= ESI-MS m/z :339.17(M-H)-(图4)，核磁结果如 下：iHNMR(400MHz，DMS0-d6).Swm.8.35(s，lH)，7.97(d，J = 6.4Hz，lH)，7.49-7.51(m，2H)， 6.97- 6.99(m,2H) ,6.94(dd, J = 8.8,2.4Hz , IH),6.87(d J = 2.OHz , IH),4.81 (s ,c 2H), 4.18(q J = 6.細z，2H)，1.23(tJ = 7.2Hz，3H)。
[0101 ] 2、将所得粗品产物醋取25mg经液相色谱纯化，得到目标产物醋，得率61.2%。
[0102] 3、将上述步骤的目标产物醋溶于5mL甲醇中，加入Imol/L的氨氧化钟溶液反应。再 用Imol/L盐酸溶液中和，再加入20mL的蒸馈水，然后用乙酸乙醋和饱和氯化钢溶液分别萃 取2次，每次20mL，合并有机层，W无水硫酸钢干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙醋，得到目标 产物黄豆巧元7-衍生物，得率100%。质谱结果如下:ESI-MS m/z : 311.13(M-H)-(图5)，核磁 结果如下：lHNMR(400MHz，DMS0-d6).Sppm.l2.98(brs，lH)，10.78(brs，lH)，8.：M(s，lH)， 7.97(d J = 8.細z，lH)，7.48-7.51(m，2H)，6.92-6.98(m，3H)，6.87(dJ = 2.4Hz，lH)，4.70 (s，lH).
[0103] 实施例6黄豆巧元半抗原（n)合成及鉴定
[0104] l、将120mg黄豆巧元溶于4.0mLN，N-二甲基甲酯胺中，依次加入200mg叔下醇钟和 8化L漠乙酸乙醋，-70°C下揽拌反应。
[0105] 再用Imol/L盐酸溶液中和，再加入20mL的蒸馈水，然后用乙酸乙醋和饱和氯化钢 溶液分别萃取2次，每次20mL，合并有机层，W无水硫酸钢干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙 醋。
[0106] 所得粗品醋用丙酬复溶，W氯仿：甲醇= 25: l(v:v)作展开剂，室溫下进行薄层层 析，得到产物醋，得率62%。质谱结果如下= ESI-MS m/z :339.17(M-H)-(图4)，核磁结果如 下：iHNMR(400MHz，DMS0-d6).Swm.8.35(s，lH)，7.97(d，J = 6.4Hz，lH)，7.49-7.51(m，2H)， 6.97- 6.99(m,2H) ,6.94(dd, J = 8.8,2.4Hz , IH),6.87(d J = 2.OHz , IH),4.81 (s ,c 2H), 4.18(q J = 6.細z，2H)，1.23(tJ = 7.2Hz，3H)。
[0107] 2、将所得粗品产物醋取50mg经液相色谱纯化，得到目标产物醋，得率62.2%。
[0108] 3、将上述步骤的目标产物醋溶于5mL甲醇中，加入Imol/L的氨氧化钟溶液反应。再 用Imol/L盐酸溶液中和，再加入20mL的蒸馈水，然后用乙酸乙醋和饱和氯化钢溶液分别萃 取2次，每次20mL，合并有机层，W无水硫酸钢干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙醋，得到目标 产物黄豆巧元7-衍生物，得率100%。质谱结果如下:ESI-MS m/z : 311.13(M-H)-(图5)，核磁 结果如下：lHNMR(400MHz，DMS0-d6).Sppm.l2.98(brs，lH)，10.78(brs，lH)，8.：M(s，lH)， 7.97(d J = 8.細z，lH)，7.48-7.51(m，2H)，6.92-6.98(m，3H)，6.87(dJ = 2.4Hz，lH)，4.70 (s，lH).
[0109] 实施例7黄豆巧元完全抗原的合成
[0110] W上述实施例1和4制备的黄豆巧元半抗原（I)或（E)为例，分别合成黄豆巧元完 全抗原的方法如下：
[0111] (1)按照每Img黄豆巧元半抗原（I)或（n )，与0. Smg的邸C和0.6mg的NHS溶于20化L 的DMF中的比例操作，室溫揽拌反应过夜，即得活化好的黄豆巧元衍生物；
[0112] (2)将IOmg的载体蛋白溶于1.8~2. SmL的0.9%的氯化钢溶液中，将上一步活化好 的黄豆巧元衍生物边揽拌边逐滴加入载体蛋白溶液中，室溫下反应1-化，反应结束后，用 0.9 %的氯化钢溶液透析，即得到黄豆巧元完全抗原。
[0113] 实施例8黄豆巧元多克隆抗体的制备及鉴定
[0114] I、黄豆巧元多克隆抗体的制备
[0115] 按照50iig/只的剂量，分别皮下注射免疫5只雌性Ba化/c小鼠。初次免疫将免疫原 与完全弗氏佐剂按照1:1混合乳化。之后将免疫原与不完全弗氏佐剂按照1:1混合每间隔两 周进行一次加强免疫。
[0116] 2、黄豆巧元多克隆抗体鉴定
[0117] 从第3次加强免疫开始，每次第8天采血，经放置、离屯、后得到血清，血清适当稀释 后用间接竞争化ISA法测定效价。四免后，小鼠可获得高效价的抗体。黄豆巧元免疫原1(由 黄豆巧元半抗原（I)制备)所获得的抗体效价最高为1:8000,抑制率为94.2% (如附图6所 示）。黄豆巧元免疫原2(由黄豆巧元半抗原（n )制备)所获得的抗体效价最高为1:32000,抑 制率为94.9% (如附图7所不）。
[0118] 综上所述，本发明成功合成黄豆巧元半抗原（I)和（E)，利用该半抗原分别制备黄 豆巧元完全抗原，利用该抗原可生产黄豆巧元抗体，为黄豆巧元免疫分析方法的建立和发 展奠定了基础。
【主权项】
1. 一种黄豆苷元半抗原，其特征在于，其分子结构如下式(I)或式（π)所示：2. 根据权利要求1所述黄豆苷元半抗原，其特征在于，所述式（I)的制备方法是利用黄 豆苷元与溴乙酸乙酯、碘化钾和氢氧化钾溶液反应生成酯类物质，再与氢氧化钾溶液反应 得到；所述式（Π )的制备方法是利用黄豆苷元与叔丁醇钾和溴乙酸乙酯反应生成酯类物 质，再与氢氧化钾溶液反应得到。3. 根据权利要求2所述黄豆苷元半抗原，其特征在于，所述式（I)的制备方法包括如下 步骤：51. 将黄豆苷元溶于丙酮中，依次加入氢氧化钾溶液、碘化钾和溴乙酸乙酯，室温下搅 拌反应；52. 向步骤S1的反应液中加入盐酸溶液进行中和，再加入蒸馏水，然后萃取后合并有机 层，干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到粗品酯；53. 所得粗品酯用丙酮复溶，以氯仿和甲醇作展开剂，室温下进行薄层层析，得到目标 产物酯；54. 将目标产物酯溶于甲醇中，加入氢氧化钾溶液进行反应;再用盐酸溶液中和，再加 入蒸馏水，然后萃取后合并有机层，干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到目标产物； 所述式（Π )的制备方法包括如下步骤：51. 将黄豆苷元溶于N，N-二甲基甲酰胺中，依次加入叔丁醇钾和溴乙酸乙酯，低温下搅 拌反应；52. 向步骤S1的反应液中加入盐酸溶液进行中和，再加入蒸馏水，然后萃取后合并有机 层，干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到粗品酯；53. 所得粗品酯用丙酮复溶，以氯仿和甲醇作展开剂，室温下进行薄层层析，再经液相 色谱纯化，得到目标产物酯；54. 将目标产物酯溶于甲醇中，加入氢氧化钾溶液进行反应;再用盐酸溶液中和，再加 入蒸馏水，然后萃取后合并有机层，干燥过滤，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到目标产物。4. 根据权利要求3所述的黄豆苷元半抗原，其特征在于，在式（I)的制备方法中，步骤S1 所述黄豆苷元与丙酮的比例为20~30mg/mL;步骤S1所述氢氧化钾溶液与丙酮的体积比为 0.05~0.2:1;步骤S1所述碘化钾与黄豆苷元的质量比为0.05~1:1;步骤S1所述溴乙酸乙 酯与丙酮的体积比为〇. 005~0.02:1; 在式（Π )的制备方法中，步骤S1所述黄豆苷元与N，N -二甲基甲酰胺的比例为2 0~ 30mg/mL;步骤S1所述叔丁醇钾与黄豆苷元的质量比为0.5~2:1;步骤S1所述溴乙酸乙酯与 N，N-二甲基甲酰胺的体积比为0.005~0.02:1。5. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，在式（I)和式（Π )的制备方法中，步骤S3 所述氯仿和甲醇的体积比为15~25:1;步骤S4所述目标产物酯与甲醇的比例为5~10mg/ mL〇6. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，在式（I)和式（Π )的制备方法中，步骤S2 或S4所述萃取均是用乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液分别萃取，步骤S2或S4所述干燥过滤均是 用无水硫酸钠进行干燥过滤。7. 权利要求1所述黄豆苷元半抗原在制备黄豆苷元完全抗原或在制备黄豆苷元抗体中 的应用。8. -种黄豆苷元完全抗原，其特征在于，是以权利要求1所述黄豆苷元半抗原合成得到 黄?甘兀完全抗原。9. 权利要求8所述黄豆苷元完全抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：51. 将黄豆苷元半抗原、EDC和NHS溶于200yL的DMF中，室温搅拌反应过夜，即得活化好 的黄豆苷元衍生物；52. 将载体蛋白溶于0.9%的氯化钠溶液中，再边搅拌边逐滴加入上述活化好的黄豆苷 元衍生物，室温下反应1~5h，反应结束后，用0.9%的氯化钠溶液透析，即得到黄豆苷元完全 抗原。10. 权利要求8所述黄豆苷元完全抗原在制备检测试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种黄豆苷元半抗原和完全抗原及其制备方法和应用。所述黄豆苷元半抗原的分子结构如下式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示：本发明以黄豆苷元为原料，经过2步化学反应分别得到黄豆苷元7-衍生物和4`-衍生物半抗原，成功地合成了黄豆苷元半抗原，合成方法安全有效，产物纯度高。在此基础上进一步采用活泼酯法制备适合于动物免疫的黄豆苷元完全抗原，以此抗原免疫Balb/c小鼠，效价可达1：32000，抑制率可达94.9%，为建立黄豆苷元的免疫分析方法提供了核心原材料和有利条件，具有广阔的实际应用前景。
【IPC分类】C07K14/765, C07D311/36, C07K14/77, C07K16/44, G01N33/53
【公开号】CN105669628
【申请号】CN201610021937
【发明人】雷红涛, 陈佳虹, 孙远明, 李轩, 李永芳, 沈兴, 陆宁, 张雅琼, 徐振林, 沈玉栋, 杨金易, 王弘, 肖治理
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月12日