专利名称：抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物鉴定方法
技术领域：
本发明涉及抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物鉴定方法。
技术背景
癌症一直是人类健康的最大杀手。细胞的过度增殖是癌症发生和发展的原因，而 且细胞的过度增殖一般都与配体诱导细胞信号通路尤其是生长因子信号通路的过度激活 有关。因此抑制这种细胞信号通路的过度激活，成为治疗癌症的重要途径。生长因子细胞 信号通路的激活首先是通过配体与其膜蛋白受体在细胞膜上结合，使受体产生自聚或异聚 而被激活。然后通过激活的受体再磷酸化下游通路的蛋白，使其下游蛋白被激活，从而激活 整个信号通路。因此，筛选出能截断激活信号通路的任一环节的化合物就能发展治疗癌症 的药物。
目前抗癌药物分子的主要筛选方法之一是首先通过计算机模拟从化合物库中找 出一些能与信号通路相关蛋白结合的候选物，然后对这些候选物分子进行细胞水平的实 验，检测其是否能够抑制其配体诱导的下游蛋白的磷酸化水平，通过重复这些生化实验来 达到抗癌药物筛选的目的，再进一步进行动物实验。但是在筛选过程中普遍存在周期长，操 作复杂，花费高的问题，难以实现简便快捷的药物筛选。因此，有必要发展一种简单快捷的 药物筛选方法。
单分子荧光方法是近年来迅速发展起来的一种检测技术。该方法不仅有极高的灵 敏度，而且还能展现出大量分子检测时所掩盖下单个分子的行为，已日益广泛地应用于细 胞水平对生物分子结构和功能的动态变化、分子间相互作用和生化反应的动力学过程的研 究。但目前还未见有利用该方法鉴定抗癌药物的相关报道。发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物鉴定方法。
本发明提供的药物鉴定方法，包括如下步骤
1)向离体的癌症细胞中转入靶标膜蛋白受体的基因，所述靶标膜蛋白受体的基因 被荧光蛋白标记，得到重组癌症细胞；
2)将所述步骤1)所得重组癌症细胞和待鉴定物质进行孵育，孵育完毕后再加入 所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵育完毕后将所述重组癌症细胞进行固定，得到待 检测细胞样品I ；
3)将步骤2、得到的待检测细胞样品I置于全内反射显微镜的物镜上进行单分子 荧光成像，得到所述待检测细胞样品I的细胞图像，进而得到各个荧光点的漂白步数B
4)将所述步骤1)所得重组癌症细胞和所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵 育完毕后将所述重组癌症细胞进行固定，得到待检测细胞样品II，将所述待检测细胞样品 II按照与步骤；3)完全相同的步骤进行单分子荧光成像，得到各个荧光点的漂白步数A ；
幻如果所述漂白步数B中的两步漂白所得二聚体的比例小于所述漂白步数A中两步漂白所得二聚体的比例，则所述待鉴定物质为候选的抗癌药物。
上述方法的步骤1)中，所述癌症细胞均为离体的，并经过孵育的。所述离体的癌 症细胞为Hela细胞或MCF7细胞，优选Hela细胞；所述靶标膜蛋白的受体为T β RII，所述 靶标膜蛋白受体的配体为TGFi3 1 ；所述荧光蛋白为GFP ；所述靶标膜蛋白受体的基因是通 过T β RII-GFP质粒转入所述离体的癌症细胞中；所述孵育步骤中，温度为37°C，优选37°C， 时间为18-30小时，优选M小时。所述孵育步骤是在培养基中进行的。各种能够孵育该癌 症细胞的培养基均适用，如可为胎牛血清体积百分比为10%的DMEM培养基。所述孵育步骤 中，孵育后的细胞覆盖度为70-90 %，优选80 %。
所述步骤2)将所述步骤1)所得重组癌症细胞和待鉴定物质进行孵育步骤中， 温度为37°C，时间为30分钟；再加入所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育步骤中，温度为 37°C，时间为15-30分钟，优选15分钟；固定步骤中，各种常用的固定剂均适用，如可选自多 聚甲醛的PBS缓冲液、丙酮溶液和乙醇溶液中的至少一种，优选质量百分浓度为4%的多聚 甲醛的PBS溶液，该缓冲液pH值为7. 2-7. 6，优选7. 4，温度为2_8°C，优选4°C，时间为15-45 分钟，优选30分钟。所述待鉴定物质为式I所示柚皮素或式II所示白藜芦醇。
权利要求
1.一种抗癌药物的鉴定方法，包括如下步骤1)向离体的癌症细胞中转入靶标膜蛋白受体的基因，所述靶标膜蛋白受体的基因被荧 光蛋白标记，得到重组癌症细胞；2)将所述步骤1)所得重组癌症细胞和待鉴定物质进行孵育，孵育完毕后再加入所述 靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵育完毕后将所述重组癌症细胞进行固定，得到待检测 细胞样品I ；3)将步骤幻得到的待检测细胞样品I置于全内反射显微镜的物镜上进行单分子荧光 成像，得到所述待检测细胞样品的细胞图像，进而得到各个荧光点的漂白步数B;4)将所述步骤1)所得重组癌症细胞和所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵育完 毕后将所述重组癌症细胞进行固定，得到待检测细胞样品II，将所述待检测细胞样品II按 照与步骤幻完全相同的步骤进行单分子荧光成像，得到各个荧光点的漂白步数A ；5)如果所述漂白步数B中的两步漂白所得二聚体的比例小于所述漂白步数A中两步漂 白所得二聚体的比例，则所述待鉴定物质为候选的抗癌药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述离体的癌症细胞是 经过孵育的；所述离体的癌症细胞为Hela细胞或MCF7细胞，优选Hela细胞；所述荧光蛋白为GFP。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤1)孵育步骤中，温度为37°C，时 间为18-30小时，优选M小时。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述靶标膜蛋白的受体为Tβ RII， 所述靶标膜蛋白受体的配体为TGF3 1。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述步骤幻将步骤1)所得重组 癌症细胞和待鉴定物质进行孵育步骤中，温度为37°C，时间为30分钟；再加入所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育步骤中，温度为37°C，时间为15-30分钟；所述固定步骤中，固定剂为质量百分浓度为4%的多聚甲醛的PBS缓冲液，所述固定剂 的PH值为7. 2-7. 6，优选7. 4，温度为2_8°C，优选4°C，时间为15-45分钟，优选30分钟。
6.根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述靶标膜蛋白 受体的基因是通过T β RII-GFP质粒转入所述离体的癌症细胞中。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述步骤幻中，所述荧光点均为 像素小于或等于5X5的荧光点。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述步骤幻中，所述漂白步数A中 两步漂白所得二聚体的比例与所述漂白步数B中的两步漂白所得二聚体的比例之差不小 于5%。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于将所述待检测细胞样品I和II置 于全内反射显微镜的物镜上进行单分子荧光成像步骤之前，所述抗癌药物的鉴定方法还包 括如下步骤分别将所述待检测细胞样品I和II用缓冲液洗涤；所述缓冲液均选自磷酸盐缓冲液； 所述磷酸盐缓冲液的PH值均为7. 2-7. 6，优选7. 4。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于所述步骤幻中，所述候选的抗癌药物为能够抑制所述靶标膜蛋白的受体聚集的抗癌药物。
全文摘要
本发明公开了一种抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物鉴定方法。该方法包括如下步骤1)向离体的癌症细胞中转入靶标膜蛋白受体的基因，所述靶标膜蛋白受体的基因被荧光蛋白标记，得到重组癌症细胞；2)将重组癌症细胞和待鉴定物质进行孵育，孵育完毕后再加入靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵育完毕后加入多聚甲醛的PBS溶液将重组癌症细胞进行固定，得到待检测细胞样品I；3)将待检测细胞样品I单分子荧光成像，得到细胞图像，进而得到各个荧光点的漂白步数，分析图像统计其荧光点的漂白步数，以判断该待鉴定物质是否对膜蛋白受体聚集具有抑制作用。该方法具有操作简便，快捷，鉴定周期短，花费小，可以鉴定各种抑制膜蛋白受体聚集的药物。
文档编号G01N21/64GK102033056SQ201010514699
公开日2011年4月27日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者张伟, 方晓红, 杨勇, 梁伟 申请人:中国科学院化学研究所