一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒，主要采用直接竞争酶联免疫测定法，将以前酶联免疫法中繁琐的操作步骤进行精简、优化，检测快速、灵敏、准确，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。
【专利说明】一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生化检测【技术领域】，特别涉及一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检 测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人们通常认为吗啡对高等哺乳动物而言是剧烈的毒品，仅能从植物中提取。但是 经过深入研究表明，在低等软体动物和高等哺乳动物中，除神经肽，氨基酸及其他小分子神 经介质传递机制外，还存在以内生吗啡类物质为介质的神经传递机制。人们的痛觉、精神上 的愉快和抑郁以及生理上的快感，在一定程度上取决于大脑产生内生吗啡的多少，因此，内 生吗啡的产生、增加及减少，在一些特定的情况下对疼痛有着不同的反应和感觉。
[0003] 之前的研究发现贻贝、龙虾等海洋软体动物神经节自身可产生微量的内生吗啡； 在大白鼠大脑区的杏仁核区内存在内生吗啡，而且内生吗啡可使杏仁核区产生一氧化氮； 在人的白细胞中也能检测到微量的内生吗啡。目前报道用于检测内生吗啡的方法主要高效 液相色谱（HPLC)、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC/MS)。色谱法是目前国际上普遍采用 的检测方法，灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法，但其对仪器和操作人 员要求都较高，成本也比较高，一个样品检测要几百元，检测时间也很长，不利于在基层单 位推广使用。免疫分析法是国际上通用的一种生化方法。目前常用的胶体金法受所用的生 物制剂的影响，假阳性出现的概率很高，而且由于胶体金法灵敏度低，颜色判断有人为因素 致使准确性差。
[0004] 因此建立一种快速、灵敏、准确，并可以大批量应用于内生吗啡检测的方法是具有 非常重要的现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种海水鱼内生吗啡的检测方法，样品前处理过程简单， 能同时快速检测大批样品，主要采用直接竞争酶联免疫测定法，将以前酶联免疫法中繁琐 的操作步骤进行精简、优化，检测快速、灵敏、准确。
[0006] 本发明还提供了一种海水鱼内生吗啡检测试剂盒，试剂盒具有保存时间长、自动 化程度高、成本低、无放射性同位素污染、快速简便、灵敏度高、准确可靠等特点。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种海水鱼内生吗啡的检测方法，包括以下步骤： (1)样品前处理 取海水鱼的脑部神经节，用甲醇清洗，浙干，然后将脑部神经节撕碎，称取〇. 2±0. 05g 撕碎的脑部神经节，加入0. 5-2ml甲醇，70-75°C水浴2-3小时，冷却至室温，离心，取上清液 于冷冻离心浓缩机中离心直至液体挥发完全，残渣用100-200 μ 1样品稀释液稀释，振荡器 上振荡充分溶解得样品溶液。
[0008] 现有高效液相色谱的处理样品的方法用于本发明的检测样品的处理，无法检测到 内生吗啡，因此，本发明首先改进了样品的前处理方法，以适合于下一步的试剂盒的检测。
[0009] (2)试剂盒检测 包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号， 每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置； 将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔20-30 μ 1的量加到对应微孔中，然后加 入吗啡抗原酶标记物100-120 μ 1/孔，室温孵育30-35分钟后倒去孔内液体，用洗涤液 250-300 μ 1/孔洗涤3-5次，加入显色剂100-120 μ 1/孔，室温孵育10-15分钟，然后加终止 液100-120 μ 1/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值。
[0010] (3)结果分析 以标准品百分吸光率为纵坐标，以吗啡标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图， 将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应 的稀释倍数即为样品中内生吗啡的实际含量。
[0011] 作为优选，所述样品稀释液为pH7. 4、0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液。
[0012] 作为优选，所述吗啡抗原酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶。
[0013] 作为优选，所述显色剂为四甲基联苯胺。
[0014] 作为优选，所述终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠 溶液。
[0015] 作为优选，包被有吗啡特异性抗体的酶标板制备方法为：用包被缓冲液将吗啡单 克隆抗体稀释至1 μ g/ml得包被液，酶标板每孔加入100 μ 1包被液，37°C孵育2h或者4°C 过夜，倒去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔中加入200 μ 1封闭液，37°C温育2h， 倒去孔内液体，干燥后得包被有吗啡特异性抗体的酶标板。
[0016] 作为优选，所述洗涤液为含有体积分数0· 5%吐温-20的ρΗ7· 4、0· Olmol/L的磷酸 盐缓冲液稀释10倍后所得。
[0017] 作为优选，所述包被缓冲液为pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液为 含有3wt%的聚乙二醇、1 wt %的酪蛋白、4 wt %的甘氨酸、1 wt %的卵清蛋白及1 wt %的 明胶的磷酸盐缓冲液。
[0018] 作为优选，所述吗啡单克隆抗体的制备方法为： A、 吗啡抗原的合成 称取吗啡原料500mg，加入50mL苯和lg琥珀酸酐，加热回流8h，蒸发除去苯，残留物分 别用无水乙醚、无水乙醇洗涤，然后真空干燥，即得到粉末状的6-琥珀酸-吗啡，称取6-琥 珀酸-吗啡20mg溶于10ml PBS缓冲液中，加入30 μ 1三乙胺，再加入30 μ 1氯甲酸异丁酯， 反应半小时得反应液；称取20mg BSA溶解于10ml PBS缓冲液中，加入上述反应液，搅拌反 应过夜，透析3天，离心，收集上清液，得到吗啡抗原； B、 取6-8周龄雌性BALB/c小鼠六只，将PBS缓冲液与等体积弗氏完全佐剂混合，充 分乳化后，采用腹腔注射的方法进行免疫，按lmg/kg体重的量进行首次免疫，用弗氏不完 全佐剂代替弗氏完全佐剂，采用与首次免疫相同的方法每隔两周加强免疫一次，共加强免 疫四次，从第三次免疫开始，每次免疫后7天，小鼠尾静脉取血lml，进行抗体效价检测，选 择经ELISA检测效价最高的BALB/c小鼠用于制备脾细胞，3天后取效价最高的BALB/c小 鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选获得杂交瘤细胞；另一批BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL 液体石蜡致敏，7-14天后向小鼠腹腔内注射1X106个杂交瘤细胞，7-10天后开始用注 射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1-3天抽取腹水1次，离心，收集上清液，_20°C保存， 进一步采用辛酸-硫酸铵法纯化上清液获得吗啡单克隆抗体。
[0019] 用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，采用与首次免疫相同的方法每隔两周加强 免疫一次即将PBS缓冲液与等体积弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方 法进行免疫，按lmg/kg体重的量进行加强免疫。
[0020] 根据本发明上述方法制备的吗啡单克隆抗体，特异性好，检测效果佳。
[0021] 一种海水鱼内生吗啡检测试剂盒，包括如下组分： 1、 吗啡标准品溶液，浓度分别为：〇 ng/ml，L25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml， 20 ng/ml ； 2、 包被有吗啡特异性抗体的酶标板； 3、 吗啡抗原酶标记物； 4、 显色剂：四甲基联苯胺； 5、 浓缩洗涤液10X :含有体积分数0. 5%吐温-20的pH7. 4、0. Olmol/L的磷酸盐缓冲 液； 6、 终止液：浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液； 7、 样品稀释液：pH7. 4、0. Olmol/L的磷酸盐缓冲液。
[0022] 本发明的有益效果是： 1、本发明方法可以定性、定量检测海水鱼中内生吗啡的含量，对样品的前处理要求低， 样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。
[0023] 2、主要采用直接竞争酶联免疫测定法，将以前酶联免疫法中繁琐的操作步骤进行 精简、优化，主要试剂又以溶液的形式提供，可减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间 并降低因操作步骤繁琐而造成的误差。
[0024] 3、试剂盒保存时间长、自动化程度高、成本低、无放射性同位素污染等优点。
[0025] 4、具有高特异性、高灵敏度、高准确度等特点，将在内生吗啡检测中发挥重要作 用。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1是本发明吗啡标准品的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0028] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0029] 一种海水鱼内生吗啡检测试剂盒，包括如下组分： 1、吗啡标准品溶液，浓度分别为：〇 ng/ml，L25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml， 20 ng/ml〇
[0030] 2、包被有吗啡特异性抗体的酶标板，1块，96孔。
[0031] 3、吗啡抗原酶标记物，吗啡抗原酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶。
[0032] 4、显色剂：四甲基联苯胺(市售）。
[0033] 5、浓缩洗涤液10 X :含有体积分数0. 5%吐温-20的pH7. 4、0. 01mol/L的磷酸盐 缓冲液（PBS)。
[0034] 浓缩洗涤液10X的配制为：将(λ 5ml吐温-20与pH7. 4、(X 01mol/L的磷酸盐缓 冲液99. 5ml混合均勻。
[0035] 6、终止液：浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液。
[0036] 7、样品稀释液：pH7. 4、0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS，市售）。
[0037] 洗涤液的配制为：用去离子水将浓缩洗涤液10X按1:9体积比进行稀释，即：1份 浓缩洗涤液10 X+9份去离子水；用于酶标板的洗涤，洗涤液在4°C环境可保存一个月。
[0038] -、包被有吗啡特异性抗体的酶标板制备方法为： 溶液准备： 1、包被缓冲液为pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液(市售）。
[0039] 2、封闭液：3g聚乙二醇+lg酪蛋白+4g甘氨酸+lg卵清蛋白+lg明胶+90g磷酸 盐缓冲液（pH7. 4,0. 01mol/L)混合而成得到含有3wt%的聚乙二醇、1 wt %的酪蛋白、4 wt %的甘氨酸、1 wt %的卵清蛋白及1 wt %的明胶的磷酸盐缓冲液。
[0040] 用包被缓冲液将吗啡单克隆抗体稀释至1 μ g/ml得包被液，酶标板每孔加入 100 μ 1包被液，37°C孵育2h或者4°C过夜，倒去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔 中加入200 μ 1封闭液，37°C温育2h，倒去孔内液体，干燥后得包被有吗啡特异性抗体的酶 标板。
[0041] 二、吗啡单克隆抗体的制备方法为： A、吗啡抗原的合成 称取吗啡原料500mg，加入50mL苯和lg琥珀酸酐，加热回流8h，蒸发除去苯，残留物分 别用无水乙醚、无水乙醇洗涤，然后真空干燥，即得到粉末状的6-琥珀酸-吗啡，称取6-琥 珀酸-吗啡 20mg 溶于 10ml PBS 缓冲液（20 mmol/L NaH2P04, 20 mmol/L Na2HP04, 150 mmol/L NaCl; pH 7. 2)中，加入30μ1三乙胺，再加入30μ1氯甲酸异丁酯，反应半小时得 反应液；称取20mg BSA溶解于 10ml PBS缓冲液（20 mmol/L NaH2P04, 20 mmol/L Na2HP04, 150 mmol/L NaCl; pH 7. 2)中，加入上述反应液，搅拌反应过夜，透析3天，离心，收集上清 液，得到吗啡抗原。
[0042] B、取6-8周龄雌性BALB/c小鼠六只（浙江大学实验动物中心提供)，将PBS缓 冲液（20臟〇1/1似4?04，20臟〇1/1似2册04，150臟〇1/1恥(：1;?!17.2)与等体积弗 氏完全佐剂(市售）混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方法进行免疫，按lmg/kg体重的量 进行首次免疫，用弗氏不完全佐剂(市售）代替弗氏完全佐剂，采用与首次免疫相同的方法 每隔两周加强免疫一次，共加强免疫四次，从第三次免疫开始，每次免疫后7天，小鼠尾静 脉取血lml，进行抗体效价检测，选择经ELISA检测(现有方法）效价最高的BALB/c小鼠用 于制备脾细胞，3天后取效价最高的BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(市售）融合，筛选 获得杂交瘤细胞(融合及筛选均为现有常规方法）；另一批BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL液 体石蜡致敏，7-14天后向小鼠腹腔内注射1-2X10 6个杂交瘤细胞，7-10天后开始用注 射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1-3天抽取腹水1次，4000rmp离心15min，收集上清 液，-20°C保存，进一步采用辛酸-硫酸铵法(现有方法）纯化上清液获得吗啡单克隆抗体。
[0043] 三、吗啡抗原酶标记物的制备： 称取辣根过氧化物酶25mg溶于1. 25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜，经S印hadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱，流速控制在lml/min，收集棕色流出液，以聚二乙醇浓缩至 5ml得浓缩液。称取12. 5mg的吗啡抗原，用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入上述浓 缩液中。然后加入lmol/L的碳酸盐缓冲液0. 25ml，持续搅拌3h，加0. 2mol/L的赖氨酸溶 液0. 25ml，混匀后置于室温2h。在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4°C放置lh。 3000r/min离心半小时，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵溶液洗两次后用0. 15mol/L的PBS缓 冲液溶解，之后装入透析袋中，用〇. 15mol/L的PB缓冲液S透析，去除铵离子后，10000r/ min离心半小时去除沉淀，上清液即为吗啡抗原酶标记物。
[0044] 实施例1 : 一种海水鱼内生吗啡的检测方法，包括以下步骤： (1)样品前处理 取大黄鱼的脑部神经节，用甲醇(分析纯）清洗，浙干，然后用镊子将脑部神经节撕 碎，称取0. 2±0. 05g撕碎的脑部神经节，加入0. 5ml甲醇，70°C水浴3小时，冷却至室温， 5000rpm离心2min，取上清液于冷冻离心浓缩机（Labconco CentriVap，美国）中lOOOOrpm 离心直至液体挥发完全，残渣用1〇〇 μ 1样品稀释液稀释，振荡器上振荡充分溶解得样品溶 液。
[0045] (2)试剂盒检测 包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号， 每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置； 将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔20 μ 1的量加到对应微孔中，然后加入吗啡 抗原酶标记物1〇〇μ 1/孔，室温孵育30分钟后倒去孔内液体，使得待测样品中的内生吗啡 与酶标记的竞争酶标板上的吗啡抗体有效结合，用洗涤液250 μ 1/孔洗涤5次，除去未结合 的酶标记物，加入显色剂100 μ 1/孔，室温孵育10分钟，然后加终止液（2mol/L的硫酸溶液） 100/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值。
[0046] (3)结果分析 百分吸光率的计算，标准品或样品的百分吸光率等于标准品或样品的吸光度值的平均 值(双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即
【权利要求】
1. 一种海水鱼内生吗啡的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 样品前处理 取海水鱼的脑部神经节，用甲醇清洗，浙干，然后将脑部神经节撕碎，称取0. 2±0. 05g 撕碎的脑部神经节，加入0. 5-2ml甲醇，70-75°C水浴2-3小时，冷却至室温，离心，取上清液 于冷冻离心浓缩机中离心直至液体挥发完全，残渣用100-200 μ 1样品稀释液稀释，振荡器 上振荡充分溶解得样品溶液； (2) 试剂盒检测 包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号， 每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置； 将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔20-30 μ 1的量加到对应微孔中，然后加 入吗啡抗原酶标记物100-120 μ 1/孔，室温孵育30-35分钟后倒去孔内液体，用洗涤液 250-300 μ 1/孔洗涤3-5次，加入显色剂100-120 μ 1/孔，室温孵育10-15分钟，然后加终止 液100-120 μ 1/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值； (3) 结果分析 以标准品百分吸光率为纵坐标，以吗啡标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图， 将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应 的稀释倍数即为样品中内生吗啡的实际含量。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述样品稀释液为pH7. 4、0. Olmol/ L的磷酸盐缓冲液。
3. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述吗啡抗原酶标记物的标记 酶为辣根过氧化物酶。
4. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述显色剂为四甲基联苯胺。
5. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述终止液为浓度为2mol/L的 硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液。
6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：包被有吗啡特异性抗体的酶标板 制备方法为：用包被缓冲液将吗啡单克隆抗体稀释至1 μ g/ml得包被液，酶标板每孔加入 100 μ 1包被液，37°C孵育2h或者4°C过夜，倒去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔 中加入200 μ 1封闭液，37°C温育2h，倒去孔内液体，干燥后得包被有吗啡特异性抗体的酶 标板。
7. 根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于：所述洗涤液为含有体积分数 0. 5%吐温-20的pH7. 4、0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液稀释10倍后所得。
8. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述包被缓冲液为pH9. 6,0. 05mol/ L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液为含有3wt%的聚乙二醇、1 wt %的酪蛋白、4 wt %的甘氨 酸、1 wt %的卵清蛋白及1 wt %的明胶的磷酸盐缓冲液。
9. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述吗啡单克隆抗体的制备方法 为： A、吗啡抗原的合成 称取吗啡原料500mg，加入50mL苯和lg琥珀酸酐，加热回流8h，蒸发除去苯，残留物分 别用无水乙醚、无水乙醇洗涤，然后真空干燥，即得到粉末状的6-琥珀酸-吗啡，称取6-琥 珀酸-吗啡20mg溶于10ml PBS缓冲液中，加入30 μ 1三乙胺，再加入30 μ 1氯甲酸异丁酯， 反应半小时得反应液；称取20mg BSA溶解于10ml PBS缓冲液中，加入上述反应液，搅拌反 应过夜，透析3天，离心，收集上清液，得到吗啡抗原； B、取6-8周龄雌性BALB/c小鼠六只，将PBS缓冲液与等体积弗氏完全佐剂混合，充 分乳化后，采用腹腔注射的方法进行免疫，按lmg/kg体重的量进行首次免疫，用弗氏不完 全佐剂代替弗氏完全佐剂，采用与首次免疫相同的方法每隔两周加强免疫一次，共加强免 疫四次，从第三次免疫开始，每次免疫后7天，小鼠尾静脉取血lml，进行抗体效价检测，选 择经ELISA检测效价最高的BALB/c小鼠用于制备脾细胞，3天后取效价最高的BALB/c小 鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选获得杂交瘤细胞；另一批BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL 液体石蜡致敏，7-14天后向小鼠腹腔内注射1X106个杂交瘤细胞，7-10天后开始用注 射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1-3天抽取腹水1次，离心，收集上清液，_20°C保存， 进一步采用辛酸-硫酸铵法纯化上清液获得吗啡单克隆抗体。
10. -种海水鱼内生吗啡检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分： (1) 、吗啡标准品溶液，浓度分别为：0 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ ml,20 ng/ml ； (2) 、包被有吗啡特异性抗体的酶标板； (3) 、吗啡抗原酶标记物； (4) 、显色剂：四甲基联苯胺； (5) 、浓缩洗涤液10X :含有体积分数0. 5%吐温-20的pH7. 4、0. Olmol/L的磷酸盐缓 冲液； (6) 、终止液：浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液； (7) 、样品稀释液：pH7. 4、0. Olmol/L的磷酸盐缓冲液。
【文档编号】G01N33/535GK104101710SQ201410130212
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】相兴伟, 周宇芳, 周利辉, 万婧, 付万冬, 杨会成, 郑斌 申请人:浙江省海洋开发研究院