专利名称：丙型肝炎病毒抗原抗体时间分辨免疫荧光分析法联合检测及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及丙型肝炎病毒抗原抗体时间分辨免疫荧光分析法联合检测及检测试剂盒，属于时间分辨免疫荧光分析法以及体外诊断检测领域。
背景技术：
丙型肝炎病毒Ofepatitis C virus, HCV)呈球形，直径小于80nm (在肝细胞中为36 40nm，在血液中为36_62nm)，为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。丙型肝炎病毒可引起丙型肝炎主要经输血，针刺，吸毒等传播。HCV感染通常是持续性的终生感染，抗体检测是一个非常有效的方法。但因感染HCV后，抗HCV出现较 慢，一般情况下，抗体的血清学转换可以延迟到暴露后几个月才发生，此时可发生抗HCV的 假阴性(也就是说在抗体可检出之前或在血清学转换之中即所谓的“窗口期”)，故在早期诊断丙肝感染上有困难。HCV核心抗原检出时间早于抗体，HCV-cAg检测可作为HCV抗体检测的补充试剂。目前丙型肝炎的检测方法主要有三类
1.丙型肝炎抗体检测其缺点是感染丙型肝炎病毒HCV后，有2-26周的潜伏期，一般到抗HCV抗体出现(转阳)有一个较长的窗口期，平均为70d，有的患者窗口期可延长至6-9个月或更长。由于窗口期的存在，对潜伏期和隐形感染者容易造成漏检，机体感染HCV后，在抗HCV抗体出现之前约2周左右，血循环中即可出现病毒颗粒，此时丙型肝炎病毒HCV的RNA经PCR方法检测可为阳性，血液具有感染性，而用抗体检测方法根本无法测出；
2.丙型肝炎病毒HCV核酸检测感染丙型肝炎病毒HCV后1-2周，血清中即可检测到HCV-RNA。因此，HCV核酸检测(HCV RT-PCR检测)可用于丙型肝炎的早期诊断，并且通过对病毒拷贝数的定量检测可对其临床疗效进行监测。因为PCR法检测HCV-RNA影响因素较多，在样本收集、储存和检测方面都有严格的要求，并且PCR的检测操作过程复杂、费时；
3.丙型肝炎抗原检测丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最为保守的部分编码而来，在HCV-RNA出现后的l-2d内即出现丙型肝炎病毒HCV抗原，且与HCV-RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。有研究表明，HCV抗原检测与抗HCV抗体检测相比，HCV抗原的检测可使检测的窗口期平均提前49天，缩短窗口期HCV感染者的献血的风险。与RT-PCR方法相比具有操作简便、时间短、对环境要求低的特点，在临床上可用于早期急性丙型肝炎诊断。时间分辨免疫突光分析(Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)是在突光分析(FIA)的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析法。它利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，以代替传统的荧光物质、酶、同位素、化学发光物质。用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，准确地测定反应体系中被分析物的浓度。TRFIA所使用的荧光标记物是镧系稀土金属，由于镧系稀土金属离子螯合物有很长的突光寿命(微秒级)，有别于传统突光的短突光寿命，使其能通过时间分辨方式区别于背景荧光(钠秒级)，正是由于荧光衰变时间长，可以延缓测量时间，待测样品中短寿命的本底荧光衰变后再测稀土离子的特异荧光，因此可完全消除本底荧光的干扰。镧系稀土金属离子螯合物荧光很宽的Stokes位移使其容易通过波长分辨方式进一步区别于背景荧光，提高方法学的稳定性。镧系稀土金属离子螯合物狭窄的荧光发射峰使其荧光检测具有很高的效率，进一步提高了信号检测的特异性和灵敏性。此外，由于检测时加入了荧光增强液，它可使原来荧光增强100万倍，以上各种因素使TRFIA的检测灵敏度和准确性大大提闻。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于丙型肝炎病毒抗原抗体时间分辨免疫荧光分析法联合检测及检测试剂盒，主要解决现有技术存在的灵敏度低、稳定性差、操作烦琐及污染环境等技术问题。最主要解决的问题是缩短窗口期，可用于早期急性丙型肝炎诊断。本发明采用时间分辨免疫荧光分析法，联合检测丙型肝炎病毒抗原抗体。该发明建立双抗夹心的基础之上，在这里，样品中的抗原抗体首先被包被于微孔板上的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abl、丙型肝炎病毒重组抗原AgI捕获。在洗掉样品的其它部分，再加入铕标记物(铕标记抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abll、丙型肝炎病毒重组抗原AgII )，就可以形成单克隆抗体AbI-丙型肝炎病毒抗原-单克隆抗体AbII铕标记物复合物与重组抗原AgI-丙型肝炎病毒抗体-重组抗原AgII铕标记物复合物，洗板加入增强液，用时间分辨分析仪测量荧光值，荧光值与样本中抗原抗体总浓度呈正相关，从而计算抗原抗体浓度。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点
1.本发明采用丙型肝炎抗原抗体联合检测大大缩短窗口期。现阶段丙型肝炎的检测·一般是检测丙型肝炎抗体其缺点是感染丙型肝炎病毒后，有2-26周的潜伏期，一般到抗HCV抗体出现(转阳)有一个较长的窗口期，平均为70d，有的患者窗口期可延长至6-9个月或更长。由于窗口期的存在，对潜伏期和隐形感染者容易造成漏检。本发明采用丙型肝炎抗原检测，丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最为保守的部分编码而来，在HCV-RNA出现后的l-2d内即出现丙型肝炎病毒HCV抗原，且与HCV-RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。有研究表明，HCV抗原检测与抗HCV抗体检测相比，HCV抗原的检测可使检测的窗口期平均提前49天，缩短窗口期HCV感染者的献血的风险。本发明应用联合检测能够将抗原与抗体检测的优势据发挥出来，且本发明具有操作简便、时间短、对环境要求低的特点，在临床上可用于早期急性丙型肝炎诊断；
2.本发明是采用先进的时间分辨免疫荧光分析法，具有灵敏度高，不易污染，检测时间快等优势。时间分辨免疫荧光分析是在荧光分析(FIA)的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析法。它利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，以代替传统的荧光物质、酶、同位素、化学发光物质。用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，准确地测定反应体系中被分析物的浓度。TRFIA所使用的荧光标记物是镧系稀土金属，由于镧系稀土金属离子螯合物有很长的荧光寿命(微秒级)，有别于传统荧光的短荧光寿命，使其能通过时间分辨方式区别于背景荧光(钠秒级)，正是由于荧光衰变时间长，可以延缓测量时间，待测样品中短寿命的本底荧光衰变后再测稀土离子的特异荧光，因此可完全消除本底荧光的干扰。镧系稀土金属离子螯合物荧光很宽的Stokes位移使其容易通过波长分辨方式进一步区别于背景荧光，提高方法学的稳定性。镧系稀土金属离子螯合物狭窄的荧光发射峰使其荧光检测具有很高的效率，进一步提高了信号检测的特异性和灵敏性。此外，由于检测时加入了荧光增强液，它可使原来荧光增强100万倍，以上各种因素使TRFIA的检测灵敏度和准确性大大提高；
3.本发明是定量检测丙型肝炎病毒抗原抗体的含量，定量检测可以动态观察疗效和病情监测定量检测丙型肝炎病毒抗原抗体浓度变化可对HCV的病程、治疗、预后起一个动态监测的作用，能够让医生对病情疗效作出合理的解释提供依据，指导治疗；
本发明的技术方案是在进行时间分辨免疫荧光分析检测前需完成下列准备工作
首先制备包被板，所用的包被板为特异性抗原抗体包被的微孔板，丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条的制备包括以下步骤
(1)将纯化的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abl、丙型肝炎病毒重组抗原AgI用50mmol/L Tris-HCl缓冲液稀释,稀释至O. 1-10 μ g/ml,然后加入包被板条各孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条；
(2)将丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷藏 备用。其次是丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测铕标记物的制备，包括以下步骤
(1)取待标记物抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体AbI稀释至5mg/ml、丙型肝炎病毒重组抗原AgI稀释至3mg/ml,按照1:1的体积混合。按总质量比为2:1的比例(DTTA-Eu:总抗原抗体)边振荡边加入DTTA-Eu，室温下在振板机上慢速振荡I小时，然后在黑暗中静置48小时；
(2)标记好的抗体与游离DTTA-Eu通过SephadexG50色谱柱(I. 5 X 50cm)分离,分离过程用核酸蛋白仪监控；
(3)用小试管依次收集流出物，同时测铕标记物浓度；
(4)加入O.5% BSA,按照抗原抗体总浓度为20 μ g/ml稀释备用，2_8°C保存。检测操作过程
1.试剂的准备(I)洗涤液25X浓缩洗液以1:25稀释作为工作洗涤液备用；
(2)铕标记物使用前一小时内用铕标记稀释液按1:10倍稀释并一次用完；
2.将试剂及所需数量的微孔反应条置室温平衡；
3.吸取100μ I丙型肝炎病毒抗原抗体校准品及待检样本，按顺序加入微孔反应条小孔中并加贴封片；
4.微孔反应条在室温条件下，用振荡仪缓慢振摇孵育60分钟；
5.在第一次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液350 μ 1，再吸干各孔，重复以上洗涤4次，最后一次将微孔反应条拍干；
6.每孔中加入100μ I铕标记物工作液，并加贴封片；
7.微孔反应条在室温条件下，用振荡仪缓慢振摇孵育60分钟；8.第二次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液350 μ 1，再吸干各孔，重复以上洗涤6次，最后一次将微孔反应条拍干；
9.每一孔中加入增强液100μI(加样过程中避免碰到小孔边缘或其中的试剂，尽量避免污染)；
10.微孔反应条在室温下，用振荡仪轻摇5分钟后测定荧光值，分析结果。具体实施实例 I制备包被板，所用的包被板为特异性抗原抗体包被的微孔板，丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条的制备包括以下步骤
(1)将纯化的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体AbI用50mmol/LTriS-HCl缓冲液稀释至3 μ g/ml、丙型肝炎病毒重组抗原AgI用50mmol/LTris-HCl缓冲液稀释至6 μ g/ml,然后将两种包被液按照1:1比例混合后加入包被板条各孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条；
(2)将丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测包被板条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷藏备用;
2丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测铕标记物的制备，包括以下步骤
(1)取待标记物抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体AbI稀释至5mg/ml、丙型肝炎病毒重组抗原AgI稀释至3mg/ml,按照1:1的体积混合。按总质量比为2:1的比例(DTTA-Eu:总抗原抗体)边振荡边加入DTTA-Eu，室温下在振板机上慢速振荡I小时，然后在黑暗中静置48小时；
(2)标记好的抗体与游离DTTA-Eu通过SephadexG50色谱柱(I. 5 X 50cm)分离,分离过程用核酸蛋白仪监控；
(3)用小试管依次收集流出物，同时测铕标记物浓度；
(4)加入O.5% BSA,按照抗原抗体总浓度为20 μ g/ml稀释备用，2-8°C保存。3.分析缓冲液的制备。4. HCV抗原抗体阴阳性对照品的制备。5. 25 X浓缩洗涤液。6.增强液的制备。7.检测操作过程
O.试剂的准备(I)洗涤液25X浓缩洗液以1:25稀释作为工作洗涤液备用；
(2)铕标记物使用前一小时内用铕标记稀释液按1:10倍稀释并一次用完；
2).将试剂及所需数量的微孔反应条置室温平衡；
3).吸取100μ I丙型肝炎病毒核心抗原校准品及待检样本，按顺序加入微孔反应条小孔中并加贴封片；
4).微孔反应条在室温条件下，用振荡仪缓慢振摇孵育60分钟；
5).在第一次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液350 μ 1，再吸干各孔，重复以上洗涤4次，最后一次将微孔反应条拍干；
6).每孔中加入100μ I铕标记物工作液，并加贴封片；7).微孔反应条在室温条件下，用振荡仪缓慢振摇孵育60分钟；
8).第二次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液350 μ 1，再吸干各孔，重复以上洗涤6次，最后一次将微孔反应条拍干； 9).每一孔中加入增强液100μI ;
10).微孔反应条在室温下，用振荡仪轻摇5分钟后测定荧光值，分析结果。
权利要求
1.“丙型肝炎病毒抗原抗体时间分辨免疫荧光分析法联合检测”，其特征在于如下检测原理本发明采用时间分辨免疫荧光分析法，联合检测丙型肝炎病毒抗原抗体；该发明建立双抗夹心的基础之上，在这里，样品中的抗原抗体首先被包被于微孔板上的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abl、丙型肝炎病毒重组抗原AgI捕获；在洗掉样品的其它部分，再加入铕标记物(铕标记抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体Abll、丙型肝炎病毒重组抗原Agll)，就可以形成单克隆抗体AbI-丙型肝炎病毒抗原-单克隆抗体AbII铕标记物复合物与重组抗原AgI-丙型肝炎病毒抗体-重组抗原AgII铕标记物复合物，洗板加入增强液，用时间分辨分析仪测量荧光值，荧光值与样本中抗原抗体总浓度呈正相关，从而计算抗原抗体浓度。
2.丙型肝炎病毒抗原抗体时间分辨免疫荧光分析法联合检测检测试剂盒，其特征在于包括盒体，设在盒体内的包被板和设在盒体内试剂及不干胶封片和使用说明书。
3.根据权利要求2所述包被板，其特征在于包被板上包被的是抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体与丙型肝炎病毒重组抗原，制备工艺是将包被抗体用Tris-HCl缓冲溶液稀释作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭。
4.根据权利要求3所述Tris-HCl缓冲溶液，其特征在于Tris-HCl缓冲溶液为PH为7. 2 浓度为 50mmol/L Tris-HCl。
5.根据权利要求3所述包被液，其特征在于包被液中抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体与丙型肝炎病毒重组抗原的浓度均为O. 1-20 μ g/mlo
6.根据权利要求2所述设在盒体内试剂，其特征在于所述试剂包括铕标记物、HCV抗原抗体阴阳性对照品、分析缓冲液、25 X浓缩洗涤液、增强液。
7.根据权利要求6所述铕标记物，其特征在于用镧系元素离子Eu3+标记抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体与丙型肝炎病毒重组抗原取待标记抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体与丙型肝炎病毒重组抗原均稀释，用常规方法进行标记。
全文摘要
本发明公开了丙型肝炎病毒抗原抗体时间分辨免疫荧光分析法联合检测及检测试剂盒。本发明通过分析丙型肝炎病毒序列而得到2株抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体(AbI，AbII)，2种丙型肝炎病毒重组抗原(AgI，AgII)，且2株抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体与2种丙型肝炎病毒重组抗原之间两两不发生交叉反应。使用其中的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体AbI、丙型肝炎病毒重组抗原AgI作为包被原料，其中的抗丙型肝炎病毒抗原单克隆抗体AbII、丙型肝炎病毒重组抗原AgII作为标记原料，用双抗体夹心法检测丙型肝炎病毒抗原，用双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒抗体。
文档编号G01N21/64GK102928595SQ20121038547
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者张年 申请人:武汉康苑生物医药科技有限公司