阻力(Rt)的作用。
图3显示了从兔肠中纯化的zonulin(■)与阴性对照(zonulin+抗ZOT抗体(□)；zonulin+抗tau抗体(△)；和tau(▲))相比，对置于Ussing室中的兔回肠的组织阻力(Rt)的作用。
图4A和4B显示了从人脑(▲)、人肠(●)、或人心脏(○)中纯化的zonulin与阴性对照(□)相比，对置于Ussing室中的恒河猴空肠(图4A)和恒河猴回肠(图4B)的组织阻力(Rt)的作用。
图5A和图5B显示了从人心脏(▲)或人脑(□)中纯化的zonulin与阴性对照(■)相比，对置于Ussing室中的兔空肠(图5A)和兔回肠(图5B)的组织阻力(Rt)的作用。
图6显示了从兔和人不同组织中纯化的zonulin N末端序列的比较。
图7显示了从人不同组织中纯化的zonulin和IgM重链的N末端序列与ZOT生物活性片断(氨基酸288-399)的N末端序列的比较。
图8显示了ZOT、zonulini、zonulinh，单独(实心条)、或与肽拮抗剂FZI/0(空白条)或FZI/1(阴影条)合用，与阴性对照相比，对置于Ussing室中的兔回肠的组织阻力(Rt)的作用。N等于3-5；*为P＜0.01。
发明的详细描述如上所述，在一个实施方案中，上述的本发明的目的是通过zonulin的肽拮抗剂实现的，该肽拮抗剂包括选自如下序列的氨基酸序列SEQID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ IDNO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，和SEQ ID NO35，其中所述的肽拮抗剂与ZOT受体结合，但并不在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放。
肽拮抗剂的大小在本发明中不是关键的。一般来说，肽拮抗剂的大小应在8到110个氨基酸的范围内，优选地从8到40个氨基酸，更优选地为8个氨基酸。
肽拮抗剂可采用已知的技术化学合成和纯化，如在≤肽和蛋白质的高效液相色谱分离分析和构象≥，Mant等编辑，C.R.C.印刷(1991)中所描述的，和一个肽合成仪，如Symphony(Protein Technologies，Inc.)；或通过重组DNA技术，即将编码肽的核苷酸序列插入到合适的表达载体中，如一个大肠杆菌或酵母表达载体，在各自的宿主细胞中表达，并采用已知的技术从中纯化。
肽拮抗剂可被用作抗炎剂以治疗引起肠道通透性增加的胃肠道炎症。因此，本发明的肽拮抗剂可用于治疗，如导致蛋白丢失性肠病的肠道疾病。蛋白丢失性肠病可由以下原因引起感染，如C.顽固性感染、小肠结肠炎、志贺氏菌病、病毒性胃肠炎、寄生虫感染、细菌过度增生、Whipple’s病；具有粘膜糜烂或溃疡的疾病，如胃炎、胃癌、，胶原性结肠炎、炎性肠病；以淋巴管阻塞为特征的疾病，如，先天性肠淋巴管扩张、伯克氏淋巴瘤、肠系膜结核，和用Fontan氏手术矫正先天性心脏病术后。
不发生溃疡的粘膜疾病，如，Ménétrier’s病、乳糜泻、嗜酸粒细胞性胃肠炎；和免疫疾病，如全身性红斑狼疮或食物过敏，主要是对牛奶过敏(也见≤小儿胃肠道疾病病理生理学诊断措施≥中的表40-2，Wyllie等编辑，Saunder Co.(1993)，536-543页；在此整体引用作为参考)。
因此，在其他的实施方案中，本发明涉及一个治疗胃肠道炎症的方法，该法包括给予需要此种治疗的患者有药效剂量的zonulin的肽拮抗剂，其中所述的肽拮抗剂包括选自如下序列的氨基酸序列SEQ IDNO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ IDNO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ IDNO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQID NO22，SEQ IDNO23，和SEQ ID NO24，其中所述的肽拮抗剂与所述患者肠内的ZOT受体结合，但并不在生理上调节所述肠道中紧密连接的开放。
为此，肽拮抗剂可以作为口服药剂组合物为小肠输送给药。这种为小肠输送的口服药剂组合物在本领域中为人熟知，一般包括胃不吸收的片剂或胶囊(Remington’s药物科学，16th版，Oso 1编辑，MackPublishing Co.，89章(1980)；Digenis等，J.Pharm，.Sci.，83915-921(1994)；Vantini等，Clinica Terapeutica，145445-451(1993)；Yoshitomi等，Chem.Pharm.Bull.，401902-1905(1992)；Thoma等，Pharmazie，46331-336(1991)；Morishita等，药物设计和输送，7309-319(1991)；和Lin等，Pharmaceutical Res.，8919-924(1991)；其中每一篇均在此整体引用作为参考)。
片剂通过添加，如醋酸纤维素邻苯二甲酸酯或醋酸纤维素对苯二甲酸酯，以制成胃不吸收的制剂。
胶囊是固体的药剂形式，其中肽拮抗剂包被在一个硬的或软的，可溶性容器或明胶外壳中。在制备胶囊中使用的明胶是通过水解成胶物质获得的。有两种类型的明胶。A型，来源于经酸处理的猪皮，B型，从碱处理的骨和动物皮肤中获得。硬明胶胶囊的使用允许根据每个患者的最佳考虑选择单一肽拮抗剂的处方或以准确的剂量水平进行合用。硬明胶胶囊由两个部分组成，一部分套在另一部分上，因此完全地包绕肽拮抗剂。在这些胶囊的较长端填入肽拮抗剂或含有肽拮抗剂的胃不吸收小珠，然后盖上盖。硬明胶胶囊主要由明胶、FD&C着色剂，有时需要遮光剂如二氧化钛制成。USP允许用于此目的的明胶中含有0.15％(w/v)的二氧化硫以在生产过程中防止分解。
在本发明的内容中，为小肠输送的口服药剂也包括液体组合物，其中含有水性缓冲剂以防止肽拮抗剂被胃中的胃液明显地灭活，从而使肽拮抗剂以活性的形式到达小肠。可在本发明中使用的这种水性缓冲剂的实例包括碳酸氢盐缓冲剂(pH5.5到8.7，最好是大约pH7.4)。
当口服药剂是一个液体组合物时，最好在服药前配制这种药剂以减少稳定性问题。在这种情况下，液体组分可通过在水性缓冲剂中溶解冻干的肽拮抗剂进行制备。
肽拮抗剂可被用于抑制血脑屏障的破坏。因此，本发明的肽拮抗剂可用于治疗，如伴有血脑屏障破坏的疾病状态。这些疾病状态的实例包括渗透性损伤，如脑缺血、中风或脑水肿；高血压；二氧化碳；痉挛发作；化学毒素；尿毒症(肾功能不全)；脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎，如感染性(病毒(SRV、HIV等)、或细菌性(结核、溶血性流行性感冒、脑膜炎球菌等)、或过敏性；肿瘤；创伤性脑损伤；放射性脑损伤；未成熟和核黄疸；脱髓鞘疾病，如多发性硬化症或Guillian-Barre综合征。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及伴有血脑屏障破坏的疾病状态的治疗方法，包括给予需要这种治疗的患者药效学上有效剂量的zonulin的肽拮抗剂，其中所述的肽拮抗剂是由氨基酸序列SEQ IDNO35组成，其中所述的肽拮抗剂与所述患者脑中的ZOT受体结合，但并不在生理上调节所述脑中紧密连接的开放。
为此，肽拮抗剂可以静脉内药剂配方给药以输送至脑。这种配方在本领域中为人熟知，通常包括一种生理性稀释剂，如蒸馏水、或0.9％(w/v)氯化钠。
所应用的肽拮抗剂的药效学有效剂量在本发明中并不是严格的，并将根据要治疗的疾病或状态、以及要接受治疗的患者的年龄、体重和性别而改变。一般来说，为抑制胃肠道炎症或抑制血脑屏障的破坏，如抑制zonulin的生物学活性，在本发明中使用的肽拮抗剂的剂量在大约7.5×10-6M到7.5×10-3M范围内，优选地大约7.5×10-6M到7.5×10-4M。为在如肠或血液中达到这样的终浓度，在本发明的单一口服药剂中肽拮抗剂的量一般为大约1.0μg到1000μg，最好是1.0μg到100μg。
肽拮抗剂也可采用本领域熟知的技术(Abrams，Methods Enzymol.，121107-119(1986))，用作免疫原以产生可与zonulin特异结合的多克隆或单克隆抗体。这些抗体反过来可被用于在机体组织或液体中、或在zonulin的亲和—纯化中检测zonulin，或选择性的，用以与zonulin结合，因而抑制zonulin活性，如，抑制胃肠道炎症或抑制血脑屏障的破坏。
下面提供的实例仅仅是为了举例说明的目的，并不限制本发明的范围。
实例1ZOT的纯化采用分子量限制为10kDa的薄层流式滤器，将培养以质粒pZ14转化的V.霍乱菌株CVD110(Michalski等，Infect.Immu.，G14462-4468(1993))后获得的5000ml上清部分，浓缩1000倍。含有霍乱弧菌zot基因的pZ14的构建在inter alia，WO96/37196中详细描述。得到的上清然后经过8.0％(w/v)SDS-PAGE。通过对SDS-PAGE胶进行考马思亮兰染色检测蛋白带。当与采用相同方式处理的、转化了质粒pTTQ 181(Amersham，Arlington Heights，IL)的菌株CVD 110中获得的上清相比时，没有检测到与ZOT相对应的蛋白带。因此，尽管在pZ14中zot基因放在高度可诱导性和强的tac启动子之后，1000倍浓缩的pZ14上清中的蛋白的水平仍然在采用考马思亮兰染色SDS-PAGE胶上检测不到。
A.MBP-ZOT为增加ZOT产生的量，zot基因与麦芽糖结合蛋白(此后称为“MBP”)基因在构架中融合以产生一个MBP-ZOT融合蛋白。
MBP载体pMAL-c2(Biolab)通过将ZOT基因融合到大肠杆菌的malE基因而被用于表达和纯化ZOT。这种结构采用强的、诱导型tac启动子，和malE翻译初始信号以得到克隆zot基因的高水平表达。载体pMAL-c2完全去掉了malE信号序列，此序列可导致融合蛋白在胞浆中的表达。MBP的亲和色谱纯化被用来促进融合蛋白的分离(Biolab)。
更为特殊的是，载体pMAL-c2用EcoRI(在malE基因的3’末端切割)线性化，插入kelnow片断，并用XbaI(在pMAL-c2多接头上有单一位点)消化。编码ZOT的orf从质粒pBB241亚克隆(Baudry等，Infect.Immun.，60428-434(1992))。质粒pBB241用BssHII消化，插入Kelnow片断，用XbaI消化。然后平端XbaI片断亚克隆进pMAL-c2以产生质粒pLC10-c。由于插入体和载体均有平端和粘端，正确的方向是通过malE3’末端与插入体的5’末端相融合获得的。然后pLC10-c电导入大肠杆菌DH5α菌株中。在pBB241中，BssHII限制性位点位于zot orf中。因此，ZOT的1-8氨基酸在MBP-ZOT融合蛋白中是缺失的。
为了纯化MBP-ZOT融合蛋白，将含pLC10-c的单一克隆接种于含有0.2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的10ml Luria Bertani肉汤中，并在37℃振荡孵育过夜。培养物以1∶100稀释于1.0ml同样的新鲜培养基中，在37℃下振荡生长，直至大约1.0×108细胞/ml。然后加入0.2mM IPTG以诱导MBP-ZOT表达，培养物在37℃下再孵育3小时。然后将细菌沉淀，并重新悬浮于20ml冰冷的“柱缓冲液”中，该缓冲液含20mM Tris-HCL、0.2M NaCl、1.0mM EDTA、10mM 2-ME、1.0mMNaN3。细菌悬液通过拍(french)压处理和在4℃下以13,000×g离心30min进行溶解。收集上清，用柱缓冲液1∶5稀释，并装入以柱缓冲液预平衡的1×10直链淀粉树脂(Biolabs，MBP-融合纯化系统)柱中。用5倍体积的柱缓冲液冲洗柱后，通过在柱缓冲液中加入10ml的10mM麦芽糖洗脱MBP-ZOT融合蛋白。一般从1.0ml培养物中获得的产量是2-3mg蛋白。
纯化的MBP-ZOT融合蛋白的MBP融合部分然后通过每20μgMBP-ZOT应用1.0μg Xa因子蛋白酶(Biolabs)而切除。Xa因子蛋白酶正好在ZOT的氨基末端前进行切除。这样获得的ZOT蛋白在8.0％(w/v)SDS-PAGE胶上电泳，再用电分离室(Schleicher & Schuell，Keene，NH)将其从胶上电洗脱。
当在Ussing室中检测时，所得到的纯化ZOT剂量依赖性地引起Rt下降，其ED50为7.5×10-8M。
B.6xHis-ZOTzot基因采用pBB241质粒(Baudry等，见前)DNA作为模板，用DeepVent聚合酶(New England Biolabs)通过PCR进行扩增。所用的顺向和反向引物分别为5’-CGGGATCCCGTATGAGTATCTTT-3’(SEQ IDNO39)；和5’-CCCAAGCTTGGGTCAAAATATACT-3’(SEQ IDNO40)。这些寡核苷酸的5’尾端分别含一个BamHI和一个HindIII限制性位点。得到的扩增子(1.2kb)用8.0％(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行分析，并采用一个Xtreme旋转柱(Pierce)从盐和游离核苷酸中纯化。上面提到的两种限制性酶然后用来消化纯化的扩增子，得到的消化的扩增子然后被插入到载体pQE30(Quiagen)中，该载体之前已经用BamHI和HindIII消化，这样获得质粒pSU113。PQE30是一个表达载体，可使有6聚-组氨酸标记(6xHis)的重组蛋白高水平的表达。因此质粒pSU113的表达产物是一个6xHis-ZOT融合蛋白。然后pSU113转化进大肠杆菌DH5α中。
为了纯化6xHis-ZOT融合蛋白，得到的转化大肠杆菌在150ml含有2.0％(w/v)葡萄糖、25μg/ml卡那霉素和200μg/ml氨苄青霉素的Luria Bertani肉汤中37℃生长过夜，直至A600为大约1.10。下一步，75ml过夜的培养物加入到1000ml含有2.0％(w/v)葡萄糖、25μg/ml卡那霉素和200μg/ml氨苄青霉素的Luria Bertani肉汤中，在37℃孵育大约3小时，同时剧烈震荡，直至A600为大约0.7-0.9。然后，加入IPTG至终浓度为2.0mM，并继续在37℃生长5小时。接着，通过4000×g离心20分钟收获细胞，重新悬浮在5.0ml/g湿重的缓冲液A中，缓冲液A含6.0M GuHCl、0.1M磷酸钠和0.01M Tris-HCl(PH8.0)，并在室温搅拌1小时。然后，混合物在4℃以10,000×g离心30分钟，在所得到的上清中加入4.0-5.0ml/g湿重的50％SUPERFLOW树脂浆(QIAGEN)，并在室温进行搅拌1小时。得到的树脂加入到1.6×8.0柱中，然后顺序地以缓冲液A、缓冲液B和缓冲液C冲洗柱子，缓冲液B含8.0M尿素、0.1M磷酸钠和0.01M Tris-HCl(pH8.0)，缓冲液C含8.0M尿素、0.1M磷酸钠和0.01M Tris-HCl(pH6.3)。每次冲洗均至流经液的A600小于0.01时止。用含有250mM咪唑的20ml缓冲液C将6xHis-ZOT融合蛋白从柱中洗脱。然后，含有6xHis-ZOT融合蛋白的馏分采用Davis，Ann.N.Y.Acad.Sci.，121404(1964)所描述的方法用SDS-PAGE进行检查，并用考马思亮兰对胶进行染色。含有6xHis-ZOT融合蛋白的馏分经8.0M尿素透析，集合，再用PBS稀释100倍。随后，加入50％SUPERFLOW树脂浆4.0ml，在室温下进行搅拌2小时，得到的树脂装入1.6×8.0柱中，然后用50ml PBS冲洗柱子。用含有250mM咪唑的10ml PBS从柱中洗脱出6xHis-ZOT融合蛋白。得到的洗脱物经PBS透析，并以上述的方法用SDS-PAGE检查6xHis-ZOT融合蛋白。
实例2亲和性—纯化抗ZOT抗体的生产为获得特异的抗血清，表达和纯化了一个奇特的谷胱甘肽S-转移酶(GST)-ZOT蛋白。
更为特殊的是，以质粒pBB241(Baudry等，见前)作为模板DNA，寡核苷酸引物被用来通过聚合酶链式反应(PCR)扩增zot orf。顺式引物(TCATCACGGC GCGCCAGG，SEQ ID NO25)对应着zot orf的15-32核苷酸，反向引物(GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT，SEQ ID NO26)对应着ctxA orf的5’末端。因此，ZOT的1-5氨基酸在得到的融合蛋白中是缺失的。扩增产物被插入到位于pGEX-2T(Pharmacia，Milwaukee，WI)中GST基因末端的多接头(SmaI位点)内。PGEX-2T是一个融合蛋白表达载体，可将一个克隆基因表达为带有日本血吸虫GST的融合蛋白。融合基因在tac启动子的控制之下。在IPTG的诱导下，发生去阻遏并表达GST融合蛋白。
得到的重组质粒，称为pLC11，被电导入大肠杆菌DH5α中。为了纯化GST-ZOT融合蛋白，在10ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LuriaBertani肉汤中接种一个含有pLC11的单一克隆，37℃振荡孵育，过夜。培养物以1∶100稀释于1.0ml同样的新鲜培养基中，在37℃下振荡生长，直至1.0×108细胞/ml。然后加入0.2mM IPTG以诱导GST-ZOT表达，培养物继续在37℃孵育3小时。然后将细菌沉淀，重新悬浮于20ml冰冷的PBS(pH7.4)中，并用拍压的方法溶解。在这些条件下GST-ZOT融合蛋白是不溶的，于是与细菌沉淀部分一起沉积。因此，沉淀重新悬浮在Laemli溶解缓冲液中，该缓冲液含0.00625M Tris-HCl(pH6.8)、0.2M 2-ME、2.0％(w/v)SDS、0.025％(w/v)溴酚兰和10％(v/v)甘油，并在8.0％(w/v)PAGE-SDS胶上进行电泳，用考马思亮兰染色。采用电分离室(Schleicher & Schuell，Keene，NH)将对应融合蛋白的大约70kDa的带(26kDa的GST+44kDa的ZOT)从胶中电洗脱出来。
所得到的洗脱蛋白10μg(10-20μg)与等量的福氏完全佐剂混合，注入兔体内。4周和8周后与福氏不完全佐剂一起给予两次激发剂量。1月后给兔放血。
为确定特异抗体的产生，10-10M ZOT与两个融合蛋白MBP-ZOT和GST-ZOT一起转移到尼龙膜上，并与1∶5000稀释的兔抗血清一起在4℃孵育过夜，同时中度振荡。然后用含有0.05％(v/v)吐温20的PBS(以后称为“PBS-T”)冲洗滤膜15分钟4次，并与1∶30,000的结合了辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG稀释液室温孵育2小时。用含有0.1％(v/v)吐温的PBS再次冲洗滤膜15分钟4次，采用增强化学发光法(Amersham)检测免疫反应带。
在免疫印迹上，发现兔抗血清识别ZOT，还有MBP-ZOT和GST-ZOT融合蛋白，但不识别MBP阴性对照。
此外，为了证实合适抗ZOT抗体的产生，在Ussing室中进行了中和实验。当与pZ14上清在37℃预孵育60分钟时，ZOT特异抗血清(1∶100稀释)能够完全抵销放置在Ussing室中的兔回肠上ZOT诱导的Rt下降。
其次，采用MBP-ZOT亲和柱亲和纯化了抗ZOT抗体。更特殊的是，MBP-ZOT亲和柱是通过将如上述实例1描述的方法获得的1.0mg纯化MBP-ZOT固定到一个预先活化的胶(Aminolink，Pierce)上，室温过夜而制备的。该柱用PBS冲洗，然后载入2.0ml抗ZOT兔抗血清。室温孵育90分钟后，柱用14ml PBS冲洗，用4.0ml含有50mM甘氨酸(pH2.5)、150mM NaCl和0.1％(v/v)曲拉通X-100的溶液将特异性抗ZOT抗体从柱中洗脱出来。1.0ml洗脱馏分的pH立即用1.0N NaOH进行中和。
实例3Zonulin的纯化基于1997年2月20日提交的美国专利申请08/803,364的观察，ZOT与特异的上皮表面受体相互作用，随后激活一个复杂的细胞内级联反应以调节tj通透性，在本发明中可以假定ZOT可以模仿哺乳动物tj的生理性调节剂的效应。在1997年5月21日提交的美国专利申请08/859,931中推测，ZOT和其生理性类似物(zonulin)在功能上和免疫学上可能是相关的。因此，如这里所描述的，亲和纯化的抗ZOT抗体和Ussing室实验可联合用来探索在不同的兔和人组织中的zonulin。
A.兔组织最初，zonulin是从兔肠纯化的。组织在PBS中匀浆破碎。得到的细胞标本然后以40,000rpm离心30分钟，收集上清并冻干。得到的冻干产物然后在PBS(10∶1(v/v))中重新溶解，通过一个0.45mm的滤膜过滤，装入一个Sephadex G-50色谱柱上，并用PBS洗脱。然后从柱中获得的2.0ml馏分采用如上实例2中所述获得的亲和纯化的抗ZOT抗体进行标准的Western免疫印迹。
阳性馏分，也就是那些与抗ZOT抗体结合的，合在一起，冻干，在(1∶1(v/v))PBS中重新溶解，并通过一个Q-Sepharose柱进行盐梯度色谱层析。盐梯度为50mM Tris缓冲液(pH8.0)中的0-100％(w/v)NaCl。收集5个20ml馏分，采用如上实例2中所述获得的亲和纯化的抗ZOT抗体进行标准的Western免疫印迹。馏分1(20％(w/v)NaCl)是Western免疫印迹试验中唯一的阳性馏分。
从Q-Sepharose柱中获得的馏分然后在CaCo2单层和在Ussing室中的兔小肠上被检测其组织阻力效应。
更特殊的是，CaCo2细胞生长于细胞培养瓶(Falcon)内，在95％O2/5％CO2的湿化气体中、在37℃的DMEM培养基里生长，该培养基中含有10％(v/v)胎牛血清、40μg/l青霉素和90μg/l链霉素。每5天，当细胞达到70-80％汇合时，经胰蛋白酶处理后，细胞以表面比例1∶5进行传代。在本研究中使用的细胞代数为15到30。
CaCo2单层在组织培养处理的聚碳酸酯滤膜上生长至汇合(在以1∶2.5的表面比例接种后12-14天)，该滤膜与一个聚苯乙烯环(6.4mm直径，Transwell Costar)紧密贴附。将膜紧密地恰当插入，使改良Ussing室的浆膜室和粘膜室得以分开，实验按照Fasano等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85242-5246(1991)描述的方法在Ussing室中的兔肠上进行。实验结果在图1中显示。
如图1中显示，含有Zonulin的馏分与Zonulin阴性馏分相比，引起CaCo2单层阻力的显著下降。
下一步，Ussing室实验采用来自2-3kg的成年雄性新西兰大白兔的回肠进行，该兔采用颈部脱臼处死。取出一段20cm的回肠片断，洗净肠内容物，沿肠系膜边缘剖开，剥除肌肉和浆膜层。8个这样制备的粘膜片然后放置在有机玻璃的Ussing室中(1.12cm2开放)，与一个电压钳装置(EVC 4000 WPI，Saratosa，FL)相连，浸于新鲜配制的林格氏溶液中，该液含53mM NaCl、5.0mM KCl、30.5mM甘露醇、1.69mMNa2HPO4、0.3mM NaH2PO4、1.25mM CaCl2、1.1mM MgCl2和25mMNaHCO3。浸液用一个与恒温循环泵相连的水套蓄水池维持温度在37℃，并充以95％O2/5％CO2。
100μl从兔肠中纯化的zonulin加入到粘膜侧。每10分钟测量电压差(PD)，采用Fasano等前面的描述的方法计算短路电流(Isc)和组织阻力(Rt)。因为组织不同，数据以ΔRt(在时间X的Rt)-(在时间0的Rt)计算。结果在图2中显示。
如图2所示，含有zonulin的馏分与zonulin阴性馏分相比，导致兔小肠阻力显著降低。一旦将zonulin从蓄水池中去除，这种效应完全逆转。
Zonulin阳性的馏分也进行了8.0％(w/v)SDS-PAGE电泳，随后采用抗ZOT抗体进行Western免疫印迹。然后，经SDS-PAGE分离的蛋白带用CAPS缓冲液转移到PVDF滤膜(Millipore)上，该缓冲液含100ml(3-[环己胺]-1-丙烷磺酸)10x、100ml甲醇和800ml蒸馏水。通过Western免疫印迹检测到的排列于单一条带的蛋白具有明显的大约为47kDa的分子量。此条带从PVDF滤膜上切下，根据Hunkapiller在蛋白质微量定性方法，Shibley编辑，11-12章，Humana Press，第315-334页(1985)中所述的方法，采用Perkin-Elmer应用生物系统仪，型号494(Perkin-Elmer Applied Biosystems Apparatus Model 494)，进行N-末端序列分析。从兔肠中纯化的zonulin N-末端序列在SEQ ID NO27中显示。
兔zonulin N-末端序列通过BLAST搜索分析与其他蛋白序列相比较。这种分析的结果显示兔zonulin的N-末端序列与人类tau蛋白的N-末端序列85％等同，100％相似。
其结果，为了确定是否兔zonulin和tau是同样物质，在Ussing室中进行了交叉中和实验。更特殊的是，10μl/ml兔zonulin加入到未处理或与抗tau抗体(1∶10稀释)(Sigma)在37℃预孵育60分钟的兔回肠的粘膜面。与抗ZOT抗体(1∶10稀释)(实例2)预孵育的10μl/ml兔zonulin；和0.4μg/ml纯化的tau(Sigma)均被用作对照。结果在图3显示。
如图3中显示，兔zonulin引起典型的组织阻力下降，而在将蛋白从Ussing室中去除时轻易地逆转。这种活性被与抗ZOT抗体预处理完全中和，但不被与抗tau抗体预处理而中和。另一方面，组织暴露于tau蛋白的组织阻力无明显效应出现。
兔zonulin也在兔的其他不同组织中检测到，即，兔心脏、脑、肌肉、胃、脾、肺、肾，和兔肠的不同部分，即，远端空肠、近端空肠、回肠、盲肠和结肠。也就是说，当这些兔组织以与上述兔肠同样的方式进行处理，并在进行8.0％(w/v)SDS-PAGE电泳后，采用如上面实例2所述获得的亲和纯化的抗ZOT抗体进行Western免疫印迹时，在所有被试验的组织中检测到大小在近似47kDa的一个单一条带。
B.人组织zonulin也从几种人的组织中纯化，包括肠、心脏和脑。胎儿和成人组织均被使用。组织通过在PBS中匀浆破坏。然后得到的细胞标本在40,000rpm下离心30分钟，收集上清并冻干。得到的冻干产物然后在PBS(10∶1(v/v))中重新溶解，通过一个0.45mm的滤膜进行过滤，装入一个Sephadex G-50色谱柱上，并用PBS洗脱。然后从柱中获得的2.0ml馏分采用如上实例2中所述获得的亲和纯化的抗ZOT抗体进行标准的Western免疫印迹。
阳性馏分，也就是那些与抗ZOT抗体结合的，合在一起，冻干，在(1∶1(v/v))PBS中重新溶解，并通过一个Q-Sepharose柱进行盐梯度色谱层析。盐梯度为50mM Tris缓冲液(pH7.4)中的0-100％(w/v)NaCl。收集5个20ml馏分，采用如上实例2中所述获得的亲和纯化的抗ZOT抗体进行标准的Western免疫印迹。馏分1(20％(w/v)NaCl)在Western免疫印迹实验中显示为47kDa大小的单一条带。馏分2(40％(w/v)NaCl)在Western免疫印迹实验中显示有两个35kDa和15kDa大小的附加条带。馏分3(60％(w/v)NaCl)和馏分4(80％(w/v)NaCl)仅显示为35kDa和15kDa条带。这些结果表明zonulin可被可能存在于所用的人组织中的蛋白酶降解，降解的产物同完整蛋白相比，以较高的盐浓度从柱中洗脱。
然后，从Q-Sepharose柱中获得的馏分1(来自人心脏、肠和脑组织)和馏分4(来自心脏组织)，在Ussing室中的兔肠和恒河猴肠上检测了它们的组织阻力效应。
Ussing室实验采用不同的肠道进行，包括来自2-3kg成年雄性新西兰大白兔或5-6kg成年雄性恒河猴的空肠、回肠或结肠。在动物处死后，取出肠的不同部分，包括空肠、回肠和结肠，洗净肠内容物，沿肠系膜边缘剖开，剥除肌肉和浆膜层。8个这样制备的粘膜片(3个空肠、3个回肠和2个结肠)然后放置在有机玻璃的Ussing室中(1.12cm2开放)，与一个电压钳装置(EVC 4000 WPI，Saratosa，FL)相连，浸于新鲜配制的林格氏溶液中，该液含53mM NaCl、5.0mM KCl、30.5mM甘露醇、1.69mM Na2HPO4、0.3mM NaH2PO4、1.25mM CaCl2、1.1mM MgCl2和25mM NaHCO3。浸液用一个与恒温循环泵相连的水套蓄水池维持温度在37℃，并充以95％O2/5％CO2。
100μl从人心脏纯化的zonulin馏分1、或从人脑中纯化的zonulin馏分1、或从人肠中纯化的zonulin馏分1、或从人心脏纯化的馏分4，加入到粘膜侧。每10分钟测量电压差(PD)，采用Fasano等前面的描述的方法计算短路电流(Isc)和组织阻力(Rt)。以Rt计算的数据见图4A和图4B，但因为组织不同，数据如图5A和图5B所示以ΔRt(在时间X的Rt)-(在时间0的Rt)计算。结果在图4A和4B(猴肠)及图5A和图5B(兔肠)中显示。
如图4A和图4B显示，从人心脏和肠纯化的zonulin(馏分1)与PBS阴性对照相比，引起猴肠阻力(空肠(图4A)和回肠(图4B))的显著降低。当从人心脏或人肠中纯化的zonulin在结肠中检测时未观察到显著的变化。图4A和图4B也显示了当检测从人脑中纯化的zonulin(馏分1)时，未观察到对猴空肠(图4A)和猴回肠(图4B)的显著效应。从人心脏纯化的zonulin的馏分4也导致猴小肠组织阻力的显著下降。
如图5A和图5B中显示，当使用兔肠时，获得了相似的结果。即，从人心脏纯化的zonulin(馏分1)显示了对兔空肠(图5A)和兔回肠(图5B)组织阻力的显著作用，而对结肠则没有。图5A和图5B也显示了当对人脑中纯化的zonulin(馏分1)进行检测时，对兔空肠(图5A)和兔回肠(图5B)未观察到明显的效应。
为确定zonulin是否可增加胰岛素的口服输送，采用兔肠进行了的体外模型实验。简言之，成年雄性新西兰大白兔(2-3kg)颈部脱臼处死。取出兔小肠(空肠或回肠)的片断，清洗肠内容物，沿肠系膜边缘剖开，剥除肌肉和浆膜层。8个这样制备的粘膜片然后放置在有机玻璃的Ussing室中(1.12cm2开放)，与一个电压钳装置(EVC 4000 WPI，Saratosa，FL)相连，浸于新鲜配制的林格氏溶液中，该液含53mM NaCl、5.0mM KCl、30.5mM甘露醇、1.69mM Na2HPO4、0.3mM NaH2PO4、1.25mM CaCl2、1.1mM MgCl2和25mM NaHCO3。浸液用一个与恒温循环泵相连的水套蓄水池维持温度在37℃，并充以95％O2/5％CO2。测量电压差(PD)，计算短路电流(Isc)和组织阻力(Rt)。一旦组织达到稳定状态的条件，按其阻力基数将组织配对，单独或在100μl来自馏分1的心脏zonulin存在下，腔内暴露于10-11M125I-胰岛素(Amersham，Arlington Heights，IL；2.0μCi＝10-12M)。立即从浆膜侧获取1.0ml试样和从粘膜侧获取50μl试样，以确定基线值。然后在随后的100分钟内，以20分钟的间隔收集浆膜侧的样品。
发现心脏zonulin以时间依赖的方式增加胰岛素在空肠(未处理的对zonulin处理的组织分别是0.058±0.003fmol/cm2·min对0.12±0.005fmol/cm2·min，p＝0.001)、和在回肠(未处理的对zonulin处理的组织分别是0.006±0.0002fmol/cm2·min对0.018±0.005fmol/cm2·min，p＝0.05)的肠吸收。
从人心脏纯化zonulin馏分1、从人肠中纯化的zonulin馏分1和从人脑中纯化的zonulin馏分1，也在进行8.0％(w/v)SDS-PAGE电泳后，采用上述实例2所述获得的抗ZOT抗体进行Western免疫印迹。然后，经SDS-PAGE分离的蛋白带用CAPS缓冲液转移到PVDF滤膜(Millipore)上，该缓冲液含100ml(3-[环己胺]-1-丙烷磺酸)10x、100ml甲醇和800ml蒸馏水。通过Western免疫印迹检测到的排列于单一条带的蛋白具有明显的大约为47kDa的分子量。此条带从PVDF滤膜上切下，根据Hunkapiller在蛋白质微量定性方法，Shibley编辑，11-12章，Humana Press，第315-334页(1985)中所述的方法，采用Perkin-Elmer应用生物系统仪，型号494，进行N-末端序列分析。从成人心脏中纯化的zonulin N-末端序列在SEQ ID NO28中显示，从成人脑中纯化的zonulin N-末端序列在SEQ ID NO29中显示，从胎儿脑中纯化的zonulinN-末端序列在SEQ ID NO36中显示。
从成人肠(SEQ ID NO31)中纯化的zonulin的N-末端前9个氨基酸也被测序，发现与SEQ ID NO28显示的、从人心脏中纯化的zonulin的N-末端前9个氨基酸是等同的(见图6)。从胎儿肠中纯化的zonulin的N-末端序列的前20个氨基酸也被测序Met Leu Gln Lys Ala Glu SerGly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Xaa Ser Asn Arg Leu(SEQ ID NO30)，并发现与SEQ ID NO28显示的人心脏中纯化的zonulin的氨基酸序列几乎是等同的(见图6)。
从成人脑和胎儿脑中纯化的zonulin的N-末端序列(SEQ ID NO29和SEQ ID NO36)与从每个心脏、胎儿肠和成人肠中纯化的zonulin的N-末端序列(SEQ ID NO28、SEQ ID NO30和SEQ ID NO31)完全不同(见图6-7)。这种不同相信可以解释zonulin在决定组织通透性中的组织特异性，如上面所举例的肠。
从心脏、肠和脑中纯化的人zonulin的N-末端序列都与从兔肠中纯化的zonulin的N-末端序列不同(图6)。为确定是否这些蛋白代表着tau相关的蛋白家族的不同亚型，从兔和人来源的组织在进行8.0％(w/v)SDS-PAGE电泳后，采用抗ZOT抗体或抗tau抗体进行Western免疫印迹。从兔和人组织(包括脑、肠、和心脏)纯化的、被发现可被抗ZOT抗体识别的47kDa zonulin带，也发现与抗tau抗体有交叉反应。通过盐层析获得的从人脑纯化的zonulin的不同馏分也采用抗ZOT抗体或抗tau抗体进行了Western免疫印迹。抗ZOT抗体可以识别完整的47kDa蛋白及35kDa和15kDa分解片断，抗tau抗体则仅能识别完整的47kDa蛋白和35kDa片断，而抗tau抗体不能识别15kDa片断。为确定是否35kDa片断包括zonulin的N-末端或C-末端，获取了35kDa带的N-末端，发现是Xaa Xaa Asp Gly Thr Gly Lys Val Gly AspLeu(SEQ ID NO32)。这个序列与完整的人脑zonulin(SEQ ID NO29)的N-末端序列不同。这些结果表明15kDa片断代表着zonulin的N-末端部分，而35kDa片断代表着zonulin的C-末端部分。
综合起来，这些结果表明被抗tau抗体识别的zonulin区朝向zonulin的C-末端，对于从人或兔组织来源的zonulin不同亚型是共同的(而N-末端部分可能不同)，可能参与蛋白的通透效应(基于以下的观察，tau与β-微管蛋白结合，随后发生细胞骨架的重排；和馏分4对猴小肠组织阻力的效应)。
从心脏和肠中纯化的人zonulin的N-末端序列通过BlAST搜索分析与其他蛋白序列进行了比较。分析结果显示，人zonulin的N-末端序列与人类IgM重链可变区(SEQ ID NO37)的N-末端序列95％等同。
其结果，为了确定是否从心脏中纯化的人zonulin和人IgM是同一物质，对人zonulin进行部分消化以获得一个内部片断，然后将其测序。
更特殊的是，含有从人心脏中纯化的zonulin的1.0mm PVDF滤膜放置于预先用0.1％(w/v)三氟乙酸(TFA)冲洗过的塑料管中，并用甲醇冲洗。加入含100mM Tris(pH8.2)、10％(v/v)CH3CN和1.0％(v/v)脱氢曲拉通X-100的缓冲溶液75μl，与膜在37℃孵育60分钟。然后加入150ng胰蛋白酶，再在37℃孵育24小时。得到的溶液超声处理10分钟，轻轻移除上清。然后加入0.1％(w/v)TFA 75μl，溶液再超声处理10分钟，并倾去上清。两份试样均装载在5.0μm微粒大小、300孔径的0.5mm×250mm C18柱上。在2小时15分钟时间内形成从0.1％(w/v)TFA到45％CH3CN水+0.1％(w/v)TFA的梯度。最后收集各峰并测序。
从成人心脏纯化的人zonulin的内部序列发现是Leu Ser Glu ValThr Ala Val Pro Ser Leu Asn Gly Gly(SEQ ID NO33)。
人zonulin的内部序列通过BLAST搜索分析与其他蛋白序列进行了比较。此分析的结果显示人zonulin的内部序列与人类IgM重链可变区的任何内部序列的等同性为0％。
上面实例3的结果表明(1)zonulin代表了细胞旁通路的生理性调节剂；(2)兔zonulin的N-末端序列与tau蛋白的N-末端序列高度同源；(3)zonulin和tau是两个在免疫学上相关但功能上不同的截然不同物质；(4)从人心脏和肠中获得的人zonulin的N-末端序列与IgM重链可变区的N-末端序列高度同源；(5)人zonulin和IgM是两个在结构上相关但功能上不同的截然不同的物质；和(6)zonulin代表着一个具有共同的、活性C-末端序列和可变的N-末端序列的tau相关蛋白家族。
实例4zonulin的肽拮抗剂已知ZOT、人肠zonulin(zonulini)和人心脏zonulin(zonulinh)均作用于肠(Fasano等，Gastroenterology，112839(1997)；Fasano等，J.Clin.Invest.，96710(1995)；和图1-5)和内皮细胞tj，且三者均具有相似的、与ZOT受体在肠内分布一致(Fasano等(1997)，见前；和Fasano等(1995)，见前)的区域效应(Fasano等(1997)，见前；和图1-5)，在本发明中推测，这三个分子与同样的受体结合位点相互作用。因此，对ZOT和人zonulin的基本氨基酸结构进行了比较，以了解参与肠tj调节的受体-配体相互作用所需要的绝对结构。对这些分子N-末端序列的分析发现了下列共同的序列(框在图7中的氨基酸残基8-15)非极性(肠为Gly，脑为Val)、可变的、非极性、可变的、非极性、极性、可变的、极性(Gly)。Gly在位置8、Val在位置12和Gln在位置13，所有均在ZOT、zonulini和zonulinh中高度保守(见图7)，相信对于在肠内的受体结合功能是关键性的。为了证实这些，化学合成了合成的八肽Gly GlyVal Leu Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO15)(称为FZI/0，并对应于人胎儿zonulini的氨基酸残基8-15)。
下一步，兔回肠如上所述置于Ussing室中，单独暴露于100μgFZI/0(SEQ ID NO15)、100μg FZI/1(SEQ ID NO34)、1.0μg6xHis-ZOT(如实例1所述获得)、1.0μg zonulini(如实例3所述获得)、或1.0μg zonulinh(如实例3所述获得)；或预先暴露于100μg FZI/0或FZI/120分钟，此时加入1.0μg 6xHis-ZOT、1.0μg zonulini、或1.0μg zonulinh。然后如上所述计算ΔRt。结果见图8。
如图8中显示，FZI/0不能诱导Rt的任何显著性改变(与阴性对照相比0.5％)(见实心条)。相反，用FZI/0预先处理20分钟分别减少了ZOT、zonulini、zonulinh对Rt效应的75％、97％和100％(见空心条)。在图8中也显示，当采用第二个合成肽(FZI/1)时，这种抑制效应可被完全去除(见阴影条)，FZI/1是通过改变在位置8的Gly、位置12的Val和在位置13的Gln(指zonulini)并对应于zonulinb的氨基酸残基(分别是Val，Gly，和Arg)而化学合成的。
上述的结果证实在ZOT和zonulin家族的N-末端的残基8和15之间有一个区域跨度，对与靶受体的结合是十分重要的，且在位置8、12和13的氨基酸残基决定着这种结合的组织特异性。
尽管已详细描述了本发明，并引用了它们特定实施例作为参考，但很明显对于本领域的一个普通的技术人员来说，在不背离其精神和范围的情况下，各种改变和调整均是可行的。
序列表(1)一般信息(i)申请者FASANO，Alessio(ii)发明名称zonulin的肽拮抗剂及其使用方法(iii)序列数目40(iv)通讯地址(A)收信人SUGHRUE，MION，ZINN，MACPEAK & SEAS，PLLC(B)街道2100 Pennsylvania Avenue，N.W.，Suite 800(C)城市华盛顿州(D)州D.C.
(E)国家美国(F)邮编20037(V)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，版本#1.25(vi)目前申请的数据(A)申请号(B)申请日1998年8月3日(C)分类
(viii)律师/代理人信息(A)名称KIT，Gordon(B)登记号30,764(C)参考/摘要号A-7242(ix)电信信息(A)电话(202)293-7060(B)传真(202)293-7869(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO1Gly Arg Val Cys Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO2Gly Arg Val Cys Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽
(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO3Gly Arg Val Leu Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO2Gly Arg Val Leu Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO5Gly Arg Leu Cys Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO6
Gly Arg Leu Cys Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO7Gly Arg Leu Leu Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO8Gly Arg Leu Leu Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO9
Gly Arg Gly Cys Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO10Gly Arg Gly Cys Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO11Gly Arg Gly Leu Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO12
Gly Arg Gly Leu Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO13Gly Gly Val Cys Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO14Gly Gly Val Cys Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO15
Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO16Gly Gly Val Leu Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO17Gly Gly Leu Cys Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO18
Gly Gly Leu Cys Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO19Gly Gly Leu Leu Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO20Gly Gly Leu Leu Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO21
Gly Gly Gly Cys Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO22Gly Gly Gly Cys Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO23Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO24
Gly Gly Gly Leu Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核苷酸(C)成股性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型合成的DNA(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO25TCATCACGGC GCGCCAGG(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核苷酸(C)成股性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型合成的DNA(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO26GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽
(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO27Asn Gln Arg Pro Pro Pro Ala Gly Val Thr Ala Tyr Asp Tyr Leu Val Ile Gln1 5 10 15(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO28Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu1 5 10 15 20(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO29Val Thr Phe Tyr Thr Asp Ala Val Ser1 5(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无
(xi)序列描述SEQ ID NO30Met Leu Gln Lys Ala Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Xaa Ser Asn Arg Leu1 510 15 20(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO31Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu1 5 10(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO32Xaa Xaa Asp Gly Thr Gly Lys Val Gly Asp Leu1 510(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO33
Leu Ser Glu Val Thr Ala Val Pro Ser Leu Asn Gly Gly1 5 10(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO34Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO35Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly1 5(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)长度22个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO36
Xaa Gly Lys Val Lys Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Ile Gly Arg Leu Val Ile1 510 15 20(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO37Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu1 510 15 20(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO38Phe Cys Ile Gly Arg Leu Cys Val Gln Asp Gly Phe Val Thr15 10(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核苷酸(C)成般性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型合成的DNA(iii)假设无(iv)反义无
(xi)序列描述SEQ ID NO39CGGGATCCCG TATGAGTATC TTT(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核苷酸(C)成股性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型合成的DNA(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO40CCCAAGCTTG GGTCAAAATA TACT
序列表<110>巴尔的摩马里兰大学(University of Maryland，Baltimore)<120>小带素的肽拮抗剂及其用途<130>CGUSZ50186<140>PCT/US99/16683<141>1999-07-28<150>US09/127,815<151>1998-08-03<160>40<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>1Gly Arg Val Cys Val Gln Pro Gly1 5<210>2<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>2Gly Arg Val Cys Val Gln Asp Gly1 5<210>3<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>3Gly Arg Val Leu Val Gln Pro Gly1 5<210>4<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>4Gly Arg Val Leu Val Gln Asp Gly
1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>5Gly Arg Leu Cys Val Gln Pro Gly1 5<210>6<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>6Gly Arg Leu Cys Val Gln Asp Gly1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>7Gly Arg Leu Leu Val Gln Pro Gly1 5<210>8<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>8Gly Arg Leu Leu Val Gln Asp Gly1 5<210>9<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>9Gly Arg Gly Cys Val Gln Pro Gly1 5<210>10<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂
<400>10Gly Arg Gly Cys Val Gln Asp Gly1 5<210>11<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>11Gly Arg Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5<210>12<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>12Gly Arg Gly Leu Val Gln Asp Gly1 5<210>13<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>13Gly Gly Val Cys Val Gln Pro Gly1 5<210>14<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>14Gly Gly Val Cys Val Gln Asp Gly1 5<210>15<211>8<212>PRT<213>合成的八肽<400>15Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly1 5<210>16<211>8<212>PRT
<213>小带素肽拮抗剂<400>16Gly Gly Val Leu Val Gln Asp Gly1 5<210>17<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>17Gly Gly Leu Cys Val Gln Pro Gly1 5<210>18<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>18Gly Gly Leu Cys Val Gln Asp Gly1 5<210>19<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>19Gly Gly Leu Leu Val Gln Pro Gly1 5<210>20<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>20Gly Gly Leu Leu Val Gln Asp Gly1 5<210>21<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>21Gly Gly Gly Cys Val Gln Pro Gly1 5<210>22
<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>22Gly Gly Gly Cys Val Gln Asp Gly1 5<210>23<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>23Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5<210>24<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>24Gly Gly Gly Leu Val Gln Asp Gly1 5<210>25<211>18<212>DNA<213>合成的构建物<400>25tcatcacggc gcgccagg 18<210>26<211>22<212>DNA<213>合成的构建物<400>26ggaggtctag aatctgcccg at 22<210>27<211>18<212>PRT<213>兔肠<400>27Asn Gln Arg Pro Pro Pro Ala Gly Val Thr Ala Tyr Asp Tyr Leu Val1 5 10 15Ile Gln
<210>28<211>20<212>PRT<213>人心脏<400>28Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu20<210>29<211>9<212>PRT<213>人脑<400>29Val Thr Phe Tyr Thr Asp Ala Val Ser1 5<210>30<211>20<212>PRT<213>人胎儿肠<220>
<221>不能确定(UNSURE)<222>(16)<223>在位置16处的Xaa为氨基酸<400>30Met Leu Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Xaa1 5 10 15Ser Asn Arg Leu20<210>31<211>11<212>PRT<213>人肠<220>
<221>不能确定(UNSURE)<222>(10)<223>在位置10处的Xaa为氨基酸<400>31Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu
1 5 10<210>32<211>11<212>PRT<213>人脑<220>
<221>不能确定(UNSURE)<222>(1)..(2)<223>在位置1和2处的Xaa为氨基酸<400>32Xaa Xaa Asp Gly Thr Gly Leu Val Gly Asp Leu1 5 10<210>33<211>13<212>PRT<213>成人心脏<400>33Leu Ser Glu Val Thr Ala Val Pro Ser Leu Asn Gly Gly1 5 10<210>34<211>8<212>PRT<213>合成的八肽<400>34Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly1 5<210>35<211>8<212>PRT<213>小带素肽拮抗剂<400>35Val Asp Gly Phe Gly Arg Ile Gly1 5<210>36<211>22<212>PRT<213>人胎儿脑<220>
<221>不能确定(UNSURE)
<222>(1)<223>在位置1处的Xaa为氨基酸<400>36Xaa Gly Lys Val Lys Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg1 5 10 15Ile Gly Arg Leu Val Ile20<210>37<211>20<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>37Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu20<210>38<211>14<212>PRT<213>闭锁小带毒素(Zonulin Occludes Toxin)<400>38Phe Cys Ile Gly Arg Leu Cys Val Gln Asp Gly Phe Val Thr1 5 10<210>39<211>23<212>DNA<213>合成的构建物<400>39cgggatcccg tatgagtatc ttt23<210>40<211>24<212>DNA<213>合成的构建物<400>40cccaagcttg ggtcaaaata tact 2权利要求
1.小带素的肽拮抗剂，包括SEQ ID NO35所示的氨基酸序列，其中所述的肽拮抗剂与闭锁小带毒素受体结合，但并不在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放。
2.如权利要求1所述的小带素的肽拮抗剂，由SEQ ID NO35所示的氨基酸序列组成。
3.小带素的肽拮抗剂在制备用于结合所述患者体内脑中的闭锁小带毒素受体的药物中的用途，其中所述的肽拮抗剂包括氨基酸序列SEQ ID NO35，其中所述肽拮抗剂与所述患者脑中的闭锁小带毒素受体结合，但并不在生理上调节该脑中紧密连接的开放。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述的肽拮抗剂由SEQ ID NO35所示的氨基酸序列组成。
5.小带素的肽拮抗剂，包括SEQ ID NO15所示的氨基酸序列，其中所述的肽拮抗剂与闭锁小带毒素受体结合，但并不在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放。
6.如权利要求5所述的小带素的肽拮抗剂，由SEQ ID NO15所示的氨基酸序列组成。
7.肽拮抗剂在制备用于拮抗小带素的药剂中的用途，其中所述的肽拮抗剂包括SEQ ID NO15所示的氨基酸序列，其中所述的肽拮抗剂与所述患者肠中的闭锁小带毒素受体结合，但并不在生理上调节该肠道中紧密连接的开放。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述的肽拮抗剂由SEQ ID NO15所示的氨基酸序列组成。
9.小带素的肽拮抗剂，包括SEQ ID NO6所示的氨基酸序列，其中所述的肽拮抗剂与闭锁小带毒素受体结合，但并不在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述的肽拮抗剂由SEQ IDNO6所示的氨基酸序列组成。
11.肽拮抗剂在制备用于拮抗小带素的药剂中的用途，其中所述的肽拮抗剂包括SEQ ID NO6所示的氨基酸序列，其中所述的肽拮抗剂与所述患者肠中的闭锁小带毒素受体结合，但并不在生理上调节该肠道中紧密连接的开放。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述的肽拮抗剂由SEQ IDNO6所示的氨基酸序列组成。
全文摘要
本发明公开了zonulin的肽拮抗剂及其使用方法。肽拮抗剂与闭锁小带受体结合，但在生理上不调节哺乳动物紧密连接的开放。
文档编号C07K7/08GK1679915SQ20051000771
公开日2005年10月12日 申请日期1999年7月28日 优先权日1998年8月3日
发明者A·法萨诺 申请人:巴尔的摩马里兰大学