专利名称：一种莪术醇半抗原和人工抗原及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种莪术醇半抗原、人工抗原及其制备方法，属于免疫学技术领域。
背景技术：
免疫分析是一种基于抗原抗体抗原抗体特异性识别和结合反应的分析方法，不仅可用于测 定蛋白质、酶等大分子物质，而且还广泛用于测定小分子量的药物，特别适用于那些色谱法 难以分析的药物，该法已成为药物分析中一种必不可少的基本检测技术。免疫分析不仅为临 床诊断提供了依据，在内分泌学、病毒学、药理学、血液学及肿瘤学等研究方面得以应用， 而且在农业科学、食品科学、环境保护、生态学及法医学等领域的应用也有所进展。免疫分 析具有检测灵敏度高、特异性强、前处理简单、反应速度快、检测费用低廉，适于现场监控
和大批量样品分析的特点。
莪术醇(curcumol)又名姜黄环奥醇，姜黄醇，属萜类化合物，是莪术挥发油中的重要成分。 具有抗癌、抗早孕、抗病毒、抗突变、保肝、活血化瘀等药理作用。特别是在免疫分析检测 方面具有独特作用，但莪术醇为小分子天然化合物，相对分子质量较小，仅具有反应原性，
而不具有免疫原性，因此不能直接采用免疫方法检测，需要与大分子蛋白等偶联形成复合物 后才能成为完全抗原。但是小分子化合物必须具有或衍生出能与载体进行交联反应的功能基 团(如氨基，羧基，重氮基等)，对于含羟基的半抗原需要将其羟基衍生为羧基再与蛋白质载 体交联合成人工抗原。根据莪术醇结构中存在C6羟基的特点，先将莪术醇的羟基衍生为羧基， 然后再与大分子蛋白偶联形成复合物，从而成为完全抗原才行。
发明内容
本发明的目的是提供一种莪术醇半抗原和人工抗原；
本发明的另一个目的是要提供上述莪术醇半抗原和人工抗原的制备方法，所制备出的产品 用于含有莪术醇的中草药的免疫方法研究，其制备方法合成步骤简单，实验条件温和，产物 容易得到，且产率较高。
实现本发明的技术方案是 一种莪术醇半抗原和人工抗原的制备方法，以莪术醇为原料， 利用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯(Cur-HS)，得到莪术醇人工半抗原，用MS 质谱和130NMR谱测定半抗原的结构；将莪术醇半抗原制备成吡啶水溶液，然后使之与牛血清 蛋白结合，制得莪术醇人工抗原，即Cur-HS-BSA，用MALDI-T0F-MS鉴定莪术醇人工抗原； 其反应方程式为
(1)莪术醇琥珀酸单酯(Cur,HS)
莪术醇 丁二酸酐 莪术醇琥珀酸单酉i莪术醇琥珀酸单酯 牛血清蛋白 莪术醇人工抗原本发明所述莪术醇半抗原的制备方法步骤如下1、 取三氯甲烷置于反应瓶，加入少量无水MgS04，搅拌过夜，滤去MgS04;2、 取上述滤液，加入莪术醇和丁二酸酐，搅拌溶解，加入适量的4-甲基氨基吡啶，于65 'C回流，TLC检测反应进度，反应结束，冷却；3、 将反应物倾入冰水中，用乙醚萃取，合并有机相，回收有机溶剂，得莪术醇半抗原粗D叩54、 用石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，得到纯度较高的莪术醇丁二酯油状物，此即为莪 术醇半抗原莪术醇琥珀酸单酯，置4'C冰箱保存；所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为8 : 1。将上述所得产品用MS质谱和13C-NMR谱测定其结构，从Cur-HS的MS (APCI) m/z:337.14(M—)，推出其分子量为336，初步认为Cur-HS为合成的目标产物；再分别测定出 原莪术醇、Cur-HS的13C-NMR谱，比较两者13C-醒R谱的不同，发现产物多出S 172. 48， 169. 15， 30. 2， 29.13，共四条谱线，其中S 169.15为莪术醇成丁二酸单酯后酯羰基碳原子，S 172. 48 为莪术醇成丁二酸单酯链羧基羰基碳原子，而S 29. 13， 5 30. 2为丁二酸单酯链中2个亚甲 基碳原子。结合MS的数据，对原料莪术醇和和合成出的产物碳谱的化学位移数据的差异分析 表明，从而确定合成出的产物就是所需要的目标产物Cur-HS。本发明所述莪术醇人工抗原的制备方法步骤如下1、 称取莪术醇琥珀酸单酯，加入吡啶和H20，搅拌溶解，所加入的吡啶与H20的体积比为 1 二 1;2、 称取BSA，加入PH8. 0的碳酸氢钠缓冲液，搅拌溶解，加入l-乙基-3 (3-二甲基氨基 丙基)碳二亚胺(EDC)，将莪术醇丁二酸单脂的吡啶水溶液加入前反应液中，于室温反应15 小时；3、 将其反应物装入透析袋，用纯净水于4'C透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷 冻干燥，得莪术醇人工抗原Cur-HS-BSA，于-2(TC下保存。将上述所得产品用MALDI-TOF-MS进行鉴定，其鉴定方法是(1)先配置基质辅助溶液将O. 15%三氟醋酸(TFA) 666ul加入到乙腈(CH3CN) 333ul 中，取lOmg芥子酸加入到前配的O. 15y。TFA-CH3CN混合液lul，超声波10-15min后溶解，备 用；(2) 供试品处理取Cur-HS-BSA，溶解在8mol/L的尿素溶液中，然后将其稀释成浓度 在l-10pmol/L;另称取BSA0.5mg溶于水100ul，配置成5mg/ml的BSA水溶液。(3) MALDI-T0F-MS测定各取供试品和基质辅助溶液lul，充分混匀，吸取混合液lul 滴加在镀金样品板上，室温下晾干后，送入质谱仪分析。结合比=(偶联物相对分子质量-蛋白质相对分子质量)/莪术醇相对分子质量 结合比=(73302.3-66713.4) /336. 42=19. 6。根据MALDI-T0F-MS图谱，可以清晰的判断出Cur-HS与BSA偶联形成了新的复合物，改 复合物的相对分子质量约为73302;对比BSA的相对分子质量66731以及Cur-HS的相对分 子质量336，可以求出Cur-HS-BSA的结合比19.6，本试验中人工合成的半抗原-蛋白复合物 Cur-HS-BSA的结合数值较大，每个载体蛋白分子平均与19.6个半抗原分子结合，说明半抗 原与载体的偶联情况良好，这为后续的抗莪术醇抗体的制备提供了可靠的实验基础。本发明的有益效果本发明合成了莪术醇的半抗原和人工抗原，所制备的产品可用于含莪 术醇成分样品的研究，合成步骤简单，所需的实验条件温和，在常温下就能进行，产物容易 得到，且产率较高，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便，可以满 足国内外对其研究的需要。
图1为莪术醇13C-NMR图2为莪术醇琥珀酸单酯(Cur.-HS) 13C-NMR 图3为莪术醇琥珀酸单酯(Cur.-HS) MS (APCI) 图4为牛血清蛋白(BSA)的MALDI-TOF-MS谱图 图5为莪术醇人工抗原(Cur-HS-BSA)的MALDI-TOF-MS谱图具体实施方式
实施例1一种莪术醇人工半抗原的制备方法按如下步骤进行(1) 称取莪术醇0.1170g (即0.495函o1)与丁二酸酐0.12g (即1.2mmol);(2) 取10ml三氯甲烷置于反应瓶，加入少量无水MgS04,搅拌过夜，滤去MgS04;(3) 取上述滤液，将称好的莪术醇与丁二酸酐加入到滤液中，搅拌溶解，加入适量的4-甲基氨基吡啶，于65"回流，TLC检测反应进度，反应结束，冷却；(4) 将反应物倾入冰水中，用乙醚萃取，合并有机相，回收有机溶剂，得莪术醇半抗原 粗品；(5) 用石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，得到纯度较高的莪术醇丁二酯油状物O. 1450g， 产率87%，此即为莪术醇半抗原莪术醇琥珀酸单酯0.431mmo1，置4'C冰箱保存，石油醚-乙 酸乙酯的体积比为8:1。实施例2(1) 称取莪术醇0.234g (即0.99mmoD与丁二酸酐0.24g (即2.4mmol);(2) 取20ml三氯甲烷置于反应瓶，加入少量无水MgS04,搅拌过夜，滤去MgS04;(3) 取上述滤液，将称好的莪术醇与丁二酸酐加入到滤液中，搅拌溶解，加入适量的4-甲基氨基吡啶，于65'C回流，TLC检测反应进度，反应结束，冷却；(4) 将反应物倾入冰水中，用乙醚萃取，合并有机相，回收有机溶剂，得莪术醇半抗原粗品；(5) 用石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，得到纯度较高的莪术醇丁二酯油状物0. 29g， 产率87%，此即为莪术醇半抗原莪术醇琥珀酸单酯0.862mmo1，置4'C冰箱保存，石油醚-乙 酸乙酯的体积比为8 : 1。实施例3一种莪术醇人工抗原的制备方法按如下步骤进行(1) 称取4. 15mg(12.3Xl(Tmo1)莪术醇琥珀酸单酯，加吡啶与水的混合液250ul (二者 体积比为h l),搅拌溶解；(2) 称取BSA2.8mg (4. 2X 10—5mmol),加入PH8. 0的碳酸氢钠缓冲液250ul，搅拌溶解， 加入l-乙基-3 (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)4.7mg(24.6X10-6mol)，将莪术醇丁二酸 单脂的吡啶水溶液加入前反应液中，于室温反应15小时；(3) 将其反应物装入透析袋，用纯净水于4'C透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷 冻干燥，得1. 60mg莪术醇人工抗原Cur-HS-BSA，产率52%，于-20'C下保存。实施例4(1) 称取8.3mg(24.6Xl(Tmo1)莪术醇琥珀酸单酯，加吡啶与水的混合液250ul(二者体 积比为l: l)，搅拌溶解；(2) 称取BSA5.6mg (8. 4X l(T誦ol)，加入PH8. 0的碳酸氢钠缓冲液250ul，搅拌溶解， 加入l-乙基-3 (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)9.4mg(49.2X10-6mol)，将莪术醇丁二酸 单脂的吡啶水溶液加入前反应液中，于室温反应15小时；(3) 将其反应物装入透析袋，用纯净水于4'C透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷 冻干燥，得3. 2mg莪术醇人工抗原Cur-HS-BSA,产率52%，于-2(TC下保存。权利要求
1、一种莪术醇半抗原，其特征在于它以莪术醇为原料，应用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯制得，其分子结构式为
2、 一种莪术醇半抗原的制备方法，其特征在于该方法步骤如下(1) 取三氯甲垸置于反应瓶，加入少量无水MgS04，搅拌过夜，滤去MgS04;(2) 取上述滤液，加入莪术醇和丁二酸酐，搅拌溶解，加入适量的4-甲基氨基吡啶，于65'C回流，TLC检测反应进度，反应结束，冷却;(3) 将反应物倾入冰水中，用乙醚萃取，合并有机相，回收有机溶剂，得莪术醇半抗原粗品；(4) 用石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，得到莪术醇丁二酯油状物，此即为莪术醇半抗原，置4'C冰箱保存，所述的石油醚与乙酸乙酯的体积比为8 : 1。
3、 一种莪术醇人工抗原，其特征在于它以莪术醇为原料，应用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯制得莪术醇人工半抗原，用MS质谱和13C_NMR谱测定半抗原的结构，再将莪术醇半抗原制备成吡啶水溶液，然后再与牛血清蛋白结合制成，其分子结构式为<formula>formula see original document page 2</formula>
4、 一种莪术醇人工抗原的制备方法，其特征在于该方法步骤如下(1) 称取莪术醇琥珀酸单酯，加入吡啶和H20，搅拌溶解，所加入的吡啶H20的体积比为l:l;(2) 称取BSA,加入碳酸氢钠缓冲液，搅拌溶解，加入1-乙基-3 (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺,将莪术醇丁二酸单脂的吡啶水溶液加入前反应液中，于室温反应15小时；(3) 将其反应物装入透析袋，用纯净水于4'C透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得Cur-HS-BSA，于-20'C下保存。
全文摘要
本发明提供了一种莪术醇半抗原和人工抗原及其制备方法，所制备的莪术醇半抗原的结构式为右式(Ⅰ)，人工抗原的结构式为右式(Ⅱ)，其制备方法为本发明以莪术醇为原料，利用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯(Cur-HS)，得到人工半抗原，将莪术醇的半抗原制备成吡啶水溶液，然后使之与牛血清蛋白结合，制备出莪术醇的人工抗原。本发明合成了莪术醇的半抗原和人工抗原，所制备的产品可用于含莪术醇成分样品的研究，合成步骤简单，所需的实验条件温和，在常温下就能进行，产物容易得到，且产率较高，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便，可以满足国内外对其研究的需要。
文档编号C07K14/435GK101671345SQ20091011445
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者付明磊, 平 戴, 曾建红, 杨新平, 娟 王, 旭 陈, 黄凤香 申请人:桂林医学院