趋化因子受体5拮抗剂及药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及趋化因子受体5 (CCR5)的拮抗剂以及包含该拮抗剂的药物组合物，具 体涉及利用噬菌体展示技术筛选得到的小分子活性肽作为所述拮抗剂。
【背景技术】
[0002] 趋化因子受体5 (CCR5)是β趋化因子的受体，具有调控T细胞和单核细胞/巨噬 细胞系迀移、增殖和免疫的功能。CCR5与其配体介导CCR5+免疫细胞的趋化募集过程，与 多种炎症性疾病的发生密切相关，如多发性硬化症、风湿性关节炎、动脉粥样硬化、移植排 斥和自身免疫疾病等。此外，CCR5也是人类免疫缺陷病毒I型（HIV-I)入侵人体时重要的 辅助受体，参与病毒与细胞膜的融合过程：gpl20主要与其N末端和ECL2相互作用。此外， CCR5的生物学功能还参与肿瘤的发生和发展过程。
[0003] CCR5的拮抗剂可抑制CCR5与其配体趋化因子的结合，抑制炎症细胞的趋化，从而 减轻炎症反应及变态反应。同时，拮抗CCR5功能后，对HIV感染细胞及病毒复制也可能有 抑制作用。CCR5拮抗剂是目前生物制药领域的热点，上市的产品仅有马拉维诺。
[0004] 现有技术中有以整个CCR5为靶点，将CCR5的CDNA导入中国仓鼠卵巢细胞（CHO) 中，使CCR5表达于细胞表面，并用流式细胞分选技术将成功表达的CCR5/CH0细胞分选出来 进行培养，将此种细胞种植在96孔板上，作为噬菌体筛选的靶抗原，用噬菌体12肽库进行 4轮淘选，得到与细胞特异性结合的十二肽，该肽即为目的CCR5拮抗剂。
[0005] 但是，上述实验方案的主要缺点是将整个细胞作为靶抗原，细胞表面的众多膜蛋 白及表面分子会干扰噬菌体淘选，即使后续验证到该十二肽可拮抗CCR5与其单克隆抗体 或其天然配体的结合，也无法定位其具体作用靶点。另外该实验主要在细胞水平进行研宄， 缺乏动物实验的进一步验证。
[0006] 有鉴于此，有必要提供另外的趋化因子受体5拮抗剂，以供更细致的机制研宄、动 物实验验证和后期的临床应用。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种趋化因子受体5拮抗剂，其包含：(a)第一多肽，其氨基酸序列为 GHWKVWL ;和/或（b)第二多肽，其氨基酸序列为HYIDFRW。在本发明中，氨基酸以单字母符 号表示，其中第一多肽为甘氨酸-组氨酸-色氨酸-赖氨酸-缬氨酸-色氨酸-亮氨酸，第 二多肽为组氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-色氨酸。
[0008] 另一方面，本发明还提供了氨基酸序列为GHWKVWL和/或HYIDFRW的多肽在制备 趋化因子受体5拮抗药物方面的用途。
[0009] 再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含：(a)第一多肽，其氨基酸序列 为GHWKVWL ;和/或（b)第二多肽，其氨基酸序列为HYIDFRW，并且包含药学上可接受的载 体。该药物组合物可通过已知技术适当制备，从而用于治疗多种炎症性疾病，例如多发性硬 化症、风湿性关节炎、动脉粥样硬化、移植排斥和自身免疫疾病等。药学上可接受的载体通 常是对于活性多肽是惰性的，其可根据活性多肽的性质、药物施用的途径和方法来确定，这 是本领域技术人员可根据常规方法实现的。
[0010] 本发明提供的第一多肽或第二多肽可通过化学合成法得到，或者通过基因工程方 法从细胞中表达得到。又一方面，本发明提供了一种编码多肽的核苷酸序列，该多肽的氨基 酸序列为：（a)GHWKVWL，或（b)HYIDFRW。该核苷酸序列包括因密码子简并性而衍生的序列。 [0011] 进一步地，本发明提供了一种克隆载体，其包含上述任何一种或两种核苷酸序列。 本发明还提供一种表达载体，其包含上述克隆载体。合适的表达载体宿主细胞可根据本领 域技术人员的常规知识确定。
[0012] 上述的两种多肽可以单独使用，也可以组合使用。发明人预期，当组合使用时，其 具有更高的特异性和药效。本发明利用噬菌体展示技术筛选得到两个小分子活性肽，两个 多肽具有拮抗大鼠趋化因子受体5 (CCR5)的功能，具有潜在的药用价值。本方面的靶分子 直接定位到CCR5的分子结构上，研宄出的两个七肽分别针对CCR5的第一胞外环（ECLl)和 第二胞外环（ECL2)，拮抗机制明确，体外验证成功，为后期动物模型的治疗效果观察提供了 实验基础。
【附图说明】
[0013] 图1为ECLl特异性结合噬菌体克隆的ELISA结果；
[0014] 图2为ECL2特异性结合噬菌体克隆的ELISA结果；
[0015] 图3为噬菌体浓度与结合能力的关系。
【具体实施方式】
[0016] 噬菌体展示技术是肽类药物研发的常用技术之一，其条件已十分成熟并有商业试 剂盒出售，而研发的关键在于靶分子的选择及后续效果的验证。
[0017] 研宄发现，CCR5的生理功能主要通过其胞外部分的N端和第二胞外环来实现，本 发明在蛋白质数据库中查得大鼠 CCR5第一、二胞外环的氨基酸序列，由多肽生物公司进行 人工合成，在将其分别包被在六孔板中，进行噬菌体7肽库的淘选，以得到分别与CCR5第 一、二胞外环特异性结合的七肽。此方案能直接定位到CCR5的分子结构，避免了其他因素 的干扰，并且将两个七肽进行体外ELISA验证后，在大鼠上构建疾病模型，可进一步进行体 内验证。
[0018] 技术方案：
[0019] 1.在OWL蛋白质数据库中查得大鼠 CCR5第一、二胞外环（ECL1、ECL2)的氨基酸 序列，分别具有13、32个氨基酸，由吉尔生化（上海）有限公司合成线性多肽。
[0020] 2.包被：将ECLl、ECL2冻干粉溶于NaHCO3溶液（ECLl用1 % DMSO助溶），包被六 孔板，在增湿容器中4°C轻微震荡，孵育过夜。
[0021] 3.亲和淘选：自New England BioLabs公司购买菌体表面展示肽库试剂盒 Ph. D. -7?(随机7肽库）。包被靶分子后，分别经过封阻、洗板，加入2 X IO11Pfu的噬菌体 (即10 μ 1原始文库），温和作用60min，再彻底洗板，加入非特异性缓冲液作用，吸取洗脱 液，即获得与靶分子特异性结合的噬菌体。如此共进行3-4轮淘选，可使特异性噬菌体得到 富集，见表1。
[0022] 4.测序：取最后1轮洗脱物测定滴度，在约100个蓝色噬菌斑的平板上，随机挑取 15个克隆，分别进行扩增得到噬菌体储液，送由金唯智生物科技（北京）有限公司完成基因 测序。结果见表2-表3。
[0023] 5. ELISA法验证噬菌体与靶分子的特异性结合：将送测序的噬菌体储液再次扩 增、纯化，以备ELISA使用。用96孔酶标板包被靶分子，经过封阻、洗板，加入噬菌体储液作 用；洗板，加入辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗噬菌体抗体（anti-M13)作用；再洗板，加入 显色底物ABTS-H 2O2作用，酶标仪读取405nm处的吸光值。反应孔吸光值高于阴性对照3倍 者为阳性克隆，证明其与靶分子有特异性结合。结果见图1和图2。
[0024] 6.将ECLl、ECL2特异性结合的噬菌体克隆进行扩增及滴度测定，进行定量ELISA 检测。结果表明，在噬菌体浓度较低时，其与靶分子的结合能力随浓度的增加呈线性上升趋 势；当浓度达到3. 125X1011pfu/ml及以上时，其与靶分子的结合达到饱和，见图3。证明 特异性拮抗短肽与靶分子的结合具有浓度依赖性和可饱和性。
[0025] 该实验通过亲和淘选得到与ECLl、ECL2特异性结合的噬菌体，并通过多轮淘选使 目的噬菌体得到富集，并在体外用ELISA法验证了其特异性结合。通过基因测序推断出目 的噬菌体展示的七肽的氨基酸序列，可供公司合成以制成短肽类药物，此种活性短肽通过 与CCR5胞外环的结合，阻断其与天然配体的作用，从而拮抗了 CCR5的生理功能。
[0026] 具体参数条件：
[0027] 噬菌体宿主菌E. coli ER2738,噬菌体特殊培养基LB/IPTG/X-gal，-96g III测序引 物5'-OHCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'，噬菌体滴度测定用顶层琼脂：LB培养基+7g/L琼 脂粉+lg/L MgCl2.6H20。靶分子包被液(λ IM pH8.6 NaHCO3，封阻液 IM pH 8.6NaHC03+5mg/ ml BSA，洗涤液 TBST (TBS+0.1 % [v/v] Tween-20、TBS+0. 5 % [v/v] Tween-20)，非特异性缓 冲液 0· 2M pH 2· 2 Glycine-HCl+lmg/ml BSA。噬菌体纯化：聚乙二醇（PEG)/NaCl 法。HRP/ anti_M13抗体：封阻液1:5000稀释。
[0028] 淘选、测序结果：
[0029] 富集所得特异性噬菌体展示的七肽氨基酸序列分别为：GHWKVWL ;HYIDFRW。ELISA 法验证其为阳性噬菌体，能与ECLl、ECL2特异性结合。
[0030] 表1.不同轮次ECLl、ECL2噬菌体淘选的回收率
【主权项】
1. 趋化因子受体5拮抗剂，其包含：(a)第一多肽，其氨基酸序列为GHWKVWL ;和/或 (b)第二多肽，其氨基酸序列为HYIDFRW。
2. 根据权利要求1所述的趋化因子受体5拮抗剂，其包含：(a)第一多肽，其氨基酸序 列为GHWKVWL;和（b)第二多肽，其氨基酸序列为HYIDFRW。
3. 氨基酸序列为GHWKVWL和/或HYIDFRW的多肽在制备趋化因子受体5拮抗药物方面 的用途。
4. 一种药物组合物，其包含： (a) 第一多肽，其氨基酸序列为GHWKVWL ;和/或 (b) 第二多肽，其氨基酸序列为HYIDFRW， 并且包含药学上可接受的载体。
5. 根据权利要求4所述的药物组合物，其包含： (a) 第一多肽，其氨基酸序列为GHWKVWL;和 (b) 第二多肽，其氨基酸序列为HYIDFRW， 并且包含药学上可接受的载体。
6. -种编码多肽的核苷酸序列，所述多肽的氨基酸序列为：(a) GHWKVWL，或（b) HYIDFRW。
7. -种克隆载体，其包含权利要求6所述的核苷酸序列。
8. -种表达载体，其包含权利要求7所述的克隆载体。
9. 一种宿主细胞，其包含权利要求8所述的表达载体。
【专利摘要】本发明提供了一种趋化因子受体5拮抗剂及药物组合物，利用噬菌体展示技术筛选得到两个小分子活性肽，氨基酸序列分别为GHWKVWL和HYIDFRW。这两个多肽具有拮抗趋化因子受体5(CCR5)的功能，具有较高的药用价值。本方面的靶分子直接定位到CCR5的分子结构上，研究出的两个七肽分别针对CCR5的第一胞外环(ECL1)和第二胞外环(ECL2)，拮抗机制明确，体外验证成功，为后期动物模型的治疗效果观察提供了实验基础。
【IPC分类】A61P37-02, A61P37-06, A61P25-00, A61K38-08, C07K7-06, A61P9-10, A61P29-00, A61P19-02, C12N15-11
【公开号】CN104804069
【申请号】CN201410857319
【发明人】钟英强, 刘思雪
【申请人】钟英强, 刘思雪
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年12月31日