半抗原化合物及其多抗、试剂盒与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种半抗原化合物及其多克隆抗体、 试剂盒与应用。
【背景技术】
[0002] 乌头碱类化合物为二聰型生物碱，依据其结构母核上取代基的不同划分为H类： ①双醋型，包括次乌头碱、乌头碱、新乌头碱等，有一定的抗炎镇痛作用，但也是中药材附子 毒性的主要源头，其致毒剂量极小，如l-2mg乌头碱即可致人死亡。②单醋型，包括苯甲醜 乌头碱，苯甲醜中乌头碱，苯甲醜次乌头碱等，毒性相对较小，有镇痛，抗必律不齐及抗癒 痛作用.⑨无醋型，包括乌头原碱、新乌头原碱等，可抗必律失常，且毒性更低。由此可见， 不同的乌头碱类生物碱具有较为相近的生物学活性，但其毒性存在明显差异且与结构密切 相关。
[0003] -方面，乌头碱类生物碱的药效剂量较低，且安全剂量范围相对较窄，临床个体差 异对用药的有效与安全影响明显；另一方面，附子的炮制减毒，实际是W水溶去除大部分生 物碱和W水解将双醋型生物碱转化为单醋型生物碱的过程，药材来源的差异与炮制过程的 控制直接关系到附子的质量评价。因此，对毒性双醋型乌头碱的检测与监控显得极为必要 和关键。
[0004] 目前，对附子中乌头碱类生物碱的检测，较为通用的方法是HPLC法及LC-MS法。 2010年版中国药典采用HPLC法，分析其中双醋型的新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的含量并 规定H者的合计含量《0. 02 %。然而，乌头碱类生物碱的极性小，检测用色谱条件控制较 复杂，且分析时间超长化5min)，极其不便；与此同时，由于检测的药效成分和毒性成份含 量均较低，合计含量也仅为万分之二，分析时样品处理、条件控制或人员操作稍有差异或波 动，即可带来测定结果的明显偏差。国家法部司法鉴定科学技术研究所则建立WLC-MS法 检测生物检材中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量方法和标准，然而，定量LC-MS法对检 测设备要求高投入大，难W普遍推广应用，而且对检测样品的预处理也极为繁琐。因此，对 附子中活性及毒性乌头碱类生物碱的有效监控需要研究开发更简便、更灵敏、更可靠的检 测方法。
[0005] 免疫分析法是基于抗体与抗原或半抗原之间的高度特异性及敏感性而建立起来 的一种生物分析法，相比传统色谱方法，它对于微量痕量成分的准确快速检测具有无法比 拟的技术优势：样品的预处理简单、准确度极高、灵敏度高，检测限度可达ng甚至Pg级，检 测时间仅需3-5min，适合样品的现场即时监控W及大批量样品的快速分析。
[0006] 利用抗体开展对微量痕量中药成分的定性定量分析、中药成分的体内药代动力学 研究已逐步得到应用，具体方法有亲和色谱法、免疫色谱法、免疫印迹法等。虽然抗体-免 疫分析方法的研发，先期投入较大技术要求较高，但一旦研发成功，可形成特征性抗体的工 程菌株，为专有技术，不仅寻求专利保护，而且还可W由此开发出如酶联免疫检测试剂盒等 市场应用型的产品，因而具有良好的应用前景和市场开发价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的旨在提供一种能够特异性识别双醋型乌头碱的多克隆抗体及其试 剂盒与应用。
[0008] 具体地说，本发明的第一方面是提供了一种半抗原化合物3-戊二醜基乌头碱，其 特征在于，它具有如下结构式（I):
[0009]
[0010] 本发明的第二方面是提供了一种双醋型乌头碱的多克隆抗体，可由半抗原与牛血 清白蛋白的偶联物免疫新西兰兔获得，所述半抗原为具有如下结构式（I)的3-戊二醜基 乌头碱：
[0011]
[0012] 在一优选例中，所述3-戊二醜基乌头碱可经由W下方法制得：
[0013] (1)称取乌头碱50mg、戊二酸酢8.SmgW及化巧2血反应20h，用3ml冰水终止反 应后，用3倍量的己酸己醋萃取3次，减压蒸干反应物；
[0014] (2)用Se地adexLH-20柱层析纯化步骤（1)所得的反应物，W甲醇/二氯甲焼为 洗脱液进行洗脱，收集流出液，减压蒸干即得。
[0015] 本发明的第H方面是提供了上述多克隆抗体在检测双醋型乌头碱中的应用。
[0016] 本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述双醋型乌头碱的多克隆抗体。
[0017] 本发明的双醋型乌头碱多克隆抗体，具有如下优点：
[0018] 1.本发明的双醋型乌头碱多抗可W稀释80000倍使用，从而降低了成本；
[0019] 2.本发明的双醋型乌头碱多抗的检测限为25化g，灵敏度较高；
[0020] 3.本发明的双醋型乌头碱多抗特异性强，与单醋型乌头碱的交叉反应均小于 8%，而与去甲乌药碱无交叉反应。
[0021] 本发明各个方面的细节将在随后的章节中得W详尽描述。通过下文W及权利要求 的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【附图说明】
[0022] 图1为半抗原（AC-G巧的ESI-MS图谱。
[002引 图2为半抗原（AC-G巧的Ih-NMR图谱。
[0024] 图3为半抗原（AC-G巧的HMBC二维谱。
[002引 图4为半抗原（AC-G巧的服QC二维谱。
[002引 图5为半抗原（AC-G巧的"C-NMR图谱。
[0027] 图6牛血清白蛋白的MLDI-T0FMS图谱（分子量66431.IDa)。
[0028] 图7乌头碱免疫抗原的MLDI-T0FMS图谱（分子量79724. 3Da)。
[0029] 图8双醋型乌头碱检测试剂盒的标准曲线。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，送些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件（其中，乌头碱对照品购自成都曼斯特生物公司；N，N'-二 环己基碳化亚胺值CC)、N-居基玻巧醜亚胺（N服）、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、TMB、 牛血清白蛋白度SA)W及卵清白蛋白OVA等均购自美国Sigma公司；其他化学试剂均符合 分析标准；新西兰大白兔2只，雄性，每只体重2.化g)。除非另外说明，否则所有的百分数、 比率、比例、或份数按重量计。
[0031] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0032] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可W任意组合。本专利说明书所掲 示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所掲示的各个特征，可W任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所掲示的特征仅为均等或相似 特征的一般性例子。
[0033] 实施例1半抗原一3-戊二醜基乌头碱（AC-G巧的制备及鉴定
[0034] 1.称取乌头碱50mg、戊二酸酢8. 8mg、化巧2血反应20h，用3ml冰水终止反应后， 用3倍量的己酸己醋萃取3次，减压蒸干。
[0035] 2.反应物用Se地adexLH-20柱层析纯化，W甲醇/二氯甲焼为洗脱液，收集流出 液，减压蒸干得纯品。
[003引 3.经过ESI-MS、"C-NMR、1H-NMR、HMBC、服QC二维谱鉴定式I化合物化学结构。 ESI-MS测定仪器；MSD-Trap-XCT,Q-Tofmicro巧SI-M巧型质谱仪（Agilent公司），1H-NMR、 "C-NMR及HMBC、服QC测定均采用AVANCEIII-400核磁共振仪度ruker公司）
[0037] 3.1.从ESI-MS看出，式I化合物分子离子峰m/z信号为760.4 [M]+，说明反应产 物相对分子质量为759,与乌头碱相对分子质量相比增加114,送与乌头碱与一分子戊二酸 酢单醋化后的产物增加的相对分子质量正好一致，说明戊二酸酸酢已经与乌头碱产生了醋 化反应（图1)。
[0038] 3. 2.Ih-NMR谱（图。中出现 5H= 4. 98 的H，且HMBC谱（图扣中 5h4. 94 的H 与C= 0上的C有相关性即是发生反应的C上的H，服QC二维谱（图4)中SH= 4. 98对 应的6c= 71. 84,且Sh= 4. 94的H与Ca和Cig相关，推断戊二酸连接在Cs位置上，即式 I结构为3-戊二醜基乌头碱。
[0039]Ih-NMR谱（图。和"C-NMR谱（图W的具体解析结果如表1和表2所示：
[0040] 表1Ih-NMR谱的解析结果
[004引表2 "C-NMR谱解析结果
[0044]
[0046] 实施例2免疫抗原（AC-GS-BSA)和包被抗原（AC-GS-OVA)的制备
[0047] 1.准确称取3-戊二醜基乌头碱lOmg、N-居基玻巧醜亚胺1. 5mg、N，N'-二环己 基碳化亚胺30mg添加至1血DMF中，置磁力揽拌器上避光室温揽拌地。将20mgBSA溶于 2血0.Olmol.LipBS(抑7. 4)中，然后在揽拌下逐滴加入到上述反应液中，于4°C揽拌反应 过夜。
[0048] 2.反应完毕后将反应物用双蒸水透析72h，冷冻干燥得白色粉末，-2(TC保存。
[0049] 3.采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MLDI-T0FM巧鉴定免疫原偶联物 (AC-GS-BSA)的偶联情况：
[0050]MALDI-TOFMs可W直接显示免疫操作的半抗原数（HaptenNumber)，方法简洁快 速。
[0051] 图6为BSA的MALDI-T0FMS图谱，由该图可知BSA的分子量为66431.IDa。
[0052] 图7为AC-BSA复合物的MALDI-TOFMS图谱，AC-BSA的主峰出现于m/z80348.抓a 附近。
[0053] 己知乌头碱的分子量是759. 4,可计算得到AC-BSA的偶联率为18。
[0054]计算公式=(AC-BSA-BSA)AC= (79724. 3/80348. 5-66431. 1)/759. 4。
[0055] 4.用相同方法制备包被抗原即3-戊二醜基乌头碱与鸡血清白蛋白的偶联物 (AC-GS-OVA)O
[0056] 实施例3用免疫抗原免疫新西兰兔获得双醋型乌头碱多抗
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