一种黄豆苷元半抗原和完全抗原及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学技术领域。更具体地，设及一种黄豆巧元半抗原和完全抗原 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 黄豆巧元又名大豆巧元，是大豆异黄酬的一种，由豆科植物葛根中提取得到，具有 类似雌激素的生物活性;具有扩张冠状动脉、股动脉、脑动脉，增加脑血流量，加强四肢血流 循环，降低血液黏度，减弱血管阻力，减少屯、肌耗氧量，改善屯、功能，增强微循环，加强末梢 血流量，使血液流变学改变，降压、改善屯、率作用。黄豆巧元可用于高血压、症状性高血压、 冠屯、病、眩晕症、脑血栓、屯、绞痛、屯、肌梗死、屯、律失常、突发性耳聋、妇女更年期综合征等的 治疗。黄豆巧元分子式为Cl出10化，分子量:254.24，其结构式如下式所示：
[0003]
[0004] 目前，检测黄豆巧元的方法有高效液相色谱法化PLC)，高效液相色谱-串联质谱法 (LC-MS-MS)和毛细管电泳法化PCE)等仪器方法，但运些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较 贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，而免疫分析方法具有灵敏度高，检测速度快，特 异性强的优点，具有显著优势。而得到高亲和力和高特异性的抗体是免疫检测的前提，其 中，人工抗原的合成更是其中非常重要的一步。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有黄豆巧元检测方法的缺陷和技术不足，提供 一种黄豆巧元半抗原和完全抗原的制备方法。本发明制备方法合成步骤安全有效，纯度较 高，可得到满足制备完全抗原纯度要求的黄豆巧元半抗原衍生物。
[0006] 本发明的目的是提供一种黄豆巧元半抗原。
[0007] 本发明第二个目的是提供上述黄豆巧元半抗原的制备方法。
[000引本发明的再一目的是提供利用上述黄豆巧元半抗原制备完全抗原的方法，W及制 备得到的黄豆巧元完全抗原。
[0009] 本发明上述目的通过W下技术方案实现：
[0010] -种黄豆巧元半抗原，其分子结构如下式(I)或式（n)所示：
[0011]
[0012] 上述黄豆巧元半抗原的制备方法中，所述式（I)的制备方法是利用黄豆巧元与漠 乙酸乙醋、舰化钟和氨氧化钟溶液反应生成醋类物质，再与氨氧化钟溶液反应得到。
[0013] 具体地，所述式(I)的制备方法包括如下步骤：
[0014] SI.将黄豆巧元溶于丙酬中，依次加入氨氧化钟溶液、舰化钟和漠乙酸乙醋，室溫 下揽拌反应；
[0015] S2.向步骤Sl的反应液中加入盐酸溶液进行中和，再加入蒸馈水，然后萃取后合并 有机层，干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙醋，得到粗品醋；
[0016] S3.所得粗品醋用丙酬复溶，W氯仿和甲醇作展开剂，室溫下进行薄层层析，得到 目标产物醋；
[0017] S4.将目标产物醋溶于甲醇中，加入氨氧化钟溶液进行反应;再用盐酸溶液中和， 再加入蒸馈水，然后萃取后合并有机层，干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙醋，得到目标产物。 [00 1引在式（I)的制备方法中，，优选地，步骤Sl所述黄豆巧元与丙酬的比例为20~30mg/ mLo
[0019] 更优选地，步骤SI所述黄豆巧元与丙酬的比例为25mg/mL。
[0020] 优选地，步骤SI所述氨氧化钟溶液与丙酬的体积比为0.05~0.2:1。
[0021] 更优选地，步骤Sl所述氨氧化钟溶液与丙酬的体积比为0.1075:1。
[0022] 优选地，步骤Sl所述舰化钟与黄豆巧元的质量比为0.05~1:1。
[0023] 更优选地，步骤Sl所述舰化钟与黄豆巧元的质量比为0.064:1。
[0024] 优选地，步骤Sl所述漠乙酸乙醋与丙酬的体积比为0.005~0.02:1。
[00巧]更优选地，步骤Sl所述漠乙酸乙醋与丙酬的体积比为0.01625:1。
[00%]优选地，步骤Sl所述氨氧化钟溶液的浓度为Imol/L。
[0027] 优选地，步骤S1所述室溫是指15°C~30°C。
[0028] 另外，所述式（E)的制备方法是利用黄豆巧元与叔下醇钟和漠乙酸乙醋反应生成 醋类物质，再与氨氧化钟溶液反应得到。
[0029] 具体地，所述式（n)的制备方法包括如下步骤：
[0030] SI.将黄豆巧元溶于N，N-二甲基甲酯胺中，依次加入叔下醇钟和漠乙酸乙醋，低溫 下揽拌反应；
[0031] S2.向步骤Sl的反应液中加入盐酸溶液进行中和，再加入蒸馈水，然后萃取后合并 有机层，干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙醋，得到粗品醋；
[0032] S3.所得粗品醋用丙酬复溶，W氯仿和甲醇作展开剂，室溫下进行薄层层析，再经 液相色谱纯化，得到目标产物醋；
[0033] S4.将目标产物醋溶于甲醇中，加入氨氧化钟溶液进行反应;再用盐酸溶液中和， 再加入蒸馈水，然后萃取后合并有机层，干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙醋，得到目标产物。
[0034] 在式（n )的制备方法中，优选地，步骤SI所述黄豆巧元与N，N-二甲基甲酯胺的比 例为 20 ~30mg/mL。
[0035] 更优选地，步骤SI所述黄豆巧元与N，N-二甲基甲酯胺的比例为25mg/mL。
[0036] 优选地，步骤SI所述叔下醇钟与黄豆巧元的质量比为0.5~2:1，
[0037] 更优选地，步骤Sl所述叔下醇钟与黄豆巧元的质量比为1.1:1。
[0038] 优选地，步骤Sl所述漠乙酸乙醋与N，N-二甲基甲酯胺的体积比为0.005~0.02:1。
[0039] 更优选地，步骤Sl所述漠乙酸乙醋与N，N-二甲基甲酯胺的体积比为0.01625:1。
[0040] 优选地，步骤Sl所述低溫是指-40°C~-70°C。
[0041] 另外，在上述式（I)和式（n)的制备方法中，优选地，步骤S3所述氯仿和甲醇的体 积比为15~25:1。
[0042] 更优选地，步骤S3所述氯仿和甲醇的体积比为20:1。
[0043] 优选地，步骤S4所述目标产物醋与甲醇的比例为5~lOmg/mL。
[0044] 更优选地，步骤S4所述目标产物醋与甲醇的比例为6.8mg/mL。
[0045] 优选地，步骤S2或S4所述萃取是用乙酸乙醋和饱和氯化钢溶液分别萃取。
[0046] 优选地，步骤S2或S4所述干燥过滤是用无水硫酸钢进行干燥过滤。
[0047] 优选地，步骤S2或S4所述盐酸溶液的浓度为Imol/L。
[004引优选地，步骤S4所述氨氧化钟溶液的浓度为Imol/L。
[0049] 优选地，步骤S2所述蒸馈水的用量是丙酬的5倍。
[0050] 优选地，步骤S4所述蒸馈水的用量是甲醇的5倍。
[0051] 优选地，步骤S2或S4所述萃取为分别萃取两次。
[0052] 另外，上述黄豆巧元半抗原在制备黄豆巧元完全抗原或在制备黄豆巧元抗体中的 应用，W及W上述黄豆巧元半抗原合成得到的黄豆巧元完全抗原，也在本发明的保护范围 之内。
[0053] 作为一种优选的实施方案，上述黄豆巧元完全抗原的制备方法包括W下步骤：
[0054] Sl.将黄豆巧元半抗原、EDC和NHS溶于200化的DMF中，室溫揽拌反应过夜，即得活 化好的黄豆巧元衍生物；
[0055] S2.将载体蛋白溶于0.9%的氯化钢溶液中，再边揽拌边逐滴加入上述活化好的黄 豆巧元衍生物，室溫下反应1~化，反应结束后，用0.9%的氯化钢溶液透析，即得到黄豆巧 元完全抗原，分装后冷冻保存于-20°C。
[0056] 其中，优选地，步骤S1中的黄豆巧元半抗原、EDC和NHS的质量比为1:0.6~1.2:0.4 ~1。
[0化7] 优选地，步骤Sl中的黄豆巧元半抗原:DMF = 5mg/mL。
[0化引优选地，步骤S2中的载体蛋白：氯化钢溶液=6~10mg:1.8~2.5mL。
[0059] 优选地，步骤S2所述载体蛋白是BSA或OVA。
[0060] 本发明还提供了一种鉴定或应用上述完全抗原黄豆巧元7-BSA或黄豆巧元4'-BSA 的方法，是按照5化g/只的剂量，分别皮下注射免疫5只雌性Ba化/c小鼠。初次免疫将免疫原 与完全弗氏佐剂按照1:1混合乳化。之后将免疫原与不完全弗氏佐剂按照1:1混合每间隔两 周进行一次加强免疫。S免后尾部取血间接化ISA法测定效价。
[0061] 另外，上述黄豆巧元半抗原在制备黄豆巧元完全抗原化合物，或在制备黄豆巧元 抗体中的应用，W及上述黄豆巧元半抗原在检测黄豆巧元或其结构类似物中的应用，均在 本发明的保护范围之内。
[0062] 同时，所述黄豆巧元完全抗原和黄豆巧元抗体在检测黄豆巧元或其结构类似物中 的应用，W及在黄豆巧元免疫检测中的应用或制备检测试剂盒的应用，也应在本发明的保 护范围之内。
[0063] 由于黄豆巧元属于小分子物质，无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，其本身 没有可供偶联的活性官能团（如氨基、簇基等），因此无法与载体蛋白发生偶联反应产生特 异性抗体的抗原。若对黄豆巧元分子进行修饰衍生化，接上活性官能团使其能与载体蛋白 偶联则有可能形成抗原，运种经过人工修饰后的抗原称为人工抗原，而该衍生化产物则称 为半抗原。因此，要实现黄豆巧元和载体蛋白的偶联，得到特异性抗体，首先要进行黄豆巧 元的设计和合成。为保证半抗原和大分子载体蛋白偶联后能被识别，半抗原的设计关键之 处在于尽可能保留其母环结构，在其适当的位置引入合适的连接臂和能与载体蛋白偶联的 活性基团。而针对黄豆巧元化学结构，其本身在7位和4 '位具有两个径基，基于此，本发明设 计了黄豆巧元半抗原合成方法，从7位和4'位分别衍生，并W此制备适合于动物免疫的完全 抗原，为建立黄豆巧元的免疫分析方法提供了有利的条件，满足了国内对该研究的需要，具 有广阔的实际应用前景。
[0064] 本发明具有W下有益效果：
[0065] 本发明提供了一种新型的黄豆巧元半抗原衍生物的合成方法，为黄豆巧元完全抗 原的合成及黄豆巧元抗体的制备提供可能，方法合成步骤安全有效，产物纯度较高。
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