测定食品中苏丹红1号的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法

专利名称：：测定食品中苏丹红1号的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法
技术领域：
：本发明涉及一种测定食品中苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。二
背景技术：
：苏丹红属于一类人工合成的偶氮类化合物，为红色油溶性染料，主要用于石油、机油和其他的一些工业溶剂中，目的是使其增色，也方用于鞋、地板等的增光。苏丹红染料包括苏丹红l-4号四种物质，均含偶氮及萘的化合物结构，对人体的肝肾器官有明显的毒性作用，具有致癌性。由于苏丹红价格低廉且不容易褪色，因此被一些不法商家用于食品染色，对人体健康造成较大威胁。我国及其他许多国家都禁止将其用于食品生产。2007年初，国家质检总局公布了辣椒粉、辣椒酱、油辣椒、豆瓣酱等预包装辣椒制品和散装辣椒粉的产品质量调査结果，结果显示，不合格项目全部集中在苏丹红l-4号，尤其是苏丹红l号。检测苏丹红的方法主要是高效液相色谱法(HPLC)，欧盟的标准方法(Eur叩eanCommission.NEWSnotification:03/99:CorrectedmethodforthedetectionofSudan.2005)是将检测物经过乙腈萃取，过滤，滤液用高效液相色谱法分析，以波长可变的紫外-可见光度检测器定性与定量，确证苏丹红可以使用液相色谱-电喷雾离子化质谱联用技术。我国质检总局发布的国家标准(GB/T19681-2005)，采用正相吸附和固相萃取原理，对苏丹红染料用高效液相色谱进行了检测。目前，还报道了一些与高效液相色谱联用的技术，均可以用于苏丹红的检测。但是色谱法仪器昂贵、样品预处理复杂、费时、检测成本高。酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，常被用于临床、药物、食品和环境等分析领域。本发明者以多克隆抗体为基础的测定食品中苏丹红1号含量的酶联免疫吸附分析法已申请中国专利，200710049361.5,但多克隆抗体存在一些不足，如与待测物的免疫亲和力不一致，抗体的总量有限，不能源源不断提供性能相同的抗体等。
发明内容本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种测定食品中苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法，其特点是以单克隆抗体和抗原与抗体之间特异性反应为基础而建立的分析方法。本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。测定食品中苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法(1)苏丹红l号修饰物的制备步骤1:将0.02~0.08mol丙二酸溶于20~80mL新蒸吡啶中，加入0.02-0.lmol对硝基肉桂酸和0.001~0.004mol醋酸胺，此混合物在温度100150'C回流1~7小时，冷却后，将反应物用醋酸重结晶，得到产物410g,熔程275~280°C;步骤2:将步骤1产物0.150.65g，5-35mg钯碳，2~15mL甲醇加入反应釜中，通入氢气，于温度100120'C反应15小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干溶液，用二氯甲垸甲醇=5:l的体积比过柱，收集TLC板实验中Rf值为0.3的产物，旋干溶液，得到乳白色固体；步骤3:将步骤2产物0.lg溶解在1.52.5mL浓盐酸中，在温度51(TC加入含0.01~0.06g亚硝酸钠的水溶液0.5mL，搅拌数分钟，得到淡黄色重氮盐溶液，将0.040.12g2-萘酚溶解于812n/。的氢氧化钠水溶液35mL中，冷却至5'C，再缓慢加入重氮盐溶液，得到0.120.30g苏丹红l号-3-丙酸，简写为Sudanl-C3，其反应式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(E)-3-(4-nitrophenyl)acrylicacid3-(4-aminophenyl)propanoicacid(2)免疫原和包被抗原的制备将0.10~0.45mmol的Sudanl-C3，0.10-0.80mmol的二环己基碳二亚胺，0.10~0.80mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于100~60(HiL的二甲基甲酰胺，室温搅拌过夜，将混合物离心520分钟，取上层清液，缓慢加入0.01~0.02%的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，搅拌110小时，离心分离，取上层清液，透析数天，其中，Sudan1-C3-BSA为免疫原，Sudan1-C3-OVA为包被抗原；(3)苏丹红1号单克隆抗体的制备免疫将免疫原溶解于生理盐水中，再与等体积的完全福氏佐剂混合，皮下多点免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50-100吗，第一次免疫后，每隔两周再次免疫，将完全福氏佐剂换成不完全福氏佐剂，第三次免疫后一周，尾部取血测鼠的抗血清效价，最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂；融合最后一次对小鼠加强免疫，三天后取脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5:110:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于温度37'C，5%0)2培养箱中培养；筛选融合后2周，用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测；单克隆抗体的大量生产先腹腔注射液体石蜡于BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水，用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的单克隆抗体，纯化抗体与等体积甘油1:1混合并置于温度-20'C保存；(4)建立基于单克隆抗体测定苏丹红1号的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)对所得单克隆抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定食品中苏丹红l号含量的ELISA。本发明的优点1.对苏丹红1号的分子结进行合理修饰。2.成功制备出抗苏丹红1号的单克隆抗体并建立测定食品中苏丹红1号含量的ELISA。3.灵敏度高、特异性强。4.样品处理简单、测试量大、测试费用低。5.对样品的测定，ELISA与HPLC有很好的相关性。7四图l.为免疫原的紫外-可见光谱图a.BSA;b.Sudan1号；c.SudanI—C3—BSA由图1得知，在280nm(BSA)，320nm和492nm处(Sudan1号)均有特征吸收，表明苏丹红l号已成功与蛋白交联。图2.为测定苏丹红1号的ELISA标准曲线由图2得知，9次ELISA测定的平均标准曲线，IC5。值(标准曲线中吸光度降低50%所对应的苏丹红1号的浓度，IC5。值越小，灵敏度越高)为1.l~2.0ng/mL,检出限(LOD)为0.07~0.14ng/mL.图3.为有机溶剂甲醇和乙腈对ELISA灵敏度(ICs。)的影响由图3得知，10%以下的乙腈和30%以下的甲醇对免疫测定影响较小，表明抗体对有机溶剂的耐受性较好。图4.为ELISA和HPLC对9个加标样品中苏丹红1号的检测结果的相关曲线由图4得知，两种方法相关性较好，回归方程为Y=0.8492X+0.3525(r=0.9840,n=9)，五具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述.，有必要在此指出的是本实施只用于对发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。实施例1.苏丹红l号修饰物的制备苏丹红1号是小分子化合物，没有免疫原性，不能直接免疫动物产生抗体，必须对苏丹红1号的分子结构进行合理、有效的化学修饰。一般要求尽量保持小分子化合物的原有结构，但要在小分子化合物的某个位置上连上一个3-5个碳原子的手臂，且在手臂的终瑞带有活性基团，使之与载体蛋白交联，制得免疫原和包被抗原。本发明在苏丹红1号苯环上与偶氮基相对的位置连接上一个终端带羧基3个碳原子的手臂。苏丹红1号修饰物的制备步骤1:将0.02-0.08mol丙二酸溶于20~80mL新蒸吡啶中，加入0.02~0.1mol对硝基肉桂酸和0.001~0.004mol醋酸胺，此混合物在温度100150'C回流1~7小时，冷却后，将反应物用醋酸重结晶，得到产物410g，熔程275~280°C;步骤2:将步骤1产物0.15~0.65g，5-35mg钯碳，2~15mL甲醇加入反应釜中，通入氢气，于温度100120'C反应15小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干溶液，用二氯甲烷甲醇=5:1的体积比过柱，收集TLC板实验中Rf值为0.3的产物，旋干溶液，得到乳白色固体；步骤3:将步骤2产物0.lg溶解在1.5~2.5mL浓盐酸中，在温度51(TC加入含0.01-0.06g亚硝酸钠的水溶液0.5mL，搅拌数分钟，得到淡黄色重氮盐溶液，将0.040.12g2-萘酚溶解于812。/。的氢氧化钠溶液35mL中，冷却至5'C，再缓慢加入重氮盐溶液中，得到0.12~0.30gSudanl-C3。Sudanl-C3的表征^-NMR用BrukerAMX-300核磁共振仪测试SudanI-C3的核磁谱，以氘代氯仿溶液为溶剂，内标为TMS。'H-画R(200MHz,CDC13):S14.30(b，1H)，8.55(d,J=4.2Hz,1H)，7.73-7.50(m，4H),7.41-7.14(m，4H)，6.89(d,J=3.96,1H),3.45(b,1H)，3.05(t，J=7.50Hz，2H),2.76(t,J=7.46Hz，2H)。6.8~8.0之间的峰表明物质结构中有苯环和萘环；3.0以下的峰表示有脂肪族烷烃结构，有两个峰，表明有两种不同的氢，谱图信息符合目标产物Sudanl-C3结构；2.免疫原和包被抗原的制备带有活性基团的苏丹红1号修饰物与载体蛋白交联，形成苏丹红1号-载体蛋白结合物，用作免疫原和包被抗原称取0.10-0.45mmo1的Sudanl-C3，0.10-0.80mmol的二环己基碳二亚胺，0.10-0.80mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，溶于100-600^的二甲基甲酰胺，室温下搅拌过夜，将混合物离心5-20分钟，取上层清液，缓慢加入0.01-0.02%的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA),搅拌1-10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，其中，SudanI-C3-BSA为免疫原，SudanI-C3-0VA为包被抗原。图1为BSA、Sudan1号和Sudanl-C3-BSA的紫外-可见光谱图，a.BSA;b.Sudan1号；c.SudanI~C3-BSA;包被抗原Sudanl-C3-0VA的紫外-可见光谱图与图1相似。3.苏丹红1号单克隆抗体的制备免疫将免疫原溶于生理盐水中，再与等体积的完全福氏佐剂混合，皮下多点免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50100吗，第一次免疫后，每隔两周再次免疫，将完全福氏佐剂换成不完全福氏佐剂，第三次免疫后一周，尾部取血测鼠的抗血清效价，最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂。融合最后一次对小鼠加强免疫，三天后取脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)按5:110:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于37'C，5%C02培养箱中培养。筛选融合后2周左右，用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测。单克隆抗体的大量生产先腹腔注射液体石蜡于BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水。用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的单克隆抗体，纯化抗体与等体积甘油1:1混合并置于-2(TC保存。4.优化实验条件，建立测定苏丹红1号的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定食品中苏丹红1号含量的ELISA。(1)溶液配制(a)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液称取2.606gNa2CO310H20,3.434gNaHC03,用800mL超纯水混匀溶解后，调节pH值，加水至1L，配成0.05mol/L，pH=9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；(b)磷酸缓冲液(储备液，PBSX10)称取21.961gNa2HP0412H20，6.031gNaH2P042H20,87.666gNaCl,加800mL超纯水混合，加热溶解；用lmol/L的NaOH调节pH-7.4，加超纯水至1L，配成含O.15mol/LNaCl，pH=7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液(储备液);(c)酪蛋白溶液称取酪蛋白加热溶解于0.01mol/L的PBS中，配成0.5-2%酪蛋白溶液；(d)磷酸缓冲液-吐温储备液(含l%Tween20的0.1mol/L磷酸缓冲储备液，PBSTX10，pH=7.4);(e)甲醇溶液移取分析纯甲醇溶液10mL于200mL容量瓶，加超纯水定容，配成5%的甲醇溶液；(f)苏丹红l号储备液称取0.380g苏丹红1号标准品(sigma)，溶于3.80mL的二甲基甲酰胺中，配成0.lmg/mL的苏丹红1号储备液；(g)底物溶液(20mL纯水；lmL醋酸钠缓冲液；200pL四甲基联苯胺(TMB)(1%);20pL过氧化氢(5%));①醋酸钠缓冲液称取3.450gCH3COONa3H20，用lOOmL超纯水溶解，再用lmol/L拧檬酸(21.031gC6H807札0溶解于100mL水中)调节pb5.8后，再用水定容到250mL，配成0.lmol/L醋酸钠缓冲液；②TMB:称取0.0717gTMB，用7.17mL二甲基亚砜溶解，混匀，配成1%，w/v;③过氧化氢取20pL30。/。的过氧化氢加入100pL超纯水中，混匀，配成5%;(h)H2SCV溶液移取25mL浓H2S04,溶解于475mL的超纯水中，配成5%H2S04溶液。(i)RPMI-1640培养液RPMI-1640固体粉末10.4g溶于800ml超纯水中，加入HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)4.67g，并按终体积1L计算加入200mmol/LL-谷氨酸、100mmol/L2-巯基乙醇及1mmol/L(艮卩0.1g/L)丙酮酸钠，再加入10万IU青霉素以及10"IU链霉素，补加超纯水使终体积达1000mL，磁力搅拌34小时，充分溶解后再加入NaHC03约2g调节培养液pH至7.27.4，0.22pm滤器过滤除菌，无菌分装，-2(TC密封保存。(2)主要仪器洗板机A5082，Tecan，Austria;酶标仪A2082,Tecan，Austria;高效液相色谱仪Alltech-001(3)间接ELISA筛选单克隆抗体(a)用包被抗原包板，每孔100nL，4'C过夜；(b)PBST缓冲液(PBST储备液1:IO稀释)满孔洗涤三次；(c)加入酪蛋白封阻，每孔120pL，4'C过夜；(d)加入杂交瘤细胞上清，每孔50pL，37'C放置2小时；(e)PBST缓冲液洗板三次；(f)加入酶标二抗(羊抗鼠lgG-辣根过氧化物酶)，每孔100pL，37'C放置1小时；(g)PBST缓冲液洗板三次；(h)加入底物液显色，每孔100pL，振摇15-20分钟；(i)加入5。/。H2S04溶液，每孔50pL，终止反应；(j)用酶标仪测定吸光度值，做出标准曲线，进行结果分析与讨论。(4)间接竞争ELISA步骤(a).用包被抗原包板，每孔200nL，4'C过夜；(b)PBST缓冲液(PBST储备液1:IO稀释)满孔洗涤三次；(c)加入酪蛋白封阻，每孔280^L，室温放置l小时；(d)PBST缓冲液洗板三次；(e)依次每孔加入100pL的标准溶液和100pL的一定稀释度的单克隆抗体，室温放置1小时；(f)PBST缓冲液洗板三次；(g)加入酶标二抗(羊抗鼠lgG-辣根过氧化物酶)，每孔200pL，室温放置1小时；(h)PBST缓冲液洗板三次;(i)加入底物液显色，每孔200pL，振摇15-20分钟；(j)加入5。/。H2S04溶液，每孔80pL，终止反应；(k)用酶标仪测定吸光度值，做出标准曲线，进行结果分析与讨论。(5)ELISA实验条件的优化本发明中的包被抗原为SudanI-C3-0VA,实验中对包被抗原的浓度、抗体的稀释度、酶标二抗的稀释度等作了优化，优化结果为包被抗原的浓度为20ng/mL，单克隆抗体的稀释度为l:50000，酶标二抗的稀释度为l:20000，实验温度在室温下进行。以后的实验均在此条件下进行。(6)ELISA的标准曲线及灵敏度苏丹红1号标准溶液的浓度为0，0.1，0.3，1,0，3.0，10，30，100ng/mL，由苏丹红1号的储备液(1.0mg/mL)经过5%的甲醇稀释而得。平行做9次，以苏丹红1号浓度的对数为横坐标，以相对信号B/B。X100M为纵坐标做标准曲线(B。标液浓度为0ng/mL所对应的吸光度值；B:其他各浓度对应的吸光度值)。图2为9次ELISA测定的平均标准曲线，ICso在1.1-2.0ng/mL之间。(7)溶剂效应选用常用的萃取溶剂甲醇和乙腈，测试了它们对ELISA的影响。用含O，1，2，5，10，20，30，40，50%的甲醇或乙腈水溶液，配置浓度为0.1-100ng/mL的苏丹红l号标准溶液，进行ELISA操作过程并作出标准曲线，如图3所示，结果表明，1210%以下的乙腈和30%以下的甲醇对ELISA的灵敏度影响较小。由于甲醇较乙腈价廉且ELISA对甲醇的耐受性更高，本发明选用甲醇做样品处理的萃取溶剂。(8)ELISA的特异性ELISA特异性可用交叉反应率来表示。交叉反应率(CR%)=(苏丹红1号的ICso/测试物质的IC5Q)X100%。交叉反应率越小，ELISA的特异性越高。在本发明选择苏丹红2-4号和其他6种食品常用色素(拧檬黄，日落黄，靛蓝，亮兰，苋菜红，胭脂红)进行交叉反应实验，结果如表1所示。该单克隆抗体与苏丹红2-4号的交叉反应率为0.95~33.9%，与其他6种食用色素的交叉反应率均小于0.01%，说明所得抗体对苏丹红1号的特异性较高。5.ELISA对加标样品中苏丹红1号含量的测定随机选择了10种食品辣椒面I，辣椒面II，辣椒酱I，辣椒酱II，番茄酱I，番茄酱n，火锅料i，火锅料n，香肠i，香肠n，经elisa检测，辣椒酱n为阳性样品，苏丹红1号含量为1.03pg/g样品；其余样品中的苏丹红1号含量ELISA均无法检出，为阴性样品。最后选择6种样品即辣椒面i，辣椒酱i，辣椒酱n，番茄酱I，火锅料I和香肠I做加标实验。同一样品取两份，一份加入适量的苏丹红I的甲醇溶液，一份加入等体积的甲醇，静置过夜，超声30分钟左右，涡旋混合l分钟，静置后，取上清离心20分钟，上清用5%甲醇稀释后用ELISA直接测定，结果如表2所示，回收率在88.2-110.5%，相对标准偏差为1.5-17.4%，说明该ELISA方法的准确性和精密度都较好。6.ELISA和HPLC的比较苏丹红1号的HPLC条件为色谱条件HypersilGold柱，柱温为室温，流动相为甲醇2%的乙酸水溶液=90:10，流量lmL/min，进样20pL，紫外检测波长480nm，标准溶液的浓度为0.01，0.05,0.1，0.5，1.0，2.0，5.0pg/mL，样品萃取液用0.45pm的滤膜过滤后直接测定；所建立的ELISA的可靠性用HPLC进行进一步验证。9种加标样品即辣椒面I，加标浓度5Mg/g和20Mg/g;辣椒酱I，加标浓度2^g/g和10pg/g;辣椒酱II,加标浓度0呢/g和2^g/g;番茄酱I，加标浓度5pg/g;火锅料I，加标浓度10Mg/g;香肠I，加标浓度5Mg/g用甲醇萃取并用ELISA和HPLC测定，测定结果以ELISA为横坐标，HPLC为纵坐标作图得两者的相关曲线，如如图4所示，回归方程为Y-0.8492X+0.3525(r=0.9840，n=9),说明二者的相关性很好。表i抗体与苏丹红n,m，iv及其他6种食品常用色素的交叉反应率化合物化学结构式IC50CR(%)苏丹红I苏丹红II苏丹红ni苏丹红iv靛蓝胭脂红苋菜红日落黄,OH,OH>—N—N"^^^~CH3.0HQH3gH3^3，Na03S~、^~N=N~,N、^~S,0Na03Na03S03Na1.9100209.5;633.92000.95>10000<0.01>10000<0.01>10000<0.01>10000<0.01>10000<0.01>10000<0.01,03Na表2加标实验的回收结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>a辣椒酱II的未加标样品中苏丹红1号的测定值为1.03pg/g，加标后回收率(11°/。)=(加标后测定浓度-1.03)/加标浓度X100%。权利要求1.测定食品中苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)苏丹红1号修饰物的制备步骤1将0.02～0.08mol丙二酸溶于20～80mL新蒸吡啶中，加入0.02～0.1mol对硝基肉桂酸和0.001～0.004mol醋酸胺，此混合物在温度100～150℃回流1～7小时，冷却后，将反应物用醋酸重结晶，得到步骤1产物4～10g，熔程275～280℃；步骤2将步骤1产物0.15～0.65g，5～35mg钯碳，2～15mL甲醇加入反应釜中，通入氢气，于温度100～120℃反应1～5小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干溶液，用二氯甲烷∶甲醇＝5∶1的体积比过柱，收集TLC板实验中Rf值为0.3的产物，旋干溶液，得到乳白色固体；步骤3将步骤2产物0.1g溶解在1.5～2.5mL浓盐酸中，在温度5～10℃加入含0.01～0.06g亚硝酸钠的水溶液0.5mL，搅拌数分钟，得到淡黄色重氮盐溶液，将0.04～0.12g2-萘酚溶解于8～12％的氢氧化钠水溶液3～5mL中，冷却至5℃，再缓慢加入重氮盐溶液中，得到0.12～0.30g苏丹红1号-3-丙酸，简写为Sudan1-C3，其反应式如下(2)免疫原和包被抗原的制备将0.10～0.45mmol的Sudan1-C3，0.10～0.80mmol的二环己基碳二亚胺，0.10～0.80mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于100～600μL的二甲基甲酰胺，室温搅拌过夜，将混合物离心5～20分钟，取上层清液，缓慢加入0.01～0.02％的牛血清白蛋白或卵清蛋白，搅拌1～10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，其中，Sudan1-C3-牛血清白蛋白为免疫原，Sudan1-C3-卵清蛋白为包被抗原；(3)苏丹红1号单克隆抗体的制备免疫将免疫原溶解于生理盐水中，再与等体积的完全福氏佐剂混合，皮下多点免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50～100μg，第一次免疫后，每隔两周再次免疫，将完全福氏佐剂换成不完全福氏佐剂，第三次免疫后一周，尾部取血测鼠的抗血清效价，最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂；融合最后一次对小鼠加强免疫，三天后取脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1～10∶1的比例混合，在50％聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于温度37℃，5％CO2培养箱中培养；筛选融合后2周，用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测；单克隆抗体的大量生产先腹腔注射液体石蜡于BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水，用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的单克隆抗体，纯化抗体与等体积甘油1∶1混合并置于温度-20℃保存；(4)建立测定苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定食品中苏丹红1号含量的ELISA；(5)溶剂效应选用常用的萃取溶剂甲醇和乙腈，测试了它们对ELISA的影响；用含0，1，2，5，10，20，30，40，50％的甲醇或乙腈水溶液，配置浓度为0.1～100ng/mL的苏丹红1号的标准溶液，进行ELISA操作过程并作出标准曲线；结果表明，10％以下的甲醇和30％以下的乙腈对ELISA的灵敏度影响较小；(6)ELISA对加标样品中苏丹红1号含量的测定随机选择了10种食品辣椒面I，辣椒面II，辣椒酱I，辣椒酱II，番茄酱I，番茄酱II，火锅料I，火锅料II，香肠I，香肠II，经ELISA检测，辣椒酱II为阳性样品，苏丹红1号含量为1.03μg/g样品，其余样品中的苏丹红1号含量ELISA均无法测出，为阴性样品，最后选择6种样品即辣椒面I，辣椒酱I，辣椒酱II，番茄酱I，火锅料I和香肠I做加标实验，同一样品取两份，一份加入适量的苏丹红1号的甲醇溶液，一份加入等体积的甲醇，静置过夜，超声震荡30分钟，涡旋混合1分钟，静置后，取上层清液离心20分钟，上层清液用5％甲醇稀释后用ELISA直接测定，回收率在88.2-110.5％，相对标准偏差为1.5-17.4％，说明该方法的准确性和精密度都较好；(7)ELISA和HPLC的比较苏丹红1号的HPLC条件为色谱条件HypersilGold柱，柱温为室温，流动相为甲醇∶2％的乙酸水溶液＝90∶10，流量1mL/min，进样20μL，紫外检测波长480nm，标准溶液的浓度为0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0μg/mL，样品萃取液用0.45μm的滤膜过滤后直接测定；所建立的ELISA的可靠性用HPLC进行进一步验证，9种加标样品，即辣椒面I，加标浓度5μg/g和20μg/g；辣椒酱I，加标浓度2μg/g，10μg/g；辣椒酱II，加标浓度0μg/g，2μg/g；番茄酱I，加标浓度5μg/g；火锅料I，加标浓度10μg/g和香肠I，加标浓度5μg/g；加标样品用甲醇萃取并用ELISA和HPLC测定，测定结果以ELISA为横坐标，HPLC为纵坐标作图得两者的相关曲线，回归方程为Y＝0.8492X+0.3525，相关系数为0.9840，n＝9，说明二者的相关性很好。全文摘要本发明公开了测定食品中苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是合成苏丹红1号的修饰物并将其与蛋白联接，制得免疫原及包被抗原。通过杂交瘤技术包括免疫、融合、筛选等步骤获得抗苏丹红1号的单克隆抗体。该抗体用于苏丹红1号的免疫分析，标准曲线的浓度范围为0.1～100ng/mL，IC₅₀为1.1～2.0ng/mL；抗体与苏丹红2-4号的交叉反应率为0.95～33.9％，与其他6种食品可添加色素几乎没有交叉反应；说明所建立的ELISA不仅灵敏度高而且特异性强。6种市售食品加标后用甲醇萃取，萃取液经适当稀释用ELISA测定，苏丹红1号的加标回收率为88.2～110.5％，相对标准偏差为1.5～17.4％。用HPLC和ELISA对9种加标样品进行分析，两种方法相关性较好(r＝0.9840，n＝9)。文档编号G01N33/535GK101358978SQ200810046008公开日2009年2月4日申请日期2008年9月9日优先权日2008年9月9日发明者红杨,王玉珍,邓安平申请人:四川大学