沙丁胺醇半抗原和抗原的制备方法及其在量子点免疫荧光试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种半抗原、抗原及其制备方法和应用，具体涉及一种沙丁胺醇半抗 原和抗原的制备方法及其在量子点免疫荧光试剂盒中的应用，用于检测动物组织和尿液中 的沙丁胺醇残留量，属于免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 沙丁胺醇（SAL)为选择性β2受体激动剂，临床医学上主要用于治疗喘息型支气 管炎、支气管哮喘、肺气肿所致的支气管痉挛。同时，沙丁胺醇还有促进动物骨骼肌生长，减 少脂肪蓄积、提高饲料转化率等作用，常被不法商家用作饲料添加剂。人食用了含沙丁胺醇 残留的动物性食品，会出现肌肉震颤、心悸、过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、呼吸困难等症状。 现在欧美各国均禁止其在畜牧生产上的应用，美国规定只能把它用于科研，我国农业部235 公告也明确规定沙丁胺醇及其盐、酯为禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出。
[0003]目前检测沙丁胺醇的方法主要有高效液相色谱法（HPLC)、气相色谱-质谱法 (GC-MS)、液相色谱-质谱法（LC-MS)等，但这些方法都不同程度地存在着样品前处理繁琐， 对仪器设备以及操作过程的要求较高等缺点，不适于生产、基层单位及现场检测。
[0004] 量子点免疫荧光检测方法具有特异性强、稳定快速、操作简单、自动化程度高等优 点，其检测限比ELISA和理化检测方法高几个数量级。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种沙丁胺醇半抗原和抗原的制备方法及其在量子点免疫 荧光试剂盒中的应用。
[0006] 本发明提供的沙丁胺醇半抗原，为式（I)所示的化合物；
本发明还公开了式I所示化合物的制备方法，包括如下步骤： A:中间体sal-Ι合成：250ml三口瓶中加入2-溴-l-[4-羟基-3-(羟甲基）苯基] 乙-1-酮lOOOmg，二氯甲烷200ml，对甲苯磺酸3. 8mg，冰浴降温至0-5度，滴加2, 2甲氧基丙 烷2208ul，室温反应过夜，TLC检测反应完全后处理，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机相，无 水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得类白色固体1211mg(sal-l) ;B:中间体sal-2合成：100ml 三口瓶中加入中间体sal-1, 1140mg，无水甲醇40ml，冰浴降温至0度，加入硼氢化钠227mg， 0-5度反应2小时，TLC检测反应完全后处理，反应液倾倒入冰水中，二氯甲烷萃取，饱和氯 化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得类白色固体l〇18mg(sal-2); C:中间体sal-3合成：100ml三口瓶中加入中间体sal-2,lOOOmg，无水甲醇40ml，冰浴降温 至〇度，加无水碳酸钾1396mg，室温反应2小时，TLC检测反应完全后处理，过滤，5ml甲醇洗 涤滤饼，滤液减压浓缩得油状物体700mg(sal-3);D:中间体sal-4合成：100ml三口瓶中加 入中间体sal-3, 700mg，无水甲醇40ml，加三乙胺686mg，6_氨基-6-甲基-1-庚酸540mg， 回流反应12小时，TLC检测反应完全后处理，减压蒸除甲醇，二氯甲烷溶解残留物，水洗，饱 和氯化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得油状物1008mg(sal-4); E:半抗原sal-5合成：100ml三口瓶中加入中间体sal-4,lOOOmg，无水甲醇40ml，冰浴降温 至0-5度，滴加1M硫酸10ml室温反应2小时，TLC检测反应完全后处理，减压蒸除甲醇，降 温至10度析出白色固体，过滤，少量水洗涤滤饼，干燥后得白色固体600mg(sal-5)。
[0007] 本发明提供的沙丁胺醇抗原，是将式I所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联 物。
[0008] 常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（0VA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲状腺蛋白（TG)或血蓝蛋白（KLH)等。
[0009] 所述式I所示化合物与BSA偶联得到的沙丁胺醇抗原的结构见式II:
本发明还公开了所述沙丁胺醇抗原的制备方法，包括如下步骤： ① 称取7. 3mg半抗原溶于2mlDMF，加入EDC4. 3mg，NHS5. 2mg，室温搅拌反应2h; ② 取50mgBSA溶于5ml0· 1M碳酸钠缓冲液； ③ 将步骤1得到的半抗原溶液逐滴加入到步骤2得到的蛋白溶液中，室温搅拌反应 24h，PBS4度透析72小时，期间换透析液6次；将透析液在无菌条件下过0. 22μm孔径的 滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。
[0010] 所述沙丁胺醇抗原可以作为免疫原制备沙丁胺醇特异性抗体，也可以作为包被原 制备微孔板。
[0011] 应用沙丁胺醇抗原制备得到的特异性抗体具体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0012] 所述沙丁胺醇抗原、所述特异性抗体均可应用于检测沙丁胺醇。
[0013] 本发明还保护一种用于检测沙丁胺醇的量子点免疫荧光试剂盒，包括量子点标记 的所述抗体。
[0014]"量子点标记的所述抗体"的制备方法具体如下： ① 取2. 5mg量子点，用pH4. 7、0. 1M的MES缓冲液洗涤，然后用lmlpH4. 7、0. 1M的MES 缓冲液重悬，加入〇· 96mgEDC和1. 15mgNHS，37°C反应30分钟，20000rpm离心5min，收集 沉淀，即为活化后的量子点； ② 取步骤①得到的活化后的量子点，用pH8. 5、50mM的硼砂缓冲液洗涤，然后将2. 5mg 活化后量子点、所述抗体(蛋白质含量为〇. 15mg)和pH8. 5、50mM的硼砂缓冲液混匀（总体积 为0· 8ml)，25°C反应3. 5小时； ③ 取完成步骤②的液相，加入BSA并使其质量百分含量为5 %，3 7 °C反应3 0分钟， 20000rpm离心5min，收集沉淀，用pH7. 4、0. 02M的PBS缓冲液洗涤，用lmlpH7. 4、0. 02M的 PBS缓冲液重悬； ④取步骤③得到的液相，用pH7. 4、0. 02M的PBS缓冲液稀释至150000倍体积。
[0015] 所述量子点荧光免疫试剂盒，包括：包被有沙丁胺醇抗原的微孔板、抗体工作液、 沙丁胺醇标准溶液、稀释液、浓缩洗涤液等。
[0016]本发明还保护以上所述试剂盒在检测待测样本中是否含有沙丁胺醇中的应用。
[0017]本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目 标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物 的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样品中微量小分子目标分 析物。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术 中对沙丁胺醇样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到 精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的沙丁胺醇抗原，通过免疫动物可 产生了针对沙丁胺醇的特异性抗体，用于快速检测食品中的沙丁胺醇残留，具有操作简单、 快速，处理样品量大，灵敏度高，特异性强等诸多优点。
[0018]
【附图说明】
[0019] 图1为量子点的扫描图。
[0020] 图2为沙丁胺醇量子点免疫荧光试剂盒标准曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值。实施例1中的搅拌都是采用磁力搅拌器进行的，所用的试验材料，如无特殊说 明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0022] 沙丁胺醇的结构式如下：
[0023] 实施例1、免疫原和包被原的制备 一、半抗原的制备 1、中间体sal-Ι合成：250ml三口瓶中加入2-溴-l-[4-羟基-3-(羟甲基）苯基] 乙-1-酮lOOOmg，二氯甲烷200ml，对甲苯磺酸3. 8mg，冰浴降温至0-5度，滴加2, 2甲氧基 丙烷2208ul，室温反应过夜，TLC检测反应完全后处理，饱和碳酸氢