物4溶于ImL水，然后逐滴加入 0· 5mLEDC水溶液（含5mg EDC)和0· 5mL NHS水溶液（含3mgNHS)并混匀，然后4°C搅拌 5min，然后加入ImL 20mg/mLHRP溶液（将辣根过氧化物酶溶于PBS缓冲液，得到HRP溶液； 辣根过氧化物酶购自Roche公司，CAS号为9003-99-0)并4°C、120rpm搅拌反应16小时， 然后在生理盐水中透析，得到酶标抗原溶液，_20°C保存备用。
[0090] 浓缩洗涤液：含有〇· 5% (质量百分含量）吐温-20的PBS缓冲液。
[0091] 浓缩显色液：浓度为lmg/ml的四甲基联苯胺溶液（溶剂为二甲基甲酰胺）。
[0092] 显色液稀释液：含有0. 2M磷酸氢二钠和0. 2M梓檬酸的水溶液，pH5. 0。
[0093] 终止液：lmol/L硫酸溶液。
[0094] 三、包被有多克隆抗体的酶标板的制备
[0095] 包被缓冲液：ρΗ9· 6、0· 05M的碳酸盐缓冲液。
[0096] 1、取实施例3制备的多克隆抗体，用包被缓冲液稀释，得到蛋白浓度为0. 2 μ g/mL 的溶液。
[0097] 2、取酶标板，每孔加入150 μ L步骤1制备的溶液，37°C静置2h，然后4°C静置16 小时，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次（每次30秒），拍干。
[0098] 3、完成步骤2后，取所述酶标板，每孔加入250 yL含5% (质量百分含量）脱脂牛 奶的PBS缓冲液，37°C温育1小时，弃去孔内液体，干燥后得到包被有多克隆抗体的酶标板。
[0099] 包被有多克隆抗体的酶标板用铝膜真空密封保存。
[0100] 实施例5、试剂盒灵敏度、特异性、精密度和准确度试验
[0101] 检测实施例4制备的试剂盒的灵敏度、特异性、精密度和准确度。
[0102] -、样品的前处理及检测方法
[0103] 1、猪肝、猪肉、鸡肉、鸡蛋样品前处理
[0104] ⑴称取2 (±0.02) g均质样品至50mL离心管中，加入SmL乙酸乙酯，涡旋混匀；
[0105] (2)完成步骤（1)后，取所述离心管，加入4mLl. 5M盐酸水溶液，涡旋混匀，用振荡 器振荡5min，5000r/min室温离心5min，取上清液；
[0106] (3)取5mL步骤（2)得到的上清液至另一新的50mL离心管中，加入3mL33. 3% (质 量百分比）NaCl水溶液，涡旋混匀，5000r/min室温离心5min，取上清液；
[0107] (4)取4mL步骤⑶得到的上清液至IOmL干净玻璃试管中，于50-60°C水浴氮气 流下吹干；
[0108] (5)完成步骤（4)后，取所述玻璃试管，加入ImL正己烷，涡旋溶解干燥残留物，然 后加入ImL 7K，涡旋混勾，静置分层；
[0109] (6)完成步骤（5)后，取所述玻璃试管，除去上层有机相，取下层水相，用水稀释至 两倍体积，即为待测样本溶液。
[0110] 2、检测方法
[0111] (1)制作标准曲线
[0112] 取包被有多克隆抗体的酶标板，每孔加入50 μ L标准品溶液（标准溶液1、标准溶 液2、标准溶液3、标准溶液4、标准溶液5或标准溶液6)，然后每孔加入100 μ L酶标抗原溶 液并18°C -30°C放置30min，然后用洗涤液洗涤酶标板3次并用吸水纸拍干，然后每孔加入 100 μ L显色液并避光显色15min，最后每孔加入100 μ L终止液，用酶标仪测定450nm处吸 光值（A45。值）。
[0113]
[0114] (B-为标准溶液或待测样本溶液的吸光度平均值；B。一为标准溶液1的吸光度平 均值）
[0115] 以标准溶液中喹乙醇残留标志物浓度的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴， 用Excel绘制标准曲线。
[0116] 50%抑制浓度（即IC5。，指标准溶液1吸光度值的50%处所对应的药物浓度）常 作为评价竞争ELISA试剂盒灵敏度的指标。用实施例4制备的试剂盒分别测定10次标准 曲线的50%抑制浓度，确定该试剂盒的IC50在1. 8-2. 1 μ g/L范围之内。试剂盒标准校正 曲线见图3。
[0117] ⑵待测样本的检测
[0118] 取包被有多克隆抗体的酶标板，每孔加入50 μ L待测样本溶液，然后每孔加入 100 μ L酶标抗原溶液并18°C -30°c放置30min，然后用洗涤液洗涤酶标板3次并用吸水纸 拍干，然后每孔加入100 μ L显色液并避光显色15min，最后每孔加入100 μ L终止液，用酶标 仪测定450nm处吸光值（A45。值）。从标准曲线上计算出待测样本溶液中喹乙醇残留标志物 浓度。
[0119] 二、试剂盒灵敏度、特异性、精密度和准确度试验
[0120] 1、试剂盒灵敏度试验
[0121] 用实施例4制备的试剂盒测定各个空白样品（已确认不含喹乙醇残留标志物的猪 肝、猪肉、鸡肉、鸡蛋，各20份）的A 45。值，每个样品进行3次重复，取三次实验结果的平均 值。将各样品的A45。平均值分别代入标准曲线中，获得各样品中的喹乙醇残留标志物浓度， 计算最低检测限（即喹乙醇残留标志物浓度的平均值加3倍标准差）。
[0122] 实施例4制备的试剂盒对猪肝空白样品、猪肉空白样品、鸡肉空白样品、鸡蛋空白 样品的最低检测限依次为0. 42、0. 23、0. 28、0. 28 μ g/kg。
[0123] 2、特异性测定
[0124] 选择与MQCA结构和功能类似的5种药物，配制成如下浓度的类似物溶液：0、10、 30、100、300、1000 μ g/L。用类似物溶液代替标准溶液，按照步骤2的方法制作标准曲线，得 到各类似物的50%抑制浓度，与MQCA50%抑制浓度相比，得出一系列交叉反应率，结果见 表1。
[0128] 3、准确度、精密度测定
[0129] 在空白猪肉中添加 MQCA标准溶液至终浓度分别为I. 0 μ g/kg、2. 0 μ g/kg和 4. 0 μ g/kg。各浓度分别制备样品6份，然后采用实施例4制备的试剂盒分别测定其含量， 重复3次。分别计算回收率（回收率=实测值/添加值X 100% )、批内变异系数和批间变 异系数。
[0130] 结果见表2。
[0131] 表2平均回收率与变异系数的结果
[0133] 结果表明：实施例4制备的试剂盒在猪肉中1.(^8/1^、2.(^8/1^和4.(^ 8/ kgMQCA添加浓度的回收率为70 % -97% ;批内变异系数CV彡12%，批间变异系数 CV 彡 10% 〇
【主权项】
1. 式（I )所示的化合物；2. 权利要求1所述化合物的制备方法，包括如下步骤： (1) 乙酰乙酸乙酯、N-溴代丁二酰亚胺和4-硝基邻苯二胺发生反应，用乙酸乙酯萃取， 减压蒸干； (2) 取步骤（1)的产物，在无水乙醇中与氯化亚锡发生反应，用二氯甲烷萃取，减压蒸 干； ⑶取步骤⑵的产物，在甲醇和水中与氢氧化锂发生反应，减压蒸干，得到权利要求1 所述化合物。3. 权利要求1所述化合物与载体蛋白的偶联物。4. 如权利要求3所述的偶联物，其特征在于：所述偶联物的制备方法包括如下步骤：权 利要求1所述化合物与载体蛋白进行重氮偶联反应，得到偶联物。5. 权利要求3或4所述偶联物在制备抗体中的应用。6. 以权利要求3或4所述偶联物为抗原得到的抗体。7. 权利要求6所述抗体在检测喹乙醇残留标志物中的应用。8. 用标记酶标记权利要求1所述化合物得到的酶标抗原。9. 权利要求8所述酶标抗原在检测喹乙醇残留标志物中的应用。10. -种用于检测喹乙醇残留标志物的试剂盒，包括权利要求6所述抗体和权利要求8 所述酶标抗原。
【专利摘要】本发明公开了一种半抗原、其人工抗原及其在检测喹乙醇残留标志物中的应用。本发明提供的半抗原为式(Ⅰ)所示的化合物。本发明还保护一种人工抗原，为式(Ⅰ)所示化合物与载体蛋白的偶联物。以所述人工抗原为免疫原得到的抗体也属于本发明的公开范围。本发明还保护用标记酶标记式(Ⅰ)所示化合物得到的酶标抗原。本发明可在喹乙醇残留标志物检测中发挥重要作用。
【IPC分类】C07K14/77, C07K14/795, C07K14/765, C07D241/44, G01N33/53, C07K14/47
【公开号】CN105061339
【申请号】CN201510381440
【发明人】白玉惠, 王鹤佳, 刘智宏, 黄耀凌, 徐士新, 张聪敏
【申请人】中国兽医药品监察所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月2日