专利名称：单克隆抗体和使用所述单克隆抗体的免疫测定法的制作方法
单克隆抗体和使用所述单克隆抗体的免疫测定法 发明领域本发明涉及一种单克隆抗体、和来源于所述单克隆抗体的功能片段，以及使用所述单克隆抗体或功能片段的免疫测定法、测定试剂和测定试剂盒，所述单克隆抗体能够特异性与人免疫球蛋白M(IgM)反应并且诱导基于与处于溶液中的人免疫球蛋白M的抗原-抗体反应的凝集。本发明还涉及生产所述单克隆抗体的杂交瘤。此外，本发明涉及用于抑制非特异性反应的试剂和使用所述试剂的免疫测定法， 并且更具体地，涉及用于抑制由人IgM引起的非特异性反应的试剂和使用所述试剂的免疫测定法。
背景技术：
在诊断领域中广泛应用的测定法的实例是通过使用预先针对分析物生成的抗体检测在测试样品中存在的分析物(待检测的物质)的免疫测定法。具体地，免疫凝集测定法是一种基于通过抗体连接分析物所形成的格子样免疫复合物的凝集程度而定性或定量测量样品中的分析物的方法。由于免疫凝集测定法适于光学检测并且可以容易自动化，其广泛应用于检测各种临床测试项目。在最早期免疫反应阶段产生的人IgM以约50-200mg/dL(500-2000 μ g/mL)存在于血浆中，并且代表一种疾病标记，该疾病标记可能潜在地指示多种疾病，如当其水平低于正常水平时指示多发性骨髓瘤(multiple myeloma)和蛋白丢失性肠病(protein-losing enteropathy)，或当其水平高于正常水平时指示胶原蛋白疾病和巨球蛋白血症 (macroglobulinemia)0基于所述免疫凝集测定法原理并且意欲用于人IgM的多种诊断产品还已经投入了实际应用中，但是在这类产品中所用的抗体目前还是多克隆的。多克隆抗体是具有多样反应性的抗体的集合，并且结合分析物分子上的多个表位。因此，多克隆抗体具有强凝集特性，并且最适用于在分子内不具有多个拷贝的同一表位的分析物的免疫凝集测定法。然而，结合多个表位的多克隆抗体具有低的特异性。这在人 IgM的实例中得到实际的示例。由于在体内存在五种结构相似的免疫球蛋白(包括免疫球蛋白G)，IgM-特异性多克隆抗体的制备需要去除与其它免疫球蛋白交叉反应的抗体级分的步骤，这是极端繁琐和费力的。另一方面，单克隆抗体由单一抗体构成，并且由于其结合特异性的表位而具有高特异性，单克隆抗体容易制备并且一致地进行。此外，由于近年来通过遗传工程方式对单克隆抗体的修饰或改变已变得更容易，单克隆抗体不但对于诊断而且在治疗领域中变得日益重要起来，并且其应用范围进一步扩大。原则上，单克隆抗体可以用在用于具有多拷贝同一表位的分析物的免疫凝集测定法中。然而，据信抗-IgM单克隆抗体不能有效诱导与免疫球蛋白M的凝集，所述免疫球蛋白M在其分子内具有10个拷贝的同一表位，并且单克隆抗体目前为止尚未用在免疫凝集测定法中。如
图1所示，血浆IgM具有星形构型，其中5个Y型的结构单位以其尾在中央并且头在外围方式而排列。Y型是免疫球蛋白的结构单位，并且公知的是其铰链区是柔性的。此夕卜，如在非专利文献1的电子显微镜照片中所示，5个Y型结构单位可以呈现(b)扁平的星形构象，其中Y型的尾在中央，头在外围，或(c)以“蟹型”描述的构象，其中Y型的头指向锚定尾部的基底的相同方向，这证实锚定Y型的尾的区域也是柔性的。 由于锚定IgM分子内的每个亚基的区域是柔性的，并且该分子的三维结构如上文所解释那样易于变化，抗-IgM单克隆抗体将不能通过结合两个IgM分子而形成分子间连接，相反主要通过如图2所示结合单一 IgM分子上两个位置的表位而形成所谓的分子内连接。因此，已经相信抗-IgM单克隆抗体不能有效诱导与人IgM的免疫凝集，并且勉为其难地使用结合多个表位的多克隆抗体。尽管存在一些使用单克隆抗体的实例，其仅代表其中组合使用多种单克隆抗体以产生多克隆抗体效应的案例(例如，专利文献4，实施例3)。因此，具有独立凝集人1#特性的单克隆抗体尚是未知的。此外，基于在将人1#或抗-人IgM 单克隆抗体固定在固相上的条件下评估的反应性强度，先前已经进行了生产抗-人IgM单克隆抗体的杂交瘤的产生的筛选步骤；即，在溶液中它们之间的反应性未被用作指标(专利文献1-3)。近年来的技术进步已经能够产生针对不同物质的抗体，并且因此基于免疫测定法的诊断试剂应用的数目持续增加。因此，所述试剂中需要的性能水平变得比以前更高，并且最近产生了对严格防止非特异性反应的需求。非特异性反应是指这样的现象，其中测试样品中所包含的因素促进不基于特异性反应的键合，或者抑制特异性免疫反应，其可能引起错误的测定结果。已知引起非特异性反应的因素包括嗜异性抗体和类风湿因子(RF)。嗜异性抗体是关于表现出针对动物来源的抗体的反应性的人抗体的总称，所述人抗体是免疫测定法的主要成分。典型的嗜异性抗体实例是HAMA(人抗-鼠-免疫球蛋白抗体)。嗜异性抗体可以作为不知不觉诱导的针对抗原的致敏性的结果，如通过食用、通过与动物接触、并且通过施用生物药剂的结果而产生。然而，未致敏的抗体也可能表现出嗜异性抗体的特性，并且因此关于嗜异性抗体的来源需要理解更多。另一方面，类风湿因子出现在类风湿性关节炎患者中，并且也已经确定了其结合位点。因此，类风湿因子理解为与嗜异性抗体不同的概念，但是它们共有表现出针对动物来源的抗体的反应性的相同特性，并且均已知它们的身份为人IgG或IgM，如在非专利文献2中所述。至于关于由嗜异性抗体引起的非特异性反应的测量，非专利文献3和4中所述的包含抗_人IgM单克隆抗体的嗜异性阻断剂HBR早已是可商购获得的，并且已经用在多种利用免疫测定法原理的临床检测中。关于抑制非特异性反应的其它先前考虑的测量包括专利文献5的测量，其包括添加针对人IgM天然抗体的多克隆抗体，所述多克隆抗体与测定中所用的抗体在相同的动物物种中制备，和包括专利文献6的测量，其包括添加针对类风湿因子的结合位点的抗体，所述抗体来源于多种动物的任一种。然而，多克隆抗体的应用在长时间阶段中需要大量的抗原来免疫动物。此外，前者可能仅抑制由天然抗体引起的非特异性反应，并且后者仅具有抑制非特异性反应的有限效应，原因在于其中所识别的类风湿因子的结合位点首先具有可变的性质。事实上，由于利用免疫测定法的检测和检测项目的数目的增加，用于抑制非特异性反应的常规测量不能有效地用于某些样品变得明显起来。已有技术文献
专利文献专利文献1 日本专利申请公布S60-42400专利文献2 日本专利申请公布S63-58260专利文献3 日本专利申请公布H06-504424专利文献4 日本专利申请公布S60-237363专利文献5 日本专利4065600专利文献6 日本专利申请公布H07-012818非专利文献非专利文献1 :Roitt，Essential Immunology (基本免疫学)，初始语言第3版，图 2. 16.非专利文献2 =Rinsho Kagaku,卷 23 附录 175a-l-175a_10 (1994).非专利文献 3 :Advertisement material for the heterophilic blocking reagent HBR(嗜异性阻断剂 HBR 的广告资料)(Nagase&Co. Ltd.，1993)非专利文献4 :CLIN. CHEM. 45/7，942-956 (1999)发明的公开内容本发明要解决的问题本发明的一个目的是提供一种抗_人IgM单克隆抗体、所述单克隆抗体的功能片段，以及使用所述单克隆抗体或片段的免疫测定法、测定试剂和测定试剂盒，所述抗_人 IgM单克隆抗体与人IgM特异性反应，并且能够诱导基于在溶液中与人IgM的抗原-抗体反应的凝集，并且进一步提供生产所述单克隆抗体的杂交瘤。本发明的另一个目的是提供用于抑制由人IgM引起的非特异性反应的试剂和使用所述试剂的免疫测定法。解决问题的方式本发明人已经进行了广泛的研究来达到上述目的，并且通过在与人IgM反应的单克隆抗体的筛选中利用溶液中反应性作为评估指标，本发明人已经能够发现这样的新型单克隆抗体，所述单克隆抗体自身(即，通过作为唯一的单克隆抗体)能够提供人IgM分子之间的连接从而引起凝集，并且能够进行实际的免疫凝集测定法。这已经导致本发明的完成。 这样获得的单克隆抗体不必在将抗原固定在固相上的常规评估方法中表现出高反应性。本发明人还已经做出了令人吃惊的发现，即甚至那些不能通过常规措施阻断的非特异性反应可以被自身能够凝集人IgM的所述抗-人IgM单克隆抗体强烈抑制。因此，本发明的另一个目的是提供用于抑制非特异性反应的试剂，其包括自身能够凝集人IgM的抗-人IgM单克隆抗体。本发明的另一个目的涉及免疫测定法、测定试剂和测定试剂盒，其特征在于，通过添加自身能够凝集人IgM的抗-人IgM单克隆抗体获得对非特异性反应的抑制和基于抗原_抗体反应的免疫测定法的测量精确性。具体地，本发明包括下述(1)抗-人IgM单克隆抗体，其与人IgM特异性反应，并且能够形成基于与处于溶液中的人IgM的抗原-抗体反应的免疫聚集物。(2)根据上述⑴所述的抗_人IgM单克隆抗体，其通过生产抗-人IgM单克隆抗体的方法获得，所述方法包括下述步骤步骤1)通过使用人IgM作为抗原获得产生抗_人IgM抗体的杂交瘤的步骤；
步骤2)使得通过步骤1中获得的杂交瘤产生的抗体与溶液中的人IgM接触，并且选择产生能够形成基于与处于所述溶液中的人IgM的抗原-抗体反应的免疫聚集物的抗体的杂交瘤的步骤；步骤3)获得通过步骤2所选择的杂交瘤产生的抗体的步骤。(3)选自下述(a)或(b)的抗体(a)由FERM BP-11134杂交瘤产生的单克隆抗体；(b)根据(1)所述的抗体，其表现出与根据上述(a)的抗体的交叉反应性。(4)来源于根据上述(1)_(3)任一项所述的抗_人IgM单克隆抗体的功能片段。(5)用于确定样品中人IgM的量的免疫凝集测定法，其包括使用根据上述(1)_(3) 任一项所述的单克隆抗体和/或根据上述(4)所述的来源于所述单克隆抗体的功能片段。(6)用于确定样品中人IgM的量的免疫凝集测定试剂和免疫凝集测定试剂盒，其包括根据上述(1)_(3)任一项所述的单克隆抗体和/或根据上述(4)所述的来源于所述单克隆抗体的功能片段。(7)生产根据上述(1)或(2)所述的单克隆抗体的杂交瘤。(8) FERM BP-11134 杂交瘤。(9)生产抗-人IgM单克隆抗体的方法，其包括下述步骤步骤1)通过使用人IgM作为抗原获得产生抗_人IgM抗体的杂交瘤的步骤；步骤2)使得通过步骤1中获得的杂交瘤产生的抗体与溶液中的人IgM接触，并且选择产生能够形成基于在所述溶液中与人IgM的抗原-抗体反应的免疫聚集物的抗体的杂交瘤的步骤；步骤3)获得通过步骤2所选择的杂交瘤产生的抗体的步骤。(10)用于抑制由人IgM引起的非特异性反应的试剂，其包括根据上述(1)_(3)任一项所述的单克隆抗体和/或根据上述(4)所述的来源于所述单克隆抗体的功能片段。(11)用于基于分析物和测试抗体或测试抗原之间的抗原_抗体反应来确定样品中分析物的量的免疫测定法，其中通过添加用于抑制由人IgM引起的非特异性反应的试剂而抑制由人IgM引起的不包括所述抗原-抗体反应的非特异性反应，所述试剂包括根据上述(1)_(3)任一项所述的单克隆抗体和/或根据上述(4)所述的来源于所述单克隆抗体的功能片段。(12)根据上述(11)所述的免疫测定法，其中所述测试抗体或测试抗原被支持在不溶载体上。(13)根据上述(12)所述的免疫测定法，其中所述不溶载体包括胶乳、胶体金属或硅石。(14)免疫测定试剂和免疫测定试剂盒，其包括用于抑制由人IgM引起的非特异性反应的试剂，其包括根据上述(1)_(3)任一项所述的单克隆抗体和/或根据上述(4)所述的来源于所述单克隆抗体的功能片段；和用于确定样品中分析物的量的测试抗体或测试抗原。(15)根据上述(14)所述的免疫测定试剂和免疫测定试剂盒，其中所述测试抗体或测试抗原被支持在不溶载体上。(16)根据上述(15)所述的免疫测定试剂和免疫测定试剂盒，其中所述不溶载体包括胶乳、胶体金属或硅石。发明效果
本发明的单克隆抗体已经使得提供用于特异性检测人IgM的方法、以及提供用于测定人IgM的免疫凝集的高质量和廉价的试剂和试剂盒成为可能。此外，由于本发明的筛选单克隆抗体的方法评估溶液中的凝集程度作为选择抗体的指标，所述方法有效并且能够以高精确度选择目的单克隆抗体。此外，由于本发明用于抑制非特异性反应的试剂不与表现出分子内连接的IgM形成1 1的复合物，所述试剂可以有效地中和IgM的干扰。因此，使用本发明的试剂的免疫测定法、免疫测定试剂和免疫测定试剂盒不仅可以抑制由人IgM引起的普通类型的非特异性反应，而且可以抑制常规措施不能防止的那些。因此，本发明能够比常规测量方法更准确地测量宽范围的测试项目和测试样品，并且可以适用于在日益增多的临床检测中所用的免疫测定法。附图简述[图1]人IgM的结构建模。[图2]人IgM和常规抗-人IgM单克隆抗体的结合模式。[图3]使用本发明的抗-人IgM单克隆抗体的免疫凝集测量检测的结果(实施例 1).[图4]本发明的用于抑制非特异性反应的试剂和用于阻断非特异性反应的对照试剂对使用用于PSA检测的胶乳试剂的正常样本测定的影响。[图5]本发明的试剂和用于阻断非特异性反应的对照试剂对使用用于PSA检测的胶乳试剂的非特异性反应样本测定的阻断效应。[图6]本发明的试剂和用于阻断非特异性反应的对照试剂对使用用于胰岛素检测的试剂的非特异性反应样本的测量的阻断效应。实施本发明的最佳方式抗-人IgM单克隆抗体本发明的抗-人IgM单克隆抗体不受任何具体限制的束缚，只要其具有下列特性 与人IgM特异性反应，在溶液中在人IgM分子之间形成分子间连接，和能够作为单一的单克隆抗体进行免疫凝集测定法。“与人IgM特异性反应”用于本文意指所述单克隆抗体与人 IgM但不与其他人免疫球蛋白进行抗原_抗体反应。从针对IgM的单克隆抗体是否能够引起免疫凝集的观点来看，先前没有进行关于针对IgM的单克隆抗体的探寻，并且因此本发明的自身可以凝集人IgM的抗-人IgM单克隆抗体是新颖的。此外，常规抗-IgM单克隆抗体不提供在两个免疫球蛋白分子之间的连接，并且仅能够在单个免疫球蛋白分子内形成分子内连接。然而，本发明的自身可以凝集人IgM的单克隆抗体可以在人IgM分子之间形成分子间连接，并且因此其能够强烈抑制由人IgM引起的非特异性反应，并且如下文所述，其可以适合用作用于抑制非特异性反应的试剂。本发明的所述抗-人IgM单克隆抗体的具体实例包括由FERM BP-11134杂交瘤生产的单克隆抗体。此外，表现出与FERM BP-11134杂交瘤产生的单克隆抗体的交叉反应性的抗体也包括在本发明的抗体范围内。表现出与FERM BP-11134杂交瘤产生的单克隆抗体的交叉反应性的抗体包括可以特异性识别与所述单克隆抗体相同的表位(抗原决定簇)的氨基酸序列。 功能片段在本发明中，可以使用包含来源于所述单克隆抗体的Fab区域的任何功能片段， 而不管所述Fab区域是通过对所述单克隆抗体进行酶降解、通过遗传加工、或通过其他方式获得的。因此，在本发明的功能片段中，术语“功能”特别意指所述片段具有与人IgM结合的能力。检测样品用于使用根据本发明所述的抗-人IgM单克隆抗体或其功能片段的针对人IgM的免疫凝集测定法的检测样品可以是任何生物样品，诸如体液，例如，血液、血清、血浆和尿。测定法根据本发明所述的用于人IgM的免疫凝集测定法不受任何具体限制的束缚，只要其通过以某种方式将本发明的抗-人IgM单克隆抗体和检测样品混合并且因此诱导免疫凝集而检测人IgM。为了进一步促进免疫凝集，识别与所述单克隆抗体的表位不同的表位的另一种抗_人IgM单克隆抗体也可以一起使用，并且关于该额外的单克隆抗体的特性没有特别的限制。免疫凝集测定试剂和测定试剂盒用于使用本发明的抗-人IgM单克隆抗体或其功能片段的关于人IgM的免疫凝集测定法的试剂和试剂盒可以包含缓冲样品的离子强度、等渗强度等的成分，或增强免疫凝集的成分。缓冲样品的离子强度、等渗强度等的成分的实例包括乙酸、柠檬酸、磷酸、Tris, 甘氨酸、硼酸、碳酸、和Good’ s缓冲液、以及钠盐、钾盐、和钙盐。增强免疫凝集的成分的实例包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、和磷脂聚合物。用于使用本发明的抗-人IgM单克隆抗体或其功能片段的关于人IgM的免疫凝集测定法的试剂和试剂盒与光学测量相容，所述光学测量在分光光度计、在利用分光光度测定原理的日立公司(Hitachi corporation)的自动分析仪、在常规自动分析仪如东芝公司(Toshiba corporation)的TBA系列、JEOL公司的BM系列、奥林巴斯公司(Olympus corporation)的 AU 系列、禾口 Sekisui 医学公司(Sekisui Medical corporation)的 CP2000、分析近红外波长范围的装置(例如，Mitsubishi Kagaku Iatron公司的LPIA)、测量散射光强度的装置(例如，Dade Behring公司的BN系统)等上进行。对于制备本发明的抗_人IgM单克隆抗体所用的技术没有特别限制，但是通常其包括产生杂交瘤。在选择本发明的抗-人IgM单克隆抗体的评估过程中，基于抗体在溶液中诱导的人IgM的凝集程度来筛选所述抗体。因此，这样获得的抗_人IgM单克隆抗体将具有与人IgM特异性反应并且自身凝集人IgM的特性。可以允许任何结构改变或修饰来制备本发明的抗_人IgM单克隆抗体，只要所述改变或修饰没有极大消弱单克隆抗体与人IgM的反应性的特征。杂交瘤用于生产本发明的抗_人IgM单克隆抗体的杂交瘤可以是能够产生抗-人IgM单克隆抗体的任何杂交瘤，所述抗-人IgM单克隆抗体可以与人IgM特异性反应并且基于溶液中的抗原-抗体反应诱导与人IgM的免疫凝集，并且所述杂交瘤可以基于由其产生的单克隆抗体高度能够在溶液中诱导与人IgM的免疫凝集进行选择。因此，本发明的抗-人IgM 单克隆抗体可以通过下述步骤1)_3)进行生产步骤1)通过使用人IgM作为抗原建立产生抗_人IgM抗体的杂交瘤的步骤；步骤2)使得通过步骤1中获得的杂交瘤产生的抗体与溶液中的人IgM接触，并且选择产生能够形成基于与处于所述溶液中的人IgM的抗原-抗体反应的免疫聚集物的抗体的杂交瘤的步骤； 步骤3)获得通过步骤2所选择的杂交瘤产生的抗体的步骤。步骤2所选择的杂交瘤的实例包括!7ERM BP-11134。更具体地，在上述生产过程中的杂交瘤筛选可以通过允许所纯化的抗体与溶液中的人IgM反应并且基于相应抗体在溶液中诱导免疫凝集的能力的差异来选择杂交瘤而进行。为了选择更有效地产生本发明的抗体的杂交瘤，可以在上述选择过程之前，例如，通过对固相上的人IgM使用杂交瘤培养物上清而不是纯化的抗体，如在ELISA等中，进行产生抗-人IgM抗体的杂交瘤的预选。通过上述选择过程获得的抗体将具有与人IgM特异性反应并且自身能够在溶液中在人IgM分子之间形成分子间连接且因此形成免疫聚集物的特性。应用本发明的抗_人IgM单克隆抗体可以应用于任何目的，其利用其与人IgM特异性反应并且自身凝集人IgM的特性。优选的实例包括在上述关于人IgM的免疫凝集测定法中的应用以及用作抑制由人IgM引起的非特异性反应的试剂。本发明的抗-人IgM单克隆抗体可以适合用作抑制由人IgM引起的非特异性反应的试剂，因为其不引起与人IgM分子的 1 1分子内连接，并且因此其可以有效地中和人IgM。尚不清楚本发明的抗体通过什么机制能够抑制由IgM引起的甚至不能由常规抑制非特异性反应的试剂所抑制的那些非特异性反应，但是相信其在溶液中凝集人IgM的能力与所述机制高度相关。例如，可能的是，可以在溶液中凝集人IgM的抗-人IgM单克隆抗体识别在人IgM分子中普遍存在的表位，而不管其是否是嗜异性抗体类型、类风湿因子(RF)类型、或其他。因此，在本发明的情形中，由人IgM引起的非特异性反应是指由人IgM引起的所有非特异性反应，包括其作用机制已知的那些，如以嗜异性抗体或类风湿因子(RF)形式的人 IgM与动物来源的抗体反应，以及其作用机制尚是未知的那些。因此，本发明抑制非特异性反应的试剂意欲用于其中引起因子为人IgM的所有非特异性反应。本发明的抗-人IgM单克隆抗体作为抑制非特异性反应的试剂的应用可以是在溶液中和在固相上有效的。例如，本发明的试剂在溶液中抑制非特异性反应的应用可以是这样的情形，其中将所述试剂添加到样品溶液中，并且允许所述试剂与溶液中的人IgM反应以引起人IgM的凝集。例如，所述试剂在固相上的应用可以是这样的情形，其中将包含所述试剂的溶液添加到用于免疫层析的样品垫上，并且干燥和预先固定在其上，且将样品溶液应用到且流过所述样品垫，其中所述样品溶液中包含的人IgM将被已经固定的所述试剂捕
-M-犾。本发明的抑制非特异性反应的试剂可以用于免疫测定法，以基于在分析物与测试抗体或测试抗原之间的抗原_抗体反应确定样品中分析物的量，并且通过这一应用，由人IgM引起的不包含所述抗原_抗体反应的非特异性反应可以被有效抑制，并且因此可以获得精确的免疫学测量。用于本发明的免疫测定法、测试试剂、和测定试剂盒的检测样品可以是其中可能发生由 人IgM引起的非特异性反应的各种人生物学样品中的任一种，所述本发明的免疫测定法、测试试剂、和测定试剂盒的特征在于，添加自身能够凝集人IgM的抗-人IgM单克隆抗体从而抑制非特异性反应和获得精确的测量。检测样品的实例包括体液，诸如血液、血清、血浆和尿。此外，所述分析物可以是任何分子，只要其能够进行抗原_抗体反应，并且分析物的实例包括CRP (C-反应性蛋白)，Lp (a)，MMP3(基质金属蛋白酶3)，IV型胶原蛋白， PSA (前列腺特异性抗原)，BNP (脑钠肽(brain natriuretic ρ印tide))，胰岛素，微量白蛋白(microalbumin)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cyStatin C)，抗磷脂抗体，抗-苍白密螺旋体抗体(anti-Tr印onema pallidum antibody)，FDP(血纤蛋白/凝血因子I降解产物)， D- 二聚体，SF (可溶性血纤蛋白)，TAT (凝血酶-抗凝血酶111复合物)，因子XIII，和胃蛋白酶原I与II，以及半抗原如下述药物苯妥英(phenytoin)，苯巴比妥(phenobarbital)， 卡马西平(carbamaz印ine)，丙戊酸盐(valproate)，和茶碱(theophylline)。然而，本发明的原理不允许在这些分析物实例中包含人IgM。本发明的抗-人IgM单克隆抗体能够自身凝集人IgM，用作抑制由IgM引起的非特异性反应的试剂，其可以添加到溶液中或固相中。对于所添加的所述试剂的浓度没有特别的限制，只要其有效产生抑制非特异性反应的作用且不干扰免疫测定法的主要反应，但是所述试剂优选以0. Ol-lOmg/mL的浓度范围，更优选以0. 05-lmg/mL的浓度范围应用。 在实际的测定中，如果在使测试抗体或测试抗原与检测样品接触的步骤之前，将本发明的抗-人IgM单克隆抗体与检测样品接触，可以更有效地抑制非特异性反应。抑制非特异性反应的其他措施或其他抑制剂成分也可以组合使用。在本发明的免疫测定法、测定试剂和测定试剂盒中，其中将在免疫学测量中是仪器化的成分(测试抗体或测试抗原)支持在不溶载体上，所述不溶载体可以是任何材料，只要其是可接受作为医学检测试剂成分的不溶材料；具体的实例包括胶乳颗粒、胶体金属、硅石和碳，并且尤其优选胶乳颗粒。可以根据分析物的类型和本发明的免疫测定法、测定试剂和测定试剂盒的检测原理适当选择不溶载体的材料和尺寸。在上述胶乳颗粒的情形中，载体颗粒包括通过具有苯基的单体和具有苯基的单体的聚合制得的共聚物，并且磺酸盐是优选的，其通过透射电子显微镜测量的平均粒度为0. 01-1. 5 μ m,优选0. 03-0. 8 μ m,更优选 0. 05-0. 5 μ m。在本发明的免疫测定法中，其特征在于抑制非特异性因子对与分析物分子特异性结合的抗体的作用，以获得精确的测量，可以使用任何检测原理，如酶学检测、荧光检测、化学发光检测、基于浊度的检测等。此外，操作和评估可以手动进行或机械化进行。因此，本发明的免疫测定试剂和测定试剂盒可以用在下述任一项中ELISA，EIA，化学发光法，免疫层析法，免疫凝集法，胶乳强化的免疫凝集法等。特别地，免疫凝集法和胶乳强化的免疫凝集法可以在与上述用于人IgM的免疫凝集测定试剂和测定试剂盒所用的那些相同的仪器中进行。此外，除了主要成分之外，使用抑制由人IgM引起的非特异性反应的试剂的本发明的免疫测定试剂和测定试剂盒可以包含缓冲样品的离子强度、等渗强度等的成分，或增强免疫凝集的成分，其可以是与上述关于用于人IgM的免疫凝集测定试剂和测定试剂盒所述相同的成分。
实施例
下文中，将通过提供生产自身能够诱导人IgM免疫凝集的抗_人IgM单克隆抗体的方法、使用所述单克隆抗体的免疫凝集测定法、和使用所述单克隆抗体作为抑制非特异性反应的试剂的免疫测定法的实例，详细解释本发明的部分。然而，本发明不限于这些实例。[检测实施例1]生产本发明的抗-人IgM单克隆抗体(1)建立产生抗-人IgM单克隆抗体的杂交瘤在单次免疫中使用100 μ g纯化的人IgM(由CHEMICON公司供应)。在第一次免疫中，将通过混合等体积的人IgM和弗氏完全佐剂制备的200 μ L乳剂注射到每只BALB/c小鼠的腹腔。对于另外的免疫，使用通过用弗氏不完全佐剂类似制备的200 μ L乳剂，并且以每两周的时间间隔重复免疫三次。通过ELISA测量由小鼠尾静脉收集的血液的抗体滴度， 并且选择显示出高滴度的小鼠用于细胞融合。在第四次免疫后两周，将溶解在200 μ L盐溶液中的100 μ g人IgM注射到小鼠腹腔中，并在三天后取出脾。将脾在RPMI1640培养基中分散，然后通过以l，500rpm离心收集脾细胞。细胞在不含胎牛血清的RPMI1640培养基中洗涤至少三次，然后悬浮在2mL包含15%胎牛血清的RPMI1640培养基中，以产生脾细胞混悬液。在将脾细胞和SP2/0-AG14骨髓瘤细胞以6 1的比例混合后，在存在50%聚乙二醇的条件下诱导细胞融合，且这样获得杂交瘤(融合的细胞)。以l，500rpm离心后，收集沉淀， 并且悬浮在GKN溶液(2g葡萄糖，0. 4g氯化钾，Sg氯化钠，1. 41g磷酸氢二钠，和0. 78g磷酸二氢钠二水合物溶解在纯水中制成IL GKN溶液)中，通过离心洗涤，并且收集沉淀。沉淀的细胞悬浮在30mL包含15%胎牛血清的RPMI1640培养基中，将100 μ L该混悬液和200 μ L 以2. 5 X IO6细胞/mL含有BALB/c小鼠胸腺细胞(代表饲养细胞)的HAT培养基分散在三个96-孔微量平板的每个孔中。将杂交瘤在5%二氧化碳的培养箱中在37°C培养。抗-人IgM抗体在培养物上清中的存在通过使用在固相上的人IgM的ELISA验证。在细胞融合后10天，验证在每个孔中的杂交瘤生长。详细地，将含有150mM氯化钠和 10 μ g/mL人IgM的100 μ L IOmM磷酸缓冲液(ρΗ 7. 2 ；以下简写为PBS)分散在96孔微量平板的每个孔中，并且在4°C过夜。在将这些96孔微量平板用含有0. 05%吐温20和牛血清白蛋白的300 μ L PBS洗涤三次后，以50 μ L/孔加入培养物上清，并且将平板置于室温 1小时。在将平板用含有0. 05%吐温20的PBS (以下简称为PBS-T)洗涤三次后，以50 μ L/ 孔加入过氧化物酶标记的山羊抗_小鼠IgG抗体(南方生物科技公司(SouthernBiotech corporation))，并且将平板置于室温1小时。然后，将平板用PBS-T洗涤三次，以50 μ L/孔向其中加入含有0. 2%邻-苯二胺和0. 02%过氧化氢的柠檬酸缓冲液，将平板置于室温15 分钟，以50 μ L/孔加入4. 5Ν硫酸以终止反应。测量每个孔在492nm处的吸光度，并且选择显示出与空白有差异的孔作为阳性孔。通过有限次稀释使得细胞成为单克隆的。即，将来自上述阳性孔的杂交瘤稀释至 10细胞/mL，并且将0. ImL每种这些稀释液置于96-孔微量平板的孔中，所述孔中已经以 IO6细胞/孔分散了 BALB/c小鼠胸腺细胞作为饲养细胞。HAT培养基用于第一次培养，含有15%胎牛血清的RPMI1640用于随后的培养。每次培养在具有5%二氧化碳的培养箱中在37°C持续10天。关于选择阳性孔的ELISA和关于建立单克隆性的有限稀释分别重复三次，并且因此获得26个产生抗-人IgM单克隆抗体的杂交瘤系(A至Z)。(2)生产单克隆抗体将来自每种杂交瘤系的约IO5个细胞转移到已经用降植烷(pristane)预先处理的小鼠腹腔中，收集在其中产生的腹水。将收集的腹水液离心，以去除不溶物质，并且与等体积的饱和硫酸铵溶液混合。将混合物搅动过夜，离心后，收集沉淀物。将收集到的沉淀物溶解在20mM Tris缓冲液(pH8. 0)中并且在相同的缓冲液中透析。将透析的物质分别吸附在已用相同的缓冲液平衡的DEAE-琼脂糖柱上，通过用在相同缓冲液中的0-300mM浓度梯度的氯化钠洗脱获得抗_人IgM单克隆抗体。由杂交瘤A至Z产生的抗-人IgM单克隆抗体分别表示为抗体a至ζ，并且进行下述检测。[评估实施例](1)评估实施例1 评估在固相上的反应性(常规评估方法)将以1 μ g/mL含有人IgM的50 μ L PBS分散在96-孔微量平板中，并且置于室温下1小时，因此将人IgM固定在微量平板上。然后，将微量平板用200 μ L含有3% BSA(牛血清白蛋白)的PBS封闭，在向孔中加入50 μ L含有1 μ g/mL的抗-人IgM单克隆抗体的 PBS后，将其置于室温下1小时。然后，将微量平板用PBS-T洗涤三次，以50 μ L/孔加入过氧化物酶标记的抗-鼠抗体，将该微量平板置于室温下1小时。在用PBS-T洗涤三次后，向每个孔中加入2，2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2，2' -azino-bis(3-ethy lbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS)(由KPL公司供应)底物溶液，将微量平板置于室温下20分钟。通过向每个孔中加入50 μ L SDS溶液终止反应。测量在405nm波长处的吸光度，并且根据吸光度，排列所述抗-人IgM单克隆抗体的反应性强度(表1)，(2)评估实施例2 评估在溶液中的反应性(本发明所述的评估法)将750 μ L每种抗-人IgM单克隆抗体溶液(S卩IOOmM Tris-盐酸缓冲液，ρΗ 8.0， 含有400 μ g/mL纯化的抗-人IgM单克隆抗体，3%聚乙二醇6000，5mM柠檬酸三钠和2. 5mM 氯化钙(脱水物))添加到150 μ L含有200 μ g/mL人IgM的PBS中，并且搅拌该混合物。10 分钟后,通过在日立U-3310分光光度计(Hitachi U-3310spectrophotometer)中使用两种波长(主波长340nm和次波长800nm)测量吸光度(吸光度2)。在对照中，将750 μ L每种抗-人IgM单克隆抗体溶液添加到150 μ L不含人IgM的PBS中，搅拌该混合物，并且在相同条件下测量吸光度(吸光度1)。通过由吸光度2减去吸光度1计算伴有人-IgM-特异性免疫凝集的吸光度的变化(表1)。[表 1]
权利要求
1.抗-人IgM单克隆抗体，其与人IgM特异性反应，并且能够诱导基于与处于溶液中的人IgM的抗原-抗体反应的免疫凝集。
2.根据权利要求1所述的抗_人IgM单克隆抗体，其通过生产抗_人IgM单克隆抗体的方法获得，所述方法包括下述步骤步骤1)通过使用人IgM作为抗原建立产生抗-人IgM抗体的杂交瘤的步骤；步骤2)使得通过步骤1中获得的杂交瘤产生的抗体与处于溶液中的人IgM接触，并且选择产生能够诱导基于与处于所述溶液中的人IgM的抗原-抗体反应的免疫凝集的抗体的杂交瘤的步骤；和步骤3)获得通过步骤2所选择的杂交瘤产生的抗体的步骤。
3.选自下述(a)或(b)的抗体(a)由FERMBP-11134杂交瘤产生的单克隆抗体；(b)根据权利要求1所述的抗体，其表现出与根据上述(a)的抗体的交叉反应性。
4.来源于根据权利要求1-3任一项所述的抗-人IgM单克隆抗体的功能片段。
5.用于确定样品中人IgM的量的免疫凝集测定法，其包括使用根据权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体和/或根据权利要求4所述的来源于所述单克隆抗体的功能片段。
6.用于确定样品中人IgM的量的免疫凝集测定试剂和免疫凝集测定试剂盒，其包括根据权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体和/或根据权利要求4所述的来源于所述单克隆抗体的功能片段。
7.生产根据权利要求1或2所述的单克隆抗体的杂交瘤。
8.FERM BP-11134 杂交瘤。
9.生产抗_人IgM单克隆抗体的方法，其包括下述步骤步骤1)通过使用人IgM作为抗原建立产生抗-人IgM抗体的杂交瘤的步骤；步骤2)使得通过步骤1中获得的杂交瘤产生的抗体与处于溶液中的人IgM接触，并且选择产生能够诱导基于与处于所述溶液中的人IgM的抗原-抗体反应的免疫凝集的抗体的杂交瘤的步骤；和步骤3)获得通过步骤2所选择的杂交瘤产生的抗体的步骤。
10.用于抑制由人1gM引起的非特异性反应的试剂，其包括根据权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体和/或根据权利要求4所述的来源于所述单克隆抗体的功能片段。
11.用于基于分析物和测试抗体或测试抗原之间的抗原-抗体反应来确定样品中分析物的量的免疫测定法，其中通过添加用于抑制由人1gM引起的非特异性反应的试剂而抑制由人IgM引起的不包括所述抗原_抗体反应的非特异性反应，所述试剂包括根据权利要求 1-3任一项所述的单克隆抗体和/或根据权利要求4所述的来源于所述单克隆抗体的功能片段。
12.根据权利要求11所述的免疫测定法，其中所述测试抗体或测试抗原被支持在不溶载体上。
13.根据权利要求12所述的免疫测定法，其中所述不溶载体包括胶乳、胶体金属或硅石。
14.免疫测定试剂和免疫测定试剂盒，其包括用于抑制由人IgM引起的非特异性反应的试剂，其包括根据权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体和/或根据权利要求4所述的来源于所述单克隆抗体的功能片段；和用于确定样品中分析物的量的测试抗体或测试抗原。
15.根据权利要求14所述的免疫测定试剂和免疫测定试剂盒，其中所述测试抗体或测试抗原被支持在不溶载体上。
16.根据权利要求15所述的免疫测定试剂和免疫测定试剂盒，其中所述不溶载体包括胶乳、胶体金属或硅石。
全文摘要
本发明的一个目的是提供一种抗-人IgM单克隆抗体和使用所述单克隆抗体的免疫测定法，所述抗-人IgM单克隆抗体能够特异性与人IgM反应，并且诱导基于与处于溶液中的人IgM的抗原-抗体反应的免疫凝集。本发明的另一个目的是提供抑制由人IgM引起的而不能通过常规方法防止的非特异性反应的试剂，和提供抑制由人IgM引起的非特异性反应的免疫测定法。通过基于在溶液中与人IgM的反应性的评估而选择与人IgM反应的单克隆抗体，已经获得了自身能够凝集人IgM和进行实际的免疫凝集测定法的新型单克隆抗体，因此实现了上述目的。
文档编号C07K16/42GK102159591SQ20098013300
公开日2011年8月17日 申请日期2009年9月3日 优先权日2008年9月5日
发明者中村靖, 清水知, 高桥弘至, 高桥由纪 申请人:积水医疗株式会社