专利名称：莪术醇单克隆抗体在含莪术醇类中药中的免疫分析应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及莪术醇单克隆抗体，及应用酶联免疫吸附分析法(ELISA)对中药中的莪术醇进行定性与定量分析。
背景技术：
单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。在农业科学、食品科学、环境保护、生态学及法医学等领域的应用也有很大的进展，亦可用于以单抗为弹头的“生物导弹”药物。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系；生产出针对复杂生物混合物中的特定分子的抗体，可用于分离、分析及纯化该特定分子抗原；其试剂可用于临床诊断和治疗。随着人们对单克隆抗体认识的深入，这一技术被逐渐应用到食品、转基因动物和植物、植物病毒学等方面，但在天然药物研究领域中的应用国内鲜有报道。以单克隆抗体为基础的酶联免疫分析法以其灵敏、精确、迅速和简便等特点，可用于天然产物活性成分的检识与含量测定，另外还可用于天然药物有效成分的分离与纯化、药物代谢动力学研究、质量监控、新药筛选以及扩大药用植物资源，对于天然药物的开发和利用、加速中医药现代化的进程有着重要的意义。目前日本、泰国、韩国已开展针对中药活性成分的免疫分析技术研究，根据免疫分析灵敏、快速、特异、简便等优点主要应用于大样本量的快速及在线检测；活性成分在植物体中含量低或前处理复杂样本；毒性成分的检出及分析；中药药代动力学研究等方面。且已制备出30多种单克隆抗体(如抗甘草酸、抗马兜铃酸I、抗人参皂苷Rgl、抗青蒿素、抗柴胡皂苷等的单克隆抗体)，日本已研制出商品化的甘草酸ELISA试剂盒。国内目前对于中药活性成分单克隆抗体的制备及应用研究较少，有制备出海洋硫酸多糖类药物(国家一类新药)的单克隆抗体，并建立了 ELISA检测方法，用于该药物药代动力学研究；薯蓣皂苷单克隆抗体制备，用于分析细胞培养获取薯蓣皂苷的在线监测；对灵芝多糖GLPLl免疫原进行优化并制备出其相应的单克隆抗体；用ELISA法分析柴胡药材的质量等几例报道。此外均是多克隆抗体的研究与应用报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种莪术醇单克隆抗体，将该抗体做为一抗，建立了莪术醇的ELISA法，采用ELISA法分析中药中莪术醇的有无与含量，为含有莪术醇类中药的质量评价提供一种新的方法。实现本发明目的的技术方案是
一、用现有技术制备莪术醇单克隆抗体，具体方法步骤如下
(I)制备免疫原莪术醇为天然小分子化合物，相对分子量236. 35，与牛血清白蛋白偶联成 Cur-BSA。(2)免疫本实验根据莪术醇的性质及注射免疫后小鼠的反应设计第I及第2次免疫剂量为50μ g/只，之后每次的免疫剂量为ΙΟΟμ g/只。首次免疫采用皮下多点接近淋巴结注射，第2次免疫起采用腹腔注射，注射时要小心操作，针头切勿刺破内脏，避免造成污染，每次免疫间隔2周，共免疫4次。(3)筛选每次免疫后4天眼球采血分离血清，用直接或竞争的酶联免疫吸附法(ELISA)，检测莪术醇血清抗体效价。若效价高于104，即可用于细胞融合。(4)骨髓瘤细胞的选择选择处于对数生长期、细胞形态佳和活性大于95%的细胞作为融合细胞。(5)细胞融合超强免疫后第4天，眼球采 血分离阳性血清，并处死小鼠，无菌取免疫鼠脾脏，分离脾细胞，与SP2 / O小鼠骨髓瘤细按5 :1数量融合。(6)阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆融合细胞以HAT选择培养系统培养，10天后，ELISA直接法检测上清液抗体水平吸收值(OD)大于阴性对照组值2. I倍以上者；且以Cur-HSA和HSA包被96孔酶标板，两者相互对照，Cur-HSA包被板为阳性、HSA包被板的相应孔为阴性者，为阳性孔。对阳性孔用有限稀释法作单克隆化，多次克隆后检测值都为高阳性且镜下观察细胞克隆状态良好者，即为筛选出的单克隆株。(7)腹水制备抗体及纯化BAL B/C小鼠体内诱生腹水，用Protein-G蛋白分离柱收集纯化腹水。(8)将收集的腹水，用I mol的Tris溶液将腹水的PH值调至7. 0，然后通过蛋白分离柱，用10 mmol (PH 7. O)的磷酸盐缓冲液清洗柱子，被吸附的抗体用100 mmol (PH3. 0)的柠檬酸盐缓冲液洗脱下来，再用IM的Tris溶液中和，以PH7. 4的PBS对冲透析三次，最后冻干即成。二、应用莪术醇单克隆抗体，采取ELISA法分析中药中莪术醇，包括如下步骤
(I)供试品的制备采用挥发油提取器提取挥发油，所得挥发油以无水硫酸钠除去水
分，以乙醚定容，做供试品。(2)标准曲线的绘制莪术醇标准品用20%甲醇做系列浓度稀释，以莪术醇单克隆抗体为一抗，进行竞争ELISA反应，405nm测定OD值，以莪术醇标准品浓度-A4tl5 做标准曲线。(3) ELISA法用pH 9.6的PBS将Cur-HSA配制为浓度为I μ g/ml的溶液，以100 μ I/孔包被96孔免疫板，37°C孵育Ih;用含5%脱脂奶粉的PBS溶液于37°C封闭2h:加入I 6400倍稀释的莪术醇单抗(用PBS稀释)100 μ I/孔，再加入供试品100μ I/孔，37°C孵育I h，加入羊抗鼠酶标抗体(I 1000稀释)100 μ I/孔，37°C孵育I h，加ABTS显色液，100 μ I/孔，于37°C反应15 min，用酶标仪读出各孔在波长405 nm处的吸光度值(A4tl5J。空白对照为PBS，每一浓度的供试品设置3个平行孔。本发明的优点是制备出的单克隆抗体可用于莪术醇的定性与定量分析，另外还可用于莪术醇活性成分的分离与纯化、药物代谢动力学研究、质量监控、新药筛选以及扩大药用植物资源，对于莪术类药材的开发和利用、加速中医药现代化的进程有着重要的意义。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不是对本发明内容的限定。实施例I.材料 BALB/C纯系小鼠，雌性，4周龄(由桂林医学院动物实验中心提供)。SP2/O骨髓瘤细胞株(购自中科院上海细胞库)、RPMI1640培养基、新生牛血清、次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶(HAT)、次黄嘌呤-胸腺嘧啶(HT)、聚乙二醇(PEG4000)(全部购自SIGMA公司)，人工抗原(cur-BSA)是有本实验室自行合成的，该技术已经获得国家专利(专利号200910114452. I),鼠二抗购自上海博奥森生物技术公司，预染的蛋白质Marker (购自碧云天生物技术公司)。试剂的配制① PBS (称取 Nacl:8g，Na2HPO4:1. 15g, KH2PO4:0. 24g, Kcl :0. 2g,加入1000ml去离子水即得)②PH9. 6的碳酸盐缓冲液O. ImoI/L(Na2CO3 · IOH2O 8. 58g，NaHCO3 5. 8g,溶于去离子水中至1000ml)③O. 05%的T-PBS (2000mlPBS,加入Iml的吐温，磁珠搅拌混勻)
④5%的脱脂奶粉(IOOml的PBS加入5g的脱脂奶粉)⑤柠檬酸盐缓冲液的配制含过氧化氢(柠檬酸三钠25. 8g,柠檬酸一水合物21. 0g，溶于500ml去离子水中，过氧化氢IOOul)⑥ABTS原液(120mgABTS加入20ml去离子水，即为6mg/ml)⑦ABTS染色剂的配制(ABTS原液O. 5ml,含过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液5ml，去离子水4. 5ml)
3方法步骤
3. I莪术醇单克隆抗体的制备
3.1.1免疫原制备以莪术醇为原料，利用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯(Cur-HS)，得到人工半抗原，用MS质谱和13C-NMR谱测定半抗原的结构；将莪术醇的半抗原制备成吡啶水溶液，然后使之与牛血清蛋白结合，制备莪术醇的人工抗原即Cur-HS-BSA，用MALDI-TOF-MS鉴定莪术醇人工抗原(具体操作详见发明专利“一种莪术醇半抗原和人工抗原及其制备方法”，专利号200910114452. I)
3. I. 2免疫本实验根据莪术醇的性质及注射免疫后小鼠的反应设计第I及第2次免疫剂量为50μ g/只，之后每次的免疫剂量为ΙΟΟμ g/只。首次免疫采用皮下多点接近淋巴结注射，第2次免疫起采用腹腔注射，注射时要小心操作，针头切勿刺破内脏，避免造成污染。筛选分别用HSA-cur和HAS包被酶标板(浓度均为lug/ml )，各包被一半的酶标板上的孔，每孔lOOul，37°C孵育lh，弃掉包被液，用T-PBS洗三遍，用5%的脱脂奶粉包被酶标板，每孔300ul，37°C孵育lh，弃掉脱脂奶粉，用T-PBS洗三遍，加入包被孔稀释小鼠血清或杂交瘤细胞培养上清lOOul，37°C孵育lh，弃掉稀释血清或上清，用T-PBS洗三遍，加入用T-PBS稀释的1000:1的鼠二抗，37°C孵育lh，弃掉鼠二抗，加入ABTS染色剂，37°C孵育25min,以T-PBS或骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照。骨髓瘤细胞的选择采用骨髓瘤细胞株SP2/0，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，且生长及融合效率均佳。细胞的最高生长刻度为9X105/mL，倍增时间通常为10 15h。处于相似分裂期的两个亲代细胞易于融合，所以选择处于对数生长期(细胞数为IO4 106，此时细胞浑圆透亮、大小均一、边缘清晰、排列整齐、呈半致密分布)、细胞形态佳和活性大于95%的细胞作为融合细胞。在准备融合前的两周开始复苏SP2/0，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3-6月应用8-AG(8-氮-鸟嘌呤)筛选一次，防止细胞的突变。在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为9X105/mL，次日一般即为对数生长期细胞。细胞融合融合过程均在无菌条件下进行。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇(PEG100(T4000)是目前最常用的细胞融合剂，其溶液在PH6. O时细胞融合率最高。本实验融合时所用PEG2000浓度为50% (W/V)，此浓度能够产生最多的杂交细胞。实验过程中时注意控制滴加PGE的时间(Imin)及方式，利于细胞在质膜之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合。阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆在小鼠免疫中，应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇，小鼠在受抗原刺激后产生的免疫应答，实质是众多B细胞群的抗体分泌。而针对目标抗原表位的B细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程，在已融合的细胞中，有相当比例的非目的细胞的融合体，需筛选除去。筛选过程一般分为融合细胞的抗体筛选和特异性抗体筛选两步进行。将融合的细胞充分稀释，使分配到细胞培养板的每一孔中的细胞数在O至数个细胞之间，培养后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞这一过程常被习惯地称作克隆化。本实验应用特异性抗原(Cur-HAS)包被的ELISA找出针对目标抗原(Cur)的抗体阳性细胞株，将这些阳性细胞重复克隆3次后，细胞培养板中阳性率为100%，且细胞生长良好，稳定分泌特异性抗体，符合建株要求。
腹水制备抗体及纯化杂交瘤腹腔注射前一周给8周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射石蜡油，每只O. 5 mL，诱导产生腹水。10 d后收集腹水，离心得到小鼠腹水。腹水用Protein-G蛋白分离柱纯化，将收集的腹水，用I mol的Tris溶液将腹水的PH值调至7. 0，然后通过蛋白分离柱，用10 mmol (PH 7. O)的磷酸盐缓冲液清洗柱子，被吸附的抗体用100mmol (PH3. O)的柠檬酸盐缓冲液洗脱下来，再用IM的Tris溶液中和，以PH7. 4的PBS对冲透析三次，最后冻干。应用ELISA法分析中药中莪术醇
3. 2. I供试品的制备精密称取药材50. 00g，置1000ml圆底烧瓶中，加水400ml及数粒玻璃珠，均匀，浸泡2 h，连接挥发油测定器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分并溢流入烧瓶为止，置加热套中，设定加热温度为130-140°C，缓缓加热至微沸7 h，冷却2 h，开启挥发油测定器下端活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度O线上面5 mm处为止。所得挥发油用无水硫酸钠除去水分，以乙醚定容至100ml，取0.1ml定容至IOmL容量瓶中，做供试品。标准曲线的绘制莪术醇标准品用20%甲醇做系列浓度稀释，以莪术醇单克隆抗体为一抗，进行竞争ELISA反应，405nm测定OD值，以莪术醇标准品浓度-A4tl5 做标准曲线。其回归方程为 Y= — I. 1754 1ηΧ+1. 7581，R2=O. 9619。法用pH 9. 6的PBS将Cur-HSA配制为浓度为I μ g/ml的溶液，以100 μ I/孔包被96孔免疫板，37°C孵育Ih;用含5%脱脂奶粉的PBS溶液于37°C封闭2 h:加入I : 6400倍稀释的莪术醇单抗(用PBS稀释)100μ I/孔，再加入供试品100μ I/孔，37°C孵育I h，加入羊抗鼠酶标抗体(I 1000稀释)100 μ I/孔，37°C孵育I h，加ABTS显色液，100 μ I/孔，于37°C反应15 min，用酶标仪读出各孔在波长405 nm处的吸光度值(A4tl5 J。空白对照为PBS，每一浓度的供试品设置3个平行孔。莪术醇ELISA法的方法学考察
方法学考察显示该方法的重现性(9. 02%)、精密度(< 9%)、加样回收率(10. 01%)、板间 10%)板内(< 10%)差异程度符合免疫分析要求，最低检测限为78ng/mL。以该法测定广西莪术、温莪术、含莪术醇的生物样本，其检测结果如表I，与气相色谱分析结果无显著差巳表I ELISA法与GC-MS法的结果比较
权利要求
1.莪术醇单克隆抗体在含莪术醇类中药中的免疫分析应用，其特征是以莪术醇单克隆抗体为一抗，采用酶联免疫吸附分析法对莪术醇进行的定性与定量分析，具体包括如下步骤 (1)供试品的制备采用挥发油提取器提取挥发油，所得挥发油以无水硫酸钠除去水分，以乙醚定容，做供试品； (2)标准曲线的绘制莪术醇标准品用20%甲醇做系列浓度稀释，以莪术醇单克隆抗体为一抗，进行竞争ELISA反应，405nm测定OD值，以莪术醇标准品浓度-A4tl5 做标准曲线； (3)ELISA法用pH9. 6的PBS将Cur-HSA配制为浓度为I y g/ml的溶液，以100 U I/孔包被96孔免疫板，37°C孵育Ih;用含5%脱脂奶粉的PBS溶液于37°C封闭2 h :加入I 6400倍稀释的莪术醇单抗(用PBS稀释)100 iil/孔，再加入供试品100 iil/孔，37°C孵育I h，加入羊抗鼠酶标抗体(I 1000稀释UOOiU/孔，37°C孵育I h，加ABTS显色液，100 u I/孔，于37V反应15 min，用酶标仪读出各孔在波长405 nm处的吸光度值(A4M J，空白对照为PBS，每一浓度的供试品设置3个平行孔。
全文摘要
本发明涉及一种莪术醇单克隆抗体在含莪术醇类中药中的免疫分析应用，其方法为应用杂交瘤技术制备出天然小分子化合物莪术醇的单克隆抗体，再以莪术醇单克隆抗体为一抗，采用酶联免疫吸附分析法(ELISA法)对莪术醇进行的定性与定量分析。本发明的优点是灵敏度高、特异性好、样本前处理简单、检验批次大、操作简便，适于大批量检验及在线监测。
文档编号G01N21/31GK102759625SQ201210260609
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月26日 优先权日2012年7月26日
发明者付明磊, 刁珂, 曾建红, 王娟, 陈旭, 黄凤香 申请人:桂林医学院