一种直接针对互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种互隔交链孢酚的半 抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 互隔交链孢酚（（Altemariol，A0H)是一类具有诱变性、致癌性、基因毒性等多种 毒性的小分子化合物，与互隔交链孢酸单甲醚（（Altemariol methyl ether, AME)同属于 二苯吡喃酮类衍生物，是链格孢霉次级代谢产物的毒素之一。K.Wollenhaupt等研究了 AOH 对猪子宫内膜细胞活性的影响，当A0H的添加量为12.5wiiol/L时，子宫内膜细胞数量明显减 少；当A0H的浓度为3.12mi 〇1/L，细胞的代谢活性到显著影响;Pollock等研究了A0H及AME的 亚急性毒性和致畸作用，当用200 mg/kg的浓度注射怀孕8d的黄金仓鼠时，胎鼠平均体重下 降，脏器严重坏死，且可观察到A0H与AME存在协同作用。Zhen等研究表明，A0H能够引起胚胎 食道鳞状细胞癌变，从而引发食道癌。
[0003] 链格孢霉广泛的存在自然界中，A0H和AME作为其分较广和产量较高的两种毒素， 主要存在于霉变腐烂的谷物、水果及蔬菜中。据报道，在我国食道癌、大骨节病高发病区的 粮食真菌调查中，互隔交链孢霉广泛的存在于病区的粮食中；Stinson EE，Scott PM，Lau BPY等分别检测了苹果及其饮料制品中的A0H残留情况，其检出率分别为1 /22，17/32，11 / 11，含量分别为160yg/kg，1 ? 35~5 ? 42yg/kg，0 ? 04~2 ? 40yg/kg;此外橘汁、葡萄汁、无花果 干等水果制品中也被检测出互隔交链孢酚。因此，建立快速、简便、灵敏的互隔交链孢酚毒 素检测方法尤为重要。
[0004] 目前，国内外尚未制定互隔交链孢酚毒素在农作物及食品中的限量标准，其有关 免疫检测方法的报道也鲜有见闻，而传统的检测方法如气相色谱法、气相色谱-质谱联用 法、液相色谱-质谱联和毛细管电泳等不仅费时费力，且操作要求高，不适宜大批量的快速 筛选，因此，亟需发明一种针对互隔交链孢酚毒素的快速、简便的检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术中互隔交链孢酚检测的不足，提供了一种互隔交链孢酚的半 抗原及其相应的人工抗原和抗体。
[0006] 本发明的另一目的在于提供所述半抗原、人工抗原和抗体的应用。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种直接检测互隔交链孢酚的免疫分析方法。
[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
[0009] -种互隔交链孢酚的半抗原，具有如式(I)所示的结构： 式(I)中n=l，2。
[0010] 本发明最大限度的保留了互隔交链孢酚的空间结构，其半抗原只是在原有分子的 基础上衍生出带2~3个C原子的羧酸分子手臂，与现有技术相比，本发明的抗原进行动物免 疫后得到更优质、高效的抗体。
[0011] 由于互隔交链孢酚本身的合成难度较大，有关于其半抗原及人工抗原合成也鲜有 报道，与其相关免疫检测方法也较少，而现有的互隔交链孢酚检测技术主要以仪器法为主， 而仪器法操作复杂，前处理要求高，成本高。利用本发明的人工抗原免疫动物得到的抗血清 的效价可达12.81^，最低检测限为1.15 1^/1111，半抑制浓度为16.51^/1111，所述抗体具有特异 性高、灵敏度好、准确度高等显著优点。
[0012] 优选地，式⑴中所述n为1。
[0013] 一种互隔交链孢酚的人工抗原，具有如式(m)所示结构：
式(m)中n=l，2;载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清蛋白或卵血清蛋白。
[0014] 所述半抗原式（I)的制备方法，包括如下步骤:将互隔交链孢酚与具有式（n)所示 分子式结构的溴代羧酸酯类化合物反应后在碱性条件下水解得到具有式（I)所示分子结构 的互隔交链孢酚半抗原：
[0015] 优选地，所述半抗原式(I)的制备方法，包括如下步骤： 51. 将互隔交链孢酚与具有式（n)所示分子式结构的溴代羧酸盐按摩尔比1:1.5溶于 适量DMF中； 52. 加入与溴代羧酸酯等摩尔数的碳酸钾，常温反应3~5h; 53. 加入适量1M的盐酸终止反应，过滤反应混合物得到白色沉淀，滤液用二氯甲烷萃 取3次； 54. 将S3的白色沉淀溶于二氯甲烷中，与萃取溶液合并后过硅胶柱，用体积比为1:5乙 酸乙酯/正己烷洗脱液洗脱，收集洗脱液38 °C旋干，得到白色粉末状物质； 55. 上述白色粉末状物质溶于溶液体积比为1:1四氢呋喃/蒸馏水中，加适量LiOH，于 碱性条件下水解12h; 56. 用1M的盐酸终止反应，乙酸乙酯萃取，萃取液旋干后过硅胶柱，甲醇:氯仿:冰乙酸 =1:30:0.01洗脱，最后蒸干的棕黄色粉末即为互隔交链孢酚半抗原。
[0016]所述人工抗原的制备方法，包括如下步骤:将所述的互隔交链孢酚半抗原溶于DMF 中，搅拌加入1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，然后再加入载体蛋白，4°C下搅 拌反应过夜;偶联混合物于4°C下生理盐水透析2天得到目标产物;所述半抗原与载体蛋白 的摩尔比为100~25:1。
[0017]所述互隔交链孢酚人工抗原的制备方法为活泼酯法，优选地，包括如下步骤：S1. 将5mg的互隔交链孢酸半抗原溶解于0.3mL二甲基亚砜(DMS0); S2.在S1得到的溶液中分别加入1.5倍于互隔交链孢酚半抗原摩尔质量的DCC(N，N-二 环己基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺），室温避光反应过夜； 33.将载体蛋白（12.3 1^834、1011^(^)分别溶于61^的0.0说？83的缓冲液中，再加 入S1得到的溶液，并于4°C反应过夜； S4. S3溶液反应完成后，用生理盐水透析，得到无色互隔交链孢酚人工抗原。
[0018] 优选地，所述PBS缓冲液的pH值为7.4~8.0。
[0019 ]优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵血清蛋白。
[0020] 所述人工抗原制备得到的抗体，包括单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。
[0021] 所述人工抗原或所述抗体在互隔交链孢酚免疫检测分析中的应用。
[0022]本发明还提供一种直接检测互隔交链孢酚的免疫分析方法，包括如下步骤： 51. 将所述的互隔交链孢酚人工抗原免疫动物制备互隔交链孢酚的多克隆抗体； 52. 将所述的互隔交链孢酚人工抗原作为包被原包被在微孔板上，将步骤S1制备得到 互隔交链孢酚的多克隆抗体加入微孔板中； 53. 加入待测样品，采用竞争ELISA测定待测样品中互隔交链孢酚的含量。
[0023]与现有技术相比，本发明有益效果在于:利用本发明的人工抗原免疫动物得到的 抗血清的效价可达1:128000,最低检测限为1.15ng/mL，半抑制浓度为16.5ng/mL，所述抗体 具有特异性高、灵敏度好、准确度高等显著优点，因此本发明提供的抗原和抗体，可用于建 立互隔交链孢酚的酶联免疫吸附分析技术，从而用于快速检测食品中残留的互隔交链孢 酚，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0024]图1互隔交链孢酚半抗原Hl(n=l)质谱鉴定图。
[0025] 图2为互隔交链孢酚半抗原Hl(n=l)及其免疫抗原、载体蛋白紫外扫描图。
[0026] 图3为半抗原所制备抗体对互隔交链孢酚的抑制曲线。
【具体实施方式】
[0027]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对 本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常 规试剂、方法和设备。本发明所述实施例使用的材料的和试剂等，均为市购。
[0028]实施例1半抗原Hl(n=l)的制备方法 在2 5mL圆底烧瓶中将2 6 Omg (1 mmo 1)互隔交链孢酸溶于3mL无水DMF中，磁力搅拌下加入 170.6mg(l .2mmol)K2C〇3,然后逐滴加入200.4mg(l .5mmol)溴乙酸乙酯，室温下反应4h后，加 入1M HC1终止反应，反应混合物过硅胶柱纯化，用乙酸乙酯：正己烷=1:5洗脱后，旋干得到 中间产物为白色粉末。再将其溶于体积比四氢呋喃:H 2 0= 1:1的溶液中，加入10 0 mg L i 0H， 水解12h，用1M HC1调pH=3~4，乙酸乙酯萃取5次，浓缩后硅胶过柱纯化，用甲醇:氯仿:冰乙 酸=1:30:0.01洗脱，旋干洗脱液后得到棕黄色粉末，即为目标半抗原，见式(I)。
，其中，n=l。
[0030] 实施例2免疫原/包被原的制备 所述免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于