原），使得相应的人工抗原能充分暴露并作为B淋巴 细胞的抗原表位，进而利于高灵敏度和特异性抗体的制备。
[0044] 本发明提供的半抗原具有如下优点：（1)制备所需的原料简单、低廉，易于购买； (2)制备所需的化学反应安全、易于操作、重现性好；（3)将半抗原与载体蛋白偶联后免疫 动物，所得抗体的效价、特异性都很高，可用于制备酶联免疫试剂盒。
[0045] 应用本发明提供的酶联免疫试剂盒检测喹乙醇残留标志物，具有如下优点：操作 简单，1小时之内可得出测定结果，可同时快速检测大批样品，具有最低检测限低、特异性 高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点，本发明可在喹乙醇残留标志物检测中发挥重要 作用。
【附图说明】
[0046] 图1为喹乙醇残留标志物半抗原的合成路线示意图。
[0047] 图2为喹乙醇残留标志物半抗原的核磁共振谱图。
[0048] 图3为喹乙醇残留标志物酶联免疫检测试剂盒标准曲线。
【具体实施方式】
[0049] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实 验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均 为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结 果取平均值。如无特殊说明，实施例中所用的PBS缓冲均为如下：PBS缓冲液（pH7. 2):含 有0.0 lM磷酸二氢钠和0.0 lM磷酸氢二钠的水溶液。MQCA :Sigma-Aldrich公司，CAS号： 74003-63-7〇
[0050] 实施例1、半抗原的合成和鉴定
[0051] -、半抗原的合成
[0052] 半抗原的合成路线示意图见图1。
[0053] (1)将650mg乙酰乙酸乙酯溶于20mL蒸馏水，然后加入I. 06g N-溴代丁二酰亚 胺（NBS)并室温反应0. 5h，然后加入750mg 4-硝基邻苯二胺（化合物1)并室温反应16小 时，然后用乙酸乙酯萃取，收集有机相，减压蒸干，得到化合物2。
[0054] (2)将500mg化合物2溶于15mL无水乙醇，然后加入570mg氯化亚锡并室温反应 4h，然后加入20mL IM NaOH水溶液，然后用二氯甲烷萃取，收集有机相，减压蒸干，得到化合 物3。
[0055] (3)取230mg化合物3，溶于甲醇-水混合液（将5mL甲醇和2mL水混合，得到甲 醇-水混合液），然后加入120mg氢氧化锂并室温反应16小时，减压蒸干，得到化合物4。化 合物4即为半抗原。
[0056] 二、半抗原的鉴定
[0057] 化合物4的LC-MS图谱结果如下（ESI, m/z) :204[M+H] +。图谱中，得到m/z比为 204的主峰，对应半抗原的[M+H]+。
[0058] 化合物 4 的核磁共振谱图见图 2。1H NMR(300MHz, Chloroform-d) δ 7. 71 (d, J = 9. 0Hz, 1H), 7. 29 (dd, J = 9. 0, I. 8Hz, 1H), 6. 92 (d, J=L 8Hz, 1H), 6. 13 (br, 2H), 2. 68 (s, 3H) 〇
[0059] 以上鉴定结果表明，化合物4的结构式如下：
[0060]
[0061] 实施例2、人工抗原的制备和鉴定
[0062] -、人工抗原的合成
[0063] 将25mg实施例1制备的化合物4溶于2mL 7K，然后加入2mL IM盐酸水溶液，然后 依次加入20mg亚硝酸钠和200mg人血清白蛋白，混匀，然后4°C、120rpm搅拌反应2小时 (实际应用中2-8°C搅拌反应1-2小时均可，重氮偶联反应），然后在PBS缓冲液中透析，得 到人工抗原溶液（人工抗原即半抗原-人血清白蛋白的偶联物），_20°C保存备用。
[0064] 二、人工抗原的鉴定
[0065] 取步骤一制备的人工抗原溶液，用PBS缓冲液稀释至lmg/mL(以蛋白浓度计），作 为溶液甲；将含lmg/mL化合物4的PBS缓冲液作为溶液乙；将含lmg/mL人血清白蛋白的 PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外（250-400nm)光谱扫描。
[0066] 与溶液丙相比溶液甲的紫外图谱发生了明显变化，说明半抗原与人血清白蛋白成 功偶联。溶液乙在260nm处有最大吸收值，溶液丙在278nm处有最大吸收值。根据公式K =A/CL(A为最大吸收波长值下的吸光度，C为溶液浓度，L为液层的厚度）分别计算乙、丙 化合物的消光系数（K)。分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光 谱扫描，并根据已经计算出的半抗原的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用 浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度，计算偶联比。半抗原和人血清白蛋白的偶联 比为8:1，即8个半抗原结合1个人血清白蛋白。
[0067] 实施例3、多克隆抗体的制备
[0068] -、多克隆抗体的制备
[0069] 采用新西兰大耳兔作为免疫动物，以实施例2中制备的人工抗原为免疫原。首次 免疫用乳液按照如下方法配制：2mL浓度为2mg/mL(以蛋白浓度计）的免疫原水溶液与2mL 完全弗氏佐剂乳化。加强免疫用乳液按照如下方法配制：2mL浓度为2mg/mL(以蛋白浓度 计）的免疫原水溶液与2mL不完全弗氏佐剂乳化。首次免疫采用背部皮下多点注射以及后 脚掌趾间注射（免疫原的剂量为Img/只）；加强免疫采用大腿肌肉注射（免疫原的剂量为 0. 5mg/只），每次免疫间隔2周，共加强免疫10次，最后一次不加免疫佐剂直接肌肉注射， 最后一次加强免疫7天后采血，收集血清，即为多克隆抗体。
[0070] 二、多克隆抗体的效价检测（直接竞争ELISA法）
[0071] 1、取步骤一制备的多克隆抗体，用包被缓冲液（pH9. 6、0. 05M的碳酸盐缓冲液）梯 度稀释，得到各个抗体稀释液。
[0072] 2、取酶标板，每孔加入150 μ L步骤1制备的抗体稀释液，37°C静置2h，然后4°C静 置12小时，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次（每次30秒），拍干。
[0073] 3、完成步骤2后，取所述酶标板，每孔加入250 yL含5% (质量百分含量）脱脂牛 奶的PBS缓冲液，37°C温育1小时，弃去孔内液体，干燥。
[0074] 4、完成步骤3后，取所述酶标板，在不同的孔中分别加入0浓度标准溶液（即PBS 缓冲液）和含lOng/mLMQCA的PBS缓冲液（50 μ L/孔），然后每孔加入100 μ L酶标抗原溶 液并静置孵育30分钟，用洗涤液洗涤酶标板3次并用吸水纸拍干，然后每孔加入100 μ L显 色液并避光显色15min，最后每孔加入100 μ L终止液，用酶标仪测定450nm处吸光值（A450 值）。加入0浓度标准溶液的孔的吸光度值为B。。加入含10ng/mLMQCA的PBS
[0075]
[0076] 缓冲液的孔的吸光度值为B。
[0077] B。大于1. 5且百分吸光度值为50%以下判断为阳性。百分吸光度值越低，抗体灵 敏度越高。按此要求血清抗体效价达1:5000。
[0078] 酶标抗原溶液的制备方法、洗涤液的制备方法、显色液的制备方法和终止液的制 备方法见实施例4。
[0079] 实施例4、酶联免疫试剂盒
[0080] 一、酶联免疫试剂盒的组成
[0081] 试剂盒的组成如下：包被有多克隆抗体的酶标板；A试剂瓶（装有标准溶液I)，B 试剂瓶（装有标准溶液2)，C试剂瓶（装有标准溶液3)，D试剂瓶（装有标准溶液4)，E试 剂瓶（装有标准溶液5)，F试剂瓶（装有标准溶液6) ;G试剂瓶（装有酶标抗原溶液）试 剂瓶（装有浓缩洗涤液；使用时，将浓缩洗涤液用水稀释至10倍体积，即为洗涤液）试剂 瓶（装有浓缩显色液；使用时，将浓缩显色液用显色液稀释液稀释，使四甲基联苯胺浓度为 0· lmg/mL，即为显色液）J试剂瓶（装有显色液稀释液）；K试剂瓶（装有终止液）。
[0082] 二、所用试剂的配制
[0083] 标准溶液I :PBS缓冲液；
[0084] 标准溶液2 :含有0· 30 μ g/LMQCA的PBS缓冲液；
[0085] 标准溶液3 :含有1. 00 μ g/LMQCA的PBS缓冲液；
[0086] 标准溶液4 :含有3. 00 μ g/LMQCA的PBS缓冲液；
[0087] 标准溶液5 :含有10. 00 μ g/LMQCA的PBS缓冲液；
[0088] 标准溶液6 :含有30. 00 μ g/LMQCA的PBS缓冲液。
[0089] 酶标抗原溶液：将5mg实施例1制备的化合