一种沙丁胺醇半抗原衍生物、沙丁胺醇人工抗原及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化工生物检测技术领域，具体地，涉及一种沙丁胺醇半抗原衍生 物、沙丁胺醇人工抗原及其合成方法和在荧光免疫层析法检测沙丁胺醇中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着社会的发展和进步，人们生活水平不断地提高，对健康饮食越来越重视。食品 安全问题，特别是食品中的兽药残留问题越来越引起人们的高度重视。要提高禽畜产品的 安全，除了严格控制和有效的管理之外，对添加剂以及兽药等有毒化学物质残留的监控是 至关重要的，因此，科学准确的兽药残留检测方法是动物源食品安全与否的重要保障。
[0003] 沙丁胺醇（salbutamol，Sal)，又名咳喘宁，是一种β -肾上腺素受体激动剂，临床 上广泛用于治疗支气管哮喘。同时，沙丁胺醇有促进蛋白质合成、增加动物胴体瘦肉率，营 养再分配、提高饲料转化率的作用，常被非法作为饲料添加剂用于畜产品的生产，但是其残 留对人类健康存在潜在危害。欧盟、美国、中国等国家和地区都先后立法禁止在畜禽生产中 使用促动物生长的β_兴奋剂作为饲料添加剂。由于沙丁胺醇检测手段研究的相对滞后， 而又与克仑特罗具有同样的促生长效果，正逐步取代克仑特罗，成为不法分子谋取经济利 益的新手段。因此，建立快速、简单、方便、有效的检测SAL的方法，对确保食品安全具有重 要意义。
[0004] 目前，国家标准和行业标准中对饲料及动物源性食品中沙丁胺醇残留的检测常采 用HPLC和GC - MS法。虽然此方法特异性强、灵敏度高、精确，但是样本前处理操作步骤繁 琐，成本高，再加上设备昂贵、花费大、操作技能要求高等原因而不适合大批量样品的筛选 检测。免疫分析法(如酶联免疫法、胶体金法以及荧光免疫层析发)，由于在抗原抗体的定性 定量方面独特的优势和操作简便分析样本大等优点弥补了理化分析的不足，在β -兴奋剂 的残留检测中起着越来越重要的作用。酶联免疫吸附测定法可同时检测多个样品，具有灵 敏、特异性强等优点，但是不适用于现场检测。胶体金法和荧光免疫层析法操作简单、快速、 无需大型检测仪器设备，更适用于现场及时检测，是快速检测发展的趋势。
[0005] 影响免疫分析法检测质量的根本原因是抗体的特异性与亲和性，这些性质又取决 于免疫半抗原的分子结构，所以免疫半抗原分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分 子药物残留快速检测技术最关键的步骤。
[0006] CN102617516A (2012-8-1)公开了一种沙丁胺醇人工抗原及其制备的抗体，然而该 方法中所用的免疫半抗原的分子结构和人工抗原制备仍有待改进。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一是提供一种沙丁胺醇半抗原衍生物。
[0008] 本发明的目的之二是提供一种所述沙丁胺醇半抗原衍生物的制备方法。
[0009] 本发明的目的之三是提供一种沙丁胺醇人工抗原。
[0010] 本发明的目的之四是提供一种所述沙丁胺醇人工抗原的制备方法。
[0011] 本发明的目的之五是提供一种所述沙丁胺醇人工抗原在荧光免疫层析法检测沙 丁胺醇中的应用。
[0012] 本发明提供了一种沙丁胺醇半抗原衍生化合物，其化学结构式为：
【主权项】
1. 一种沙丁胺醇半抗原衍生物，其特征在于：所述沙丁胺醇半抗原衍生物适用于制备 沙丁胺醇人工抗原，所述沙丁胺醇半抗原衍生物的化学结构式为：
2. -种如权利要求1所述沙丁胺醇半抗原衍生物的制备方法，其特征在于：以化合物 2-溴-1-[4-轻基-3-(轻甲基）苯基]-乙-1-酮为原料，通过两步反应制备，其制备路径 为：
3. -种如权利要求1所述沙丁胺醇半抗原衍生物的制备方法，其特征在于：所述反应 条件具体为： S1?称取化合物2-溴-l-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]-乙-1-酮0.015-0.0028mol， 加入饱和甲醇钠作为溶剂，在冰水浴条件下加入0. 01-0. 03mol的4-氨基-4甲基-戊酸后， 常温反应l_2h，结晶、过滤、洗涤干燥得到第一白色固体4 -{[2-(4_羟基-3 -(羟甲基)苯 基）-2 _氧代乙基]氨基}-4-甲基戊酸； S2.将S1中得到的白色固体0? 001-0. 003mol溶于20ml乙醇中，依次加入 0? 001-0. 003mol95-98wt% 的KBH4 和 0? 001-0. 003molZnC12,常温反应 12-18h后，过滤；滤 液浓缩，异丙醇洗涤，得到第二白色固体特异性沙丁胺醇半抗原衍生物。
4. 一种由权利要求1所述沙丁胺醇半抗原衍生物制备得到的沙丁胺醇人工抗原，其特 征在于：所述沙丁胺醇AT按后仆受结构才士 ?
所述protein即载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5. -种如权利要求3所述沙丁胺醇人工抗原的制备方法，其特征在于：所述沙丁胺醇 人工抗原是利用碳二亚胺法将所述沙丁胺醇半抗原衍生物与载体蛋白偶联得到，包括以下 步骤： P1、将所述沙丁胺醇半抗原衍生物溶解于DMS0中得到衍生化合物溶液； P2、向P1中先加入EDCl-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐，再加入NHS N-羟基琥珀酰亚胺均匀混合后反应15-60分钟； P3、将P2中所得到的反应液在25-30°C加入到含有载体蛋白的溶液中进行偶联反应 1-5小时，其中所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白； P4、将P3所得反应液进行透析，收集透析液获得沙丁胺醇人工抗原。
6. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述步骤P3中所述载体蛋白为牛血清 白蛋白或卵清蛋白；所述载体蛋白为牛血清白蛋白时，衍生化合物与牛血清白蛋白的摩尔 比为45~60:1，且合成的人工抗原为沙丁胺醇免疫原；载体蛋白为卵清蛋白时，衍生化合物 与卵清蛋白的摩尔比为35~50:1，且合成的人工抗原为包被原。
7. 根据权利要求5所述制备方法，其特征在于：所述步骤P2中所述EDC和NHS溶于DMF 或DMSO中，且EDC、NHS和所述沙丁胺醇半抗原衍生物的摩尔用量比为1~2:1~1. 5:1~2。
8. 根据权利要求5所述制备方法，其特征在于：所述步骤P3中所述载体蛋白溶液的缓 冲液为〇?lmol/L的NaHC03缓冲液；P4中所述透析液为0?Olmol/L、PH为7. 2~7. 9的磷酸 缓冲液。
9. 一种权利要求4所述沙丁胺醇人工抗原在沙丁胺醇荧光免疫层析检测方法中的应 用。
10. 根据权利要求9所述沙丁胺醇人工抗原在沙丁胺醇荧光免疫层析检测方法中的应 用，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤： P11.利用所述沙丁胺醇免疫原免疫动物制备抗体； P12.细胞融合和筛选； P13.腹水制备和抗体纯化； P14.将步骤P13中得到的抗体和抗兔IgG二抗分别进行荧光染料标记，并配制成检测 分析液； P15.将所述沙丁胺醇包被原和兔IgG抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜条上的前后两端 制备检测线和质控线，其中靠近吸水纸端为前端，靠近样品垫为后端； P16.将玻璃纤维样品垫、步骤P15中所述含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水 纸和PVC黑色地板组装成免疫层析试纸条； P17.将步骤P16中所述试纸条切割适当宽度装入塑料卡盒中，与步骤P14中所述检测 分析液配套使用在荧光免疫层析检测仪上检测。
【专利摘要】本发明涉及生物化工生物检测技术领域，具体涉及一种沙丁胺醇半抗原衍生物、沙丁胺醇人工抗原及其合成方法和在荧光免疫层析法检测沙丁胺醇中的应用。本发明提供了沙丁胺醇半抗原衍生物结构式为图示。该衍生物结构在沙丁胺醇的三个甲基一端引入一个羧基活性官能团结构，最大限度的暴露了沙丁胺醇的特异性的苯环附属结构，同时具有可以与载体蛋白偶联的官能团。沙丁胺醇人工抗原结构式，是将沙丁胺醇半抗原衍生物与载体蛋白偶联的到得偶联物，其中所述载体蛋白protein为牛血清蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）；本发明建立了荧光免疫层析法检测沙丁胺醇的方法，操作简单、检测时间短、成本低、特异性高、重复性好。
【IPC分类】C07C229-14, G01N33-558, C07K14-765, C07C227-16, G01N33-533, C07K14-77, C07K1-107
【公开号】CN104610079
【申请号】CN201410539759
【发明人】刘继斌, 杨志行, 郭彦飞, 文明, 张乐, 朱冰美, 俞燕, 黄昌妹, 王滔, 叶渭龙, 吴婉欣, 池剑
【申请人】湖州海创生物科技有限公司, 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年10月13日