一种半抗原、其人工抗原及其在检测喹乙醇残留标志物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种半抗原、其人工抗原及其在检测喹乙醇残留标志物中的应用。
【背景技术】
[0002] 喹乙醇（OLA)，分子式C12H13N3O 4，是喹噁啉类抗菌药物的典型代表，其主要代谢物 为3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA)。由于OLA对大多数动物有明显的致畸作用，对人也有潜 在的三致性（即致畸、致突变和致癌），很多国家规定禁止或限制使用0LA，我国规定只能用 于35kg以下的仔猪。MQCA为指定的喹乙醇的主要残留标志物，用于监控OLA在畜牧生产中 的违禁使用情况。欧盟、美国和中国分别制定了 MQCA的最高残留限量（MRLs)。我国规定 MQCA在猪肝和猪肉中的最高残留限量分别为50 μ g/kg和4 μ g/kg。
[0003] 利用仪器方法检测MQCA的技术相对复杂、耗时长、成本高，而酶联免疫方法 (ELISA)具有快速、灵敏、简便、高效等优点，能满足目前生产链所需要的大量样本的快速筛 选和现场检测的要求。该技术研究的关键是半抗原分子的设计与合成、人工抗原与抗体的 制备。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种半抗原、其人工抗原及其在检测喹乙醇残留标志物中的 应用。
[0005] 本发明提供的半抗原为式（I )所示的化合物；
[0006]
[0007] 本发明还保护式（I )所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0008] (1)乙酰乙酸乙酯、N-溴代丁二酰亚胺和4-硝基邻苯二胺发生反应，用乙酸乙酯 萃取，减压蒸干；
[0009] (2)取步骤（1)的产物，在无水乙醇中与氯化亚锡发生反应，用二氯甲烷萃取，减 压蒸干；
[0010] (3)取步骤（2)的产物，在甲醇和水中与氢氧化锂发生反应，减压蒸干，得到式 (I )所示化合物。
[0011] 式（I )所示化合物的制备方法具体包括如下步骤：
[0012] (1)将650mg乙酰乙酸乙酯溶于20mL蒸馏水，然后加入I. 06g N-溴代丁二酰亚胺 并室温反应0. 5h，然后加入750mg 4-硝基邻苯二胺并室温反应16小时，然后用乙酸乙酯萃 取，收集有机相，减压蒸干，得到化合物2 ;
[0013] (2)将500mg化合物2溶于15mL无水乙醇，然后加入570mg氯化亚锡并室温反应 4h，然后加入20mL IM NaOH水溶液，然后用二氯甲烷萃取，收集有机相，减压蒸干，得到化合 物3 ;
[0014] (3)取230mg化合物3，溶于甲醇-水混合液（将5mL甲醇和2mL水混合，得到甲 醇-水混合液），然后加入120mg氢氧化锂并室温反应16小时，减压蒸干，得到式（I )所 示的化合物。
[0015] 本发明还保护一种人工抗原，为式（I )所示化合物与载体蛋白的偶联物。
[0016] 所述人工抗原的结构式具体如下：
[0017]
[0018] 所述载体蛋白可为人血清白蛋白（HSA)、牛血清白蛋白（BSA)、兔血清白蛋白 (RSA)、甲状腺球蛋白（TG)、卵清蛋白（OVA)或血兰蛋白（KLH)等。
[0019] 所述人工抗原具体可为式（I )所示的化合物与人血清白蛋白的偶联物。所述人 工抗原中，式（I )所示的化合物和人血清白蛋白的偶联物的偶联比具体可为1:8。
[0020] 所述人工抗原的制备方法包括如下步骤：式（I )所示化合物与人血清白蛋白进 行重氮偶联反应，得到偶联物。
[0021] 所述人工抗原的制备方法具体如下：将25mg式（I )所示化合物溶于2mL水，然 后加入2mL IM盐酸水溶液，然后依次加入20mg亚硝酸钠和200mg人血清白蛋白，混勾，然 后2-8°C搅拌反应1-2小时（具体可4°C、120rpm搅拌反应2小时），然后在PBS缓冲液中 透析，得到人工抗原。
[0022] 本发明还保护所述人工抗原在制备抗体中的应用。
[0023] 以所述人工抗原为免疫原得到的抗体也属于本发明的公开范围。所述抗体可为单 克隆抗体或多克隆抗体。所述多克隆抗体可为兔源抗体、鼠源抗体、马源抗体、羊源抗体、猪 源抗体或豚鼠源抗体。所述抗体具体可为将所述人工抗原免疫新西兰大耳兔后得到的血 清。
[0024] 本发明还保护所述抗体在检测喹乙醇残留标志物中的应用。
[0025] 本发明还保护用标记酶标记式（I )所示化合物得到的酶标抗原。所述标记酶可 为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。所述酶标抗原中，所述辣根过氧化物酶可通过EDC法 或高碘酸钠法与式（I )所示化合物交联。
[0026] 本发明还包括所述酶标抗原在检测喹乙醇残留标志物中的应用。
[0027] 本发明还保护一种用于检测喹乙醇残留标志物的试剂盒，包括所述酶标抗原和所 述抗体。
[0028] 所述试剂盒由如下组件组成：包被有多克隆抗体的酶标板，标准溶液1，标准溶液 2,标准溶液3,标准溶液4,标准溶液5,标准溶液6,酶标抗原溶液，浓缩洗涤液，浓缩显色 液，显色液稀释液，终止液；
[0029] 标准溶液I :PBS缓冲液；
[0030] 标准溶液2 :含有0· 30 μ g/LMQCA的PBS缓冲液；
[0031] 标准溶液3 :含有I. 00 μ g/LMQCA的PBS缓冲液；
[0032] 标准溶液4 :含有3. 00 μ g/LMQCA的PBS缓冲液；
[0033] 标准溶液5 :含有10. 00 μ g/LMQCA的PBS缓冲液；
[0034] 标准溶液6 :含有30. 00 μ g/LMQCA的PBS缓冲液；
[0035] 酶标抗原溶液：将5mg式（I )所示化合物溶于ImL水，然后逐滴加入0· 5mLEDC 水溶液（含5mg EDC)和0· 5mL NHS水溶液（含3mg NHS)并混匀，然后4°C搅拌5min，然后 加入ImL 20mg/mL HRP溶液（将辣根过氧化物酶溶于PBS缓冲液，得到HRP溶液）并4°C、 120rpm搅拌反应16小时，然后在生理盐水中透析，得到酶标抗原溶液；
[0036] 浓缩洗涤液：含有0· 5% (质量百分含量）吐温-20的PBS缓冲液；
[0037] 浓缩显色液：浓度为lmg/ml的四甲基联苯胺溶液（溶剂为二甲基甲酰胺）；
[0038] 显色液稀释液：含有0. 2M磷酸氢二钠和0. 2M柠檬酸的水溶液，pH5. 0 ;
[0039] 终止液：lmol/L硫酸溶液；
[0040] 包被有多克隆抗体的酶标板的制备方法：①取所述抗体，用包被缓冲液（pH9. 6、 0. 05M的碳酸盐缓冲液）稀释，得到蛋白浓度为0. 2 μ g/mL的溶液；②取酶标板，每孔加入 150 μ L步骤①制备的溶液，37°C静置2h，然后4°C静置16小时，弃去孔内液体，用洗涤液 (将浓缩洗涤液用水稀释至10倍体积，即为洗涤液）洗涤3次（每次30秒），拍干；③完成 步骤②后，取所述酶标板，每孔加入250 yL含5% (质量百分含量）脱脂牛奶的PBS缓冲 液，37°C温育1小时，弃去孔内液体，干燥后得到包被有多克隆抗体的酶标板。
[0041] 以上任一所述喹乙醇残留标志物具体可为3-甲基喹噁啉-2-羧酸。
[0042] 兽药半抗原的设计总体来说就是对兽药分子的电性和空间性的模拟。半抗原与待 测物结构尽可能相似是半抗原设计的一个主要原则。目前制备小分子半抗原的抗体常规方 法是选择具有毒理学意义的原型药物或代谢产物作为待测物，设计合成保留待测物分子结 构特征并带有活性基团的人工半抗原，通过键合的方法使半抗原和蛋白质载体偶联制备免 疫原，经动物免疫程序制备针对半抗原的特异性抗体。待测物分子中存在-C00H、-OH或-NH 2 等易于和蛋白质或间隔臂发生偶联的官能团，常被用作连接点来制备免疫原。目前已有检 测MQCA的方法大多数是直接在MQCA分子的-COOH位置设计改造抗原。实际上，在合成人 工抗原的过程中，即使半抗原绝大部分的官能团与待测物都是一致的，但在药物分子与载 体蛋白连接的部位很容易受到屏蔽。以测定喹噁啉类药物研究为例，如果选择在-COOH位 置进行人工抗原设计和改造并偶联载体蛋白，MQCA的部分特征性基团和结构（-C00H、氮杂 环）不能充分暴露作为B淋巴细胞的抗原表位，进而影响抗体灵敏度或特异性。因此，连接 位点的选择对于抗体质量至关重要，这就要求对半抗原进行科学合理的设计与改造。
[0043] 本发明提供的半抗原，既完整保留喹乙醇残留标志物分子特征性基团和结构 (-C00H、氮杂环），同时又带有便于发生键合反应的连接基团-NH 2(便于通过键合的方法使 半抗原和蛋白质载体偶联制备人工抗