专利名称：进行激活素-ActRIIa拮抗剂给药和监测受治疗患者的方法
进行激活素-ActRI Ia拮抗剂给药和监测受治疗患者的方
法相关申请
本申请要求2008年6月沈日提交的美国临时申请号61/133，354的权益，该申请的说 明书在此通过全文引用并入本文。
背景技术：
转化生长因子-β (TGF-β)超家族包含多种生长因子，它们具有共同的序列元件和结 构基序。已知这些蛋白在脊椎动物和无脊椎动物中对多种细胞类型施加生物作用。该超家 族的成员在胚胎发育过程中在模式形成和组织特化方面行使重要功能，并且能够影响多种 分化过程，包括脂肪生成、肌发生、软骨发生、心脏生成、血细胞生成、神经发生和上皮细胞 分化。该家族分成两大分支BMP/GDF和TGF-β/激活素/BMPlO分支，其成员具有多样的， 通常互补的作用。通过操纵TGF-β家族成员的活性，通常可以导致生物中的显著生理学改 变。例如，皮埃蒙特和比利时蓝牛品种携带⑶F8(也称作肌肉抑制素(myostatin))基因中的 功能丧失突变，其导致肌肉量的显著增加。Grobet等人，NatGenet. 1997，17(1) :71-4. 此外，在人类中，GDF8的无活性等位基因与增加的肌肉量相关，并且，据报道，与优越的强度 相关。Schuelke 等人，N Engl J Med 2004，350:2682-8。通过激动或拮抗由合适的TGF-β家族成员介导的信号传导，可以实现肌肉、骨、 软骨和其它组织中的改变。本公开内容的一个目的是提供用于给患者施用TGF-β超家族 的调节剂的替代方法。发明_既述
本公开内容部分涉及给患者施用激活素拮抗剂以及ActRIIa拮抗剂(统称为“激活 素-ActRIIa拮抗剂”)的方法，考虑到所述拮抗剂可以对多种组织，包括红细胞所具有的 作用，施用的方式是适当的。本公开内容部分证明了激活素-ActRIIa拮抗剂可以提高红 细胞和血红蛋白水平并且也增加骨密度。这种双重作用在具有贫血和骨丢失这两者的患 者，例如很多癌患者(其中贫血和骨丢失可以是肿瘤的后果或放疗或化疗的后果)、骨质疏 松患者和肾功能衰竭患者中特别有利。具体地，本公开内容证明了 ActRIIa的可溶形式充 当激活素的抑制剂，并且当体内施用时，提高红细胞水平。尽管可溶性ActRIIa可以通过 除激活素拮抗作用之外的机制影响红细胞水平，但本公开内容证明了可以基于激活素拮抗 作用或ActRIIa拮抗作用或这两者选择期望的治疗剂。所述药剂统称为激活素-ActRIIa 拮抗剂。如本文和公开的专利申请 W0/2009/038745, W0/2008/100384, W0/2008/094708, W0/2008/076437, W0/2007/062188 和 W0/2006/012627 中描述的，激活素-ActRIIa 拮抗剂 也具有多种其它的治疗用途，包括，例如，促进骨生长、降低FSH水平、治疗多发性骨髓瘤和 治疗乳腺癌。在某些情况下，当施用激活素-ActRIIa拮抗剂来促进骨生长或治疗乳腺癌 时，可能期望在施用激活素-ActRIIa拮抗剂的过程中监测对红细胞的作用，或确定或调整 激活素-ActRIIa的给药，从而减少对红细胞的不希望的作用。例如，红细胞水平、血红蛋白 水平或血细胞比容水平的过度升高可能导致血压升高或其它不希望的副作用。也可能期望 限制对具有合适的血液学参数的患者进行激活素-ActRIIa激动剂的给药。例如，可能期望仅仅将给药限于血红蛋白水平低于正常值(例如，低于12 g/dL、低于11 g/dL、低于10 g/dL 或低于9 g/dL或更低)的那些患者。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了管理已经用激活素-ActRIIa拮抗剂 治疗过的患者，或作为用激活素-ActRIIa拮抗剂治疗的候选者的患者的方法，所述激活 素-ActRIIa拮抗剂包括例如结合激活素的ActRIIa多肽、抗激活素抗体、抗ActRIIa抗体、 靶向激活素或ActRIIa的小分子和适体，以及减少激活素或ActRIIa表达的核酸，所述方法 是通过在患者中监测一种或多种与红细胞水平升高相关的血液学参数，诸如，例如红细胞 水平、血压或铁储存(iron stores)而进行的。在某些方面，本公开内容提供多肽，包括与激活素结合的可溶性、结合激活素的 ActRIIa多肽。可将ActRIIa多肽配制成包含该结合激活素的ActRIIa多肽和药学可接受 的载体的药物制剂。该结合激活素的ActRIIa多肽可以小于1微摩尔或小于100、10或1 纳摩尔的Kd与激活素结合。任选地，相对于⑶Fll和/或⑶F8，该结合激活素的ActRIIa 多肽选择性地结合激活素，并任选地以比结合⑶Fll和/或⑶F8的Kd至少低10倍、20倍 或50倍的Kd结合激活素。尽管不希望受到特定作用机制的束缚，预期ActRIIa-Fc中这种 激活素抑制相对于GDF11/GDF8抑制的选择性程度解释了对骨或红细胞生成的作用，而对 肌肉没有一致可测的作用。在许多实施方案中，将选择ActRIIa多肽，从而在达到对红细胞 水平的理想作用的剂量下，引起肌肉中小于15%、小于10%或小于5%的增长。在其它实施 方案中，对肌肉的作用是可接受的，并且不需要针对其进行选择。如通过大小排阻层析所 评估的，该组合物相对于其它多肽成分可具有至少95%的纯度，任选地，该组合物具有至少 98%的纯度。用于此类制剂的结合激活素的ActRIIa多肽可以是本文公开的那些多肽的任 意种，例如具有(即，包含)选自SEQ ID NOs: 2、3、7、12或13的氨基酸序列的多肽，或具有 (即，包含)与选自SEQ ID NOs: 2、3、7、12或13的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、 97%或99%同一性的氨基酸序列的多肽。结合激活素的ActRIIa多肽可包含天然ActRIIa 多肽的功能性片段，例如包含选自SEQ ID NOs: 1-3的序列或SEQ ID NO: 2的序列的至少 10,20或30个氨基酸，缺乏C-末端10至15个氨基酸(“尾”)的功能性片段。可溶性、结合激活素的ActRIIa多肽可包括相对天然存在的ActRIIa多肽在氨基 酸序列(例如，在配体结合域)中的一个或多个改变。分别在WO 2006/0U627的第59-60页 和55-58页(通过引用并入本文)和美国专利序列号12/012,652 (通过引用并入本文)中提 供了改变的ActRIIa多肽的实例。氨基酸序列中的改变可以例如，当在哺乳动物、昆虫或其 它真核细胞中产生时改变多肽的糖基化，或者相对于天然存在的ActRIIa多肽改变多肽的 蛋白酶剪切。结合激活素的ActRIIa多肽可以是融合蛋白，其具有作为一个结构域的ActRIIa 多肽(例如，ActRIIa的配体结合部分)和提供理想特性(例如改善的药代动力学、更容易的 纯化、对特定组织的靶向等)的一个或多个其它结构域。例如，融合蛋白的结构域可增强 以下一项或多项体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白复合物的形 成、融合蛋白的多聚化和/或纯化。结合激活素的ActRIIa融合蛋白可包含提供理想特性 (例如改善的药代动力学、改善的溶解度或改善的稳定性)的免疫球蛋白Fc结构域(野生型 或突变体)或血清白蛋白或其它多肽部分。在优选的实施方式中，ActRIIa-Fc融合体包含 位于Fc结构域和胞外ActRIIa结构域之间的相对非结构化的接头。该非结构化的接头可以是相对不含二级结构的、1、2、3、4或5个氨基酸的人工序列或长度在5到15、20、30、50或更 多氨基酸之间的人工序列，或者两者的混合物。接头可富含甘氨酸和脯氨酸残基，并可以例 如，含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单序列或苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重复序列(例如， TG4(SEQ ID NO: 15) ^ SG4(SEQ ID NO: 16)单序列或重复序列)。融合蛋白可包含纯化子 序列(subsequence)，例如表位标记、FLAG标记、聚组氨酸序列和GST融合体。任选地，可溶 性ActRIIa多肽包含选自如下的一种或多种修饰的氨基酸残基糖基化氨基酸、聚乙二醇 化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸以 及与有机衍生剂缀合的氨基酸。药物制剂还可包含一种或多种额外化合物，例如用于治疗 骨病症的化合物或用于治疗贫血的化合物。优选地，药物制剂基本不含热原。一般而言，优 选在哺乳动物细胞系中表达ActRIIa蛋白，该细胞系合适地介导ActRIIa蛋白的天然糖基 化，从而减少患者中的不利免疫应答的可能性。人和CHO细胞系已被成功使用，预期其它常 见的哺乳动物表达系统将是有用的。如本文所述的，ActRIIa蛋白是指具有理想特性的ActRIIa-Fc，所述特性包括在 动物模型和人患者中相对GDF8和/或GDF11，对激活素的选择性结合、高亲和力配体结合和 大于两周的血清半衰期。在某些实施方式中，本发明提供ActRIIa-Fc多肽和包含此类多肽 和药学可接受的赋形剂的药物制剂。在某些方面，本公开内容提供编码可溶性的结合激活素的ActRIIa多肽的核 酸。分离的多核苷酸可包含例如上文所述的可溶性、结合激活素的ActRIIa多肽的编码序 列。例如，分离的核酸可包含编码ActRIIa的胞外域(例如，配体结合域)的序列以及编码 ActRIIa的部分或全部跨膜结构域和/或胞质域的序列(除定位在该跨膜结构域或胞质域 中或定位在该胞外域与该跨膜结构域或胞质域之间的终止密码子)。例如，分离的多核苷酸 可包含全长ActRIIa多核苷酸序列，例如，SEQ ID NO: 4，或ActRIIa的部分截短的形式， 例如包含SEQ ID NO: 5的核酸序列的核酸，其对应于ActRIIa的胞外域。所述分离的多核 苷酸可以进一步包含在3’-末端之前至少六百个核苷酸处或其它位置的转录终止密码子， 从而使该多核苷酸的翻译产生任选地融合至全长ActRIIa的截短部分的胞外域。优选的 ActRIIa的核酸序列为SEQ ID NO: 14。本文公开的核酸可以可操作地连接至启动子从而 进行表达，且本公开内容提供用此类重组多核苷酸转化的细胞。所述细胞优选为哺乳动物 细胞，例如CHO细胞。在某些方面，本公开内容提供制备可溶性、结合激活素的ActRIIa多肽的方法。所 述方法可包括在合适的细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人细胞中表达本文公开的任 意核酸(例如，SEQ ID NO: 4、5或14)。此类方法可包括a)在适于表达所述可溶性ActRIIa 多肽的条件下培养细胞，其中用可溶性ActRIIa表达构建体转化所述细胞；和b)回收如此 表达的可溶性ActRIIa多肽。可溶性ActRIIa多肽可作为粗制的、部分纯化的或高度纯化 的级分回收。可通过一系列纯化步骤实现纯化，所述纯化步骤包括例如，任意顺序的如下步 骤中的一个、两个或三个或更多个蛋白A层析、阴离子交换层析(例如Q琼脂糖)、疏水作用 层析(例如苯基琼脂糖)、大小排阻层析以及阳离子交换层析。可溶性ActRIIa可以配制为 液体或固体(如冻干的)形式。在某些方面，本公开内容提供了对患者进行激活素-ActRIIa拮抗剂给药的方法， 该方法包括以选定的量和间隔对患者进行给药，从而减少导致在两周内血红蛋白水平的升高大于0. 5 g/dL、l g/dl或1· 5 g/dL的风险。在某些方面，本公开内容提供了给患者施用ActRIIa-Fc融合蛋白的方法，该方法 包括以不高于每60天一次、每90天一次或每120天一次的频率施用ActRIIa融合蛋白。在 某些实施方案中，患者可以是需要骨生长的患者或患有乳腺癌或多发性骨髓瘤或有发展乳 腺癌或多发性骨髓瘤的风险的患者，或需要具有降低的FSH的患者。附图简述
图1显示了在CHO细胞中表达的ActRIIa-hFc的纯化。所述蛋白纯化为单一的、充分 确定的峰，其通过大小区分柱(sizing column)(左图)和考马斯染色的SDS-PAGE (右图) 显现(左泳道分子量标准；右泳道ACtRIIa-hFC)。图2显示了通过BiaCore 测定而测量的ActRIIa-hFc与激活素及⑶F-11的结
口 O图3显示了 ActRIIa-hFc对雌性非人灵长动物的红细胞计数的作用。在第0天、 第7天、第14天和第21天用安慰剂或1 mg/kgUO mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc治 疗雌性猕猴(四组，每组五只猴)。图3A显示红细胞(RBC)计数。图:3B显示血红蛋白水平。 统计学显著性是相对于每个治疗组的基线。在第57天，每个组保留两只猴。图4显示了 ActRIIa-hFc对雄性非人灵长动物的红细胞计数的作用。在第0天、 第7天、第14天和第21天用安慰剂或1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc治 疗雄性猕猴(四组，每组五只猴)。图4A显示红细胞(RBC)计数。图4B显示血红蛋白水平。 统计学显著性是相对于每个治疗组的基线。在第57天，每个组保留两只猴。图5显示了 ActRIIa-hFc对雌性非人灵长动物的网织红细胞计数的作用。在第0 天、第7天、第14天和第21天用安慰剂或1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc 治疗猕猴(四组，每组五只猴)。图5A显示绝对网织红细胞计数。图5B显示网织红细胞相对 于RBC的百分比。统计学显著性是相对于每个组的基线。在第57天，每个组保留两只猴。图6显示了 ActRIIa-hFc对雌性非人灵长动物的网织红细胞计数的作用。在第0 天、第7天、第14天和第21天用安慰剂或1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc 治疗猕猴(四组，每组五只猴)。图6A显示绝对网织红细胞计数。图6B显示网织红细胞相对 于RBC的百分比。统计学显著性是相对于每个组的基线。在第57天，每个组保留两只猴。图7显示了实施例5中描述的人类临床试验所得的结果，其中曲线下面积(AUC) 和ActRIIa-hFc的施用剂量具有线性关系，而与ActRIIa-hFc是通过静脉内(IV)施用还是 皮下(SC)施用无关。图8显示了 IV或SC施用的患者中的ActRIIa-hFc血清水平的比较。图9显示了反应于不同剂量水平的ActRIIa-hFc的骨碱性磷酸酶(BAP)水平。BAP 是合成代谢骨生长的标志。图10描绘了从实施例5所述人临床试验的血细胞比容水平基线的中值改变。 ActRIIa-hFc以所示的剂量静脉内(IV)施用。图11描绘了从实施例5所述人临床试验的血红蛋白水平基线的中值改变。 ActRIIa-hFc以所示的剂量静脉内(IV)施用。图12描绘了从实施例5所述人临床试验的RBC (红细胞)计数基线的中值改变。 ActRIIa-hFc以所示的剂量静脉内(IV)施用。
图13描绘了从实施例5所述人临床试验的网织红细胞计数基线的中值改变。 ActRIIa-hFc以所示的剂量静脉内(IV)施用。图14显示了具有本文推测的残基的人ActRIIA和ActRIIB的比对，所述推测是基 于用方框表示的、直接接触配体的多个ActRIIB和ActRIIA晶体结构(配体结合袋)的复合 分析。图15显示化疗诱导的贫血的小鼠模型中ActRIIA-mFc对血细胞比容的作用。数 据是平均值士 SEM。*，在同一时间点与载体相比P < 0.05。在化疗前单剂ActRIIA-mFc 防止了原本会在施用化疗剂紫杉醇后观察到的血细胞比容水平的下降。图16显示化疗诱导的贫血的小鼠模型中ActRIIA-mFc对血细胞比容的剂量依赖 性作用。数据是平均值士 SEM。#，在同一时间点与载体相比P < 0.01; *#，在同一时 间点与载体相比P < 0.001。在施用紫杉醇2周后，ActRIIA-mFc治疗提高了血细胞比容水 平，该提高是剂数的函数。图17显示慢性肾疾病的部分肾切除的(NEPHX)小鼠模型中ActRIIA-mFc对血细 胞比容的作用。数据是平均值士 SEM。*，在同一时间点与载体相比P < 0.05。ActRIIA-mFc 治疗防止了原本会在4周时观察到的血细胞比容水平的下降，并且在8周时产生了血细胞 比容的有益趋势。发明详述 1. ■
转化生长因子-β (TGF-β)超家族包含多种生长因子，它们具有共同的序列元件和 结构基序。已知这些蛋白在脊椎动物和无脊椎动物中对多种细胞类型施加生物作用。该超 家族的成员在胚胎发育过程中在模式形成和组织特化方面行使重要功能，并且能够影响多 种分化过程，包括脂肪生成、肌发生、软骨发生、心脏生成、血细胞生成、神经发生和上皮细 胞分化。该家族分成两大分支BMP/GDF和TGF- β /激活素/BMPlO分支，其成员具有多样 的，通常互补的作用。通过操纵TGF-β家族成员的活性，通常可以导致生物中的显著生理 学改变。例如，皮埃蒙特和比利时蓝牛品种携带GDF8 (也称作肌肉抑制素)基因中的功能 丧失突变，其导致肌肉量的显著增加。Grobet等人，NatGenet. 1997，17(1):71_4。此 外，在人类中，GDF8的无活性等位基因与增加的肌肉量相关，并且，据报道，与优越的强度相 关。Schuelke 等人，N Engl J Med 2004，350:2682-8。激活素是二聚多肽生长因子，其属于TGF-β超家族。存在三种主要的激活素 形式(Α，B和ΑΒ)，其为两种密切相关的β亚基的同/异二聚体(分别为βΑβΑ，βΒβΒ和 βΑβΒ)。人基因组还编码激活素C和激活素Ε，它们主要在肝中表达，同样已知包括i3c 或β e的异二聚体形式。在TGF-β超家族中，激活素是独特的和多功能的因子，它能刺激 卵巢和胎盘细胞中的激素生成，支持神经元细胞存活，根据细胞类型正面或负面影响细胞 周期进程，并至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层的分化(DePaolo等人，1991，Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512 ;Dyson等人，1997，Curr Biol. 7:81-84 ；Woodruff, 1998,Biochem Pharmacol. 55:953-963)。此外，业已发现从刺激后的人单核细胞白血病细胞中分离的红 细胞分化因子(EDF)与激活素A相同(Murata等人，1988，PNAS，85 2434)。业已表明激活 素A促进骨髓中的红细胞生成。在一些组织中，激活素信号传导被它的相关异二聚体，即抑 制素所拮抗。例如，在从脑垂体释放促卵泡激素(FSH)的过程中，激活素促进FSH分泌和合成，而抑制素阻止FSH的分泌和合成。其它可调节激活素生物活性和/或结合激活素的蛋 白包括促滤泡素抑制素(FS)、促滤泡素抑制素相关蛋白(FSRP)和α 2-巨球蛋白。TGF-β信号由I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚复合物介导，该复合 物在受到配体刺激时磷酸化和激活下游Smad蛋白(Massagu6，2000，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 :169-178)。这些I型和II型受体为跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸的区域的结 合配体的胞外域、跨膜结构域、具有预测的丝氨酸/苏氨酸特异性的胞质域所组成。I型受 体为信号传导所必需；在结合配体和I型受体的表达中需要II型受体。I和II型激活素 受体在配体结合后形成稳定的复合物，导致I型受体被II型受体磷酸化。两种相关的II型受体(ActRlDJPActRIlE^PActRnb已被鉴定为激活素的 II 型受体(Mathews 和 Vale，1991，Cell 65973-982 ;Attisano 等人，1992，Cell 68: 97-108)。除了激活素外，ActRIIa和ActRnb能够与一些其它的TGF-β家族蛋白(包括 BMP7、Nodal、GDF8 和 GDF11)进行生物化学相互作用(Yamashita 等人，1995，J. Cell Biol. 130:217-226 ;Lee 和 McPherron，2001 , Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311 ；Yeo 和 Whitman, 2001 ,Mol. Cell 7: 949-957 ;0h 等人，2002，Genes Dev. 16:2749-54)。ALK4 是 激活素(特别是激活素Α)的主要的I型受体，而ALK-7也可作为激活素(特别是激活素B) 的受体。如本文所证实，相对其它TGF-b家族成员(例如⑶F8或⑶Fl 1)显示与激活素A的 结合的实质优先性的可溶性ActRIIa多肽(sActRIIa)能够有效提高体内红细胞水平。尽 管不希望受限于任何具体机理，考虑到在这些研究中所用的具体sActRIIa构建体所显示 的极强激活素结合(皮摩尔解离常数)，预期sActRIIa的作用主要由激活素拮抗剂作用所引 起。不考虑机理，从本公开内容可显而易见地看出=ActRIIa-激活素拮抗剂提高了啮齿动 物、猴和人的红细胞水平。应指出血细胞生成是一种复杂的过程，它受到多种因素的调节， 包括促红细胞生成素、G-CSF和铁的体内稳态。术语“提高红细胞水平”和“促进红细胞形 成”指临床可观察的度量，例如血细胞比容、红细胞计数和血红蛋白测量值，其意在对于发 生该种改变的机理是中立的。本文报道的关于非人类灵长动物的数据也可在小鼠、大鼠和人中重复，因此，本公 开内容提供了采用ActRII多肽和其它激活素-ActRII拮抗剂在从啮齿动物到人的哺乳动 物中促进红细胞生成和提高红细胞水平的方法。除了刺激红细胞水平，激活素-ActRIIa拮抗剂也可以用于多种治疗应用，包括， 例如，促进骨生长(参见PCT公开号W02007/062188，其通过全文引用并入本文)，并且治疗 乳腺癌(参见PCT申请号PCT/US2008/001429，其通过全文引用并入本文)。在某些情况下， 当为了增加骨或治疗乳腺癌的目的而施用激活素-ActRIIa拮抗剂时，可能期望减少或最 小化或监测对红细胞的作用。在一些情况下，对红细胞和骨或其它组织的双重作用将是期 望的，但是通常认识到药物促进的红细胞的增加，即使最高达到通常认为是正常的水平，也 可能对患者有不利影响，因此通常小心监测或管理。通过监测正在用激活素-ActRIIa拮抗 剂治疗的患者或作为用激活素-ActRIIa拮抗剂治疗的候选者的患者的多种血液学参数， 可以基于个体患者的需要、基线血液学参数和治疗目的确定合适的剂量(包括施用的量和 频率)。此外，通过促进患者护理、确定合适的维持剂量(量和频率)等，随时间的治疗进程和 对一种或多种血液学参数的影响可能对于管理正在进行激活素-ActRIIa拮抗剂给药的患者是有用的。激活素-ActRIIa拮抗剂包括，例如，结合激活素的可溶性ActRIIa多肽、结合 激活素(特别是激活素A和B亚基，也称为βΑ和βΒ)并破坏ActRIIa结合的抗体、结 合ActRIIa并破坏激活素结合的抗体、选择用于激活素或ActRIIa结合的非抗体蛋白 (此类蛋白及其设计和选择的方法的实例参见例如W0/2002/088171、W0/2006/055689和 恥/2002/03四25)、选择用于激活素或ActRIIa结合的随机化的肽，其通常附着在Fc结构域 上。具有激活素或ActRIIa结合活性的两种不同蛋白(或其它部分)，特别是分别阻断I型 (例如可溶性I型激活素受体)和II型(例如可溶性II型激活素受体)结合位点的激活素 结合剂，可连接在一起建立双功能结合分子。抑制该激活素-ActRIIa信号传导轴的核酸适 体、小分子和其它试剂也包括为激活素-ActRIIa拮抗剂。多种蛋白具有激活素-ActRIIa 拮抗剂活性，包括抑制素(即抑制素α亚基)(尽管抑制素并不在所有的组织中普遍拮抗激 活素)、促滤泡素抑制素(例如促滤泡素抑制素-288和促滤泡素抑制素-315)、FSRP, FLRG、 激活素C、α O)-巨球蛋白、以及Μ108Α (在位置108处由甲硫氨酸改变为丙氨酸)突变激 活素Α。一般而言，激活素的替代形式(特别是在I型受体结合域中具有改变的那些形式) 能够结合II型受体且不能形成活性三元复合物，因此充当拮抗剂。此外，抑制激活素Α、 B、C或E或者特别是抑制ActRIIa表达的核酸，例如反义分子、siRNA或核酶可被用作激活 素-ActRII拮抗剂。相对于其它TGF-b家族成员，特别是相对于⑶F8和⑶Fl 1，待使用的激 活素-ActRIIa拮抗剂可对抑制激活素介导的信号传导显示选择性。在本发明的上下文中以及在使用每个术语的特定的上下文中，在本说明书中所用 的术语通常具有其在本领域中的普通含义。在下文以及说明书的其它部分讨论了某些术 语，以在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们的方面为从业者提供额外的 指导。术语的任何使用范围或含义将从使用该术语的特定上下文显而易见。“约”和“大约”一般应表示考虑到测量法的性质和精确性，测得的量的可接受误差 程度。典型地，示例性误差程度为在给定的数值或数值范围的20%以内，优选在10%以内， 更优选在5%以内。或者，特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可表示在一定数量级内，优选在 给定值的5倍以内，更优选在2倍以内的值。除非另有说明，本文给出的数量为近似值，表 示在未明确指出时，可推出术语“约”或“大约”。本发明的方法可包括对序列彼此比较的步骤，包括将野生型序列与一种或多种突 变体(序列变体)进行比较。此类比较通常包括聚合物序列的比对，例如，采用本领域熟知的 序列比对程序和/或算法(例如，稍加举例，BLAST、FASTA和MEGALIGN)进行。本领域技术 人员可容易地理解在此类比对中，当突变包含残基插入或缺失时，该序列比对将在不包含 该插入或缺失的残基的聚合物序列中引入“空位”(通常由破折号或“A”表示)。以及其所有的语法形式和拼写变化表示的“同源性”均指具有“共同进化起源”的 两种蛋白(包括来自相同生物物种的超家族的蛋白，以及来自不同生物物种的同源性蛋白) 之间的关系。此类蛋白(及其编码核酸)具有序列同源性，这反映在它们的序列相似性，不管 是在同一性百分比方面还是在特定残基或基序以及保守位置的存在方面。以其所有的语法形式表示的术语“序列相似性”指可共有或可不共有共同进化起 源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应性程度。
然而，在通常的使用以及在本申请中，当术语“同源性”被副词例如“高度”修饰时， 可表示序列相似性，并可涉及或可不涉及共同进化起源。2. ActRIIa 多肽
在某些方面，本发明涉及ActRIIa多肽。本文所用的术语“ActRIIa”指来自任意物种的 IIa型激活素受体(ActRIIa)蛋白以及通过诱变或其它修饰从所述ActRIIa蛋白衍生的变 体的家族。本文提及ActRIIa时，应理解为提及目前鉴定的形式中的任意一种。该ActRIIa 家族的成员通常为跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸的区域的配体结合胞外域、跨膜结构域 以及具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞质域组成。术语“ActRIIa多肽”包括包含ActRIIa家族成员的任何天然存在的多肽及其保留 了有用活性的任意变体(包括突变体、片段、融合物以及肽模拟(P^tidomimetic)形式)的 多肽。参见，例如W0/2006/0U627。例如，ActRIIa多肽包括由任意已知ActRIIa的序列所 衍生的、具有与ActRIIa多肽的序列有至少约80%同一性、任选至少85%、90%、95%、97%、99% 或更高同一性的序列的多肽。例如，本发明的ActRIIa多肽可结合ActRIIa蛋白和/或激活 素并抑制其功能。可针对在体内促进红细胞形成的活性选择ActRIIa多肽。ActRIIa多肽 的实例包括人ActRIIa前体多肽(SEQ ID NO: 1)和可溶性人ActRIIa多肽(例如，SEQ ID NOs: 2、3、7 和 12)。人ActRIIa前体蛋白序列如下
权利要求
1.管理已经用激活素-ActRIIa拮抗剂治疗过的患者或作为用激活素-ActRIIa拮抗剂 治疗的候选者的患者的方法，该方法包括在患者中监测一种或多种与升高的红细胞水平相 关的血液学参数。
2.权利要求1的方法，其中所述血液学参数是以下一种或多种红细胞水平、血压或铁储存。
3.权利要求1的方法，该方法进一步包括给患者施用激活素-ActRIIa拮抗剂，施用的 量对于患者中所述血液学参数的观察到的水平是合适的。
4.权利要求1的方法，其中，如果患者具有升高到基线之上的血压或是高血压患者，则 减少、延迟或终止激活素-ActRIIa拮抗剂的给药。
5.权利要求1的方法，其中，如果患者具有升高到基线之上的血压或是高血压患者，则 在施用激活素-ActRIIa拮抗剂之前用降压剂治疗患者。
6.权利要求1的方法，其中如果患者具有不受控制的高血压，则减少、延迟或终止激活 素-ActRIIa拮抗剂的给药。
7.权利要求1的方法，其中如果患者具有高于相似年龄和性别的患者的正常范围的红 细胞水平，则减少、延迟或终止激活素-ActRI I a拮抗剂的给药。
8.权利要求1的方法，其中如果患者具有高于15g/dl的血红蛋白水平，则减少、延迟或 终止激活素-ActRIIa拮抗剂的给药。
9.权利要求1的方法，其中如果患者具有高于10、11或12g/dl的血红蛋白水平，则减 少、延迟或终止激活素-ActRIIa拮抗剂的给药。
10.权利要求1的方法，其中如果患者具有低于相似年龄和性别的患者的正常范围的 铁储存，则减少、延迟或终止激活素-ActRIIa拮抗剂的给药。
11.权利要求1的方法，其中如果患者具有低于20%的转铁蛋白饱和度，则减少、延迟或 终止激活素-ActRIIa拮抗剂的给药。
12.权利要求1的方法，其中如果患者具有低于100ng/ml的铁蛋白水平，则减少、延迟 或终止激活素-ActRIIa拮抗剂的给药。
13.权利要求1的方法，其中如果患者具有低于相似年龄和性别的患者的正常范围的 铁储存，则在激活素-ActRIIa拮抗剂给药前用铁补充剂治疗患者。
14.权利要求1的方法，其中如果患者具有低于20%的转铁蛋白饱和度，则在激活 素-ActRIIa拮抗剂给药前用铁补充剂治疗患者。
15.权利要求1的方法，其中如果患者具有低于100ng/ml的铁蛋白水平，则在激活 素-ActRIIa拮抗剂给药前用铁补充剂治疗患者。
16.权利要求1的方法，其中监测红细胞水平包括监测以下一种或多种血红蛋白水平 和血细胞比容水平。
17.权利要求1的方法，其中监测血压包括监测以下一种或多种收缩压、舒张压或平 均动脉压。
18.权利要求1的方法，其中监测铁储存包括监测以下一种或多种转铁蛋白饱和度、 铁蛋白水平或总铁结合力。
19.用激活素-ActRIIa拮抗剂对患者进行给药的方法，该方法包括以选择的量和间隔 对患者进行给药，从而减少导致在两周内血红蛋白水平的升高大于1 g/dl的风险。
20.权利要求1-19的任一项的方法，其中所述患者患有贫血。
21.权利要求1-19的任一项的方法，其中所述患者需要骨生长、增加的骨密度或增加 的骨强度。
22.权利要求1-19的任一项的方法，其中所述患者患有骨相关病症。
23.权利要求1-19的任一项的方法，其中所述患者患有癌。
24.权利要求23的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
25.权利要求1-19的任一项的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是与选自激活素 和ActRIIA的靶蛋白结合的抗体。
26.权利要求1-19的任一项的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是抑制素或抑制 素的保守变体。
27.权利要求1-19的任一项的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是包含结合并拮 抗激活素的促滤泡素抑制素结构域的蛋白。
28.权利要求1-19的任一项的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是选自下组的蛋 白促滤泡素抑制素、促滤泡素抑制素相关基因(FLRG)和前述物质的保守变体。
29.权利要求1-19的任一项的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是选自下组的 ActRIIa 多肽a)包含与SEQID NO: 2具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含与SEQID NO: 3具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；和c)包含选自SEQID NO: 2的至少50个连续氨基酸的多肽；d)包含与SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；e)包含与SEQID NO: 12具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；和f)包含选自SEQID N0: 7的至少50个连续氨基酸的多肽。
30.权利要求四的方法，其中所述多肽具有一种或多种以下特征i)以至少10" M的Kd结合ActRIIa配体；禾口 )抑制细胞中的ActRIIa信号传导。
31.权利要求四的方法，其中所述多肽是融合蛋白，其除了包含ActRIIa多肽结构域 外，还包含一种或多种多肽部分，所述多肽部分增强以下一种或多种体内稳定性、体内半 衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白复合物的形成和/或纯化。
32.权利要求四的方法，其中所述融合蛋白包括选自免疫球蛋白Fc结构域和血清白蛋 白的多肽部分。
33.权利要求四的方法，其中所述多肽包括一个或多个选自下组的修饰的氨基酸残 基糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、 与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。
34.权利要求四的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗剂是ActRIIa-Fc融合蛋白，其 包含选自下组的氨基酸序列a)SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，b)SEQ ID N0: 2的氨基酸序列，c)SEQ ID N0: 7的氨基酸序列，d)与SEQID N0: 7的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，e)与SEQID NO: 7的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，f)SEQ ID NO: 12的氨基酸序列，和g)SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。
35.给患者施用ActRIIa-Fc融合蛋白的方法，该方法包括以不高于每60天一次的频率 施用ActRIIa-Fc融合蛋白。
36.权利要求35的方法，其中以不高于每90天一次的频率给患者施用激活素拮抗剂。
37.权利要求35的方法，其中以不高于每120天一次的频率给患者施用激活素拮抗剂。
38.给有需要的患者施用ActRIIa-Fc融合蛋白的方法，该方法包括给血红蛋白水平低 于10 g/dL的患者施用ActRIIa-Fc融合蛋白。
39.权利要求38的方法，其中所述患者的血红蛋白水平低于11g/dL。
40.权利要求38的方法，其中所述患者的血红蛋白水平低于12g/dL。
41.权利要求38-40的任一项的方法，其中所述患者需要骨生长、增加的骨密度或增加 的骨强度。
42.权利要求38-40的任一项的方法，其中所述患者患有骨相关病症。
43.权利要求38-40的任一项的方法，其中所述患者患有癌。
44.权利要求38-40的任一项的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
全文摘要
在某些方面，本发明提供了对患者进行激活素-ActRIIa拮抗剂给药的方法和管理用激活素-ActRIIa拮抗剂治疗的患者的方法。在某些方面，所述方法涉及测量患者中的一种或多种血液学参数。
文档编号C07K14/00GK102131822SQ200980133293
公开日2011年7月20日 申请日期2009年6月26日 优先权日2008年6月26日
发明者M·L·谢尔曼, N·伯尔格施泰因 申请人:阿塞勒隆制药公司