一种细胞增殖速率的测定方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞增殖速率的测定方法及应用，属于细胞工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 细胞增殖速率测定是细胞生物学领域最基础的实验方法，传统的化学方法精度不 高，现有的流式细胞仪测定技术（如BrdU法，PCNA法等），虽然解决了测量精度的问题，但 是BrdU法和PCNA法都依赖于特殊标记的抗体，这些抗体价格昂贵且具有种属特异性，这就 大大限制了这两种方法的应用范围。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明提供了一种细胞增殖速率的测定方法，所采取的技术方 案如下：
[0004] 本发明的目的在于提供一种细胞增殖速率的测定方法，该方法是在培养细胞的不 同时间点分别取样，利用秋水仙素对所取样品进行处理，处理后利用乙醇固定细胞，再利用 流式细胞仪对固定细胞进行细胞周期检测，同时检测未经秋水仙素处理的空白对照组的细 胞周期，计算细胞增殖速率，绘制细胞生长曲线，再利用细胞生长曲线确定待测细胞的增殖 速率。
[0005] 所述方法的步骤如下：
[0006] 1)在含有5% C02培养箱中培养细胞，并在细胞生长的不同时间点取样；
[0007] 2)利用秋水仙素对步骤1)取样的细胞进行处理，处理结束后静置备用，同时设置 未经秋水仙素处理的空白对照组；
[0008] 3)利用乙醇对步骤2)所得的处理样品及对照组样品进行固定处理，获得固定细 胞；
[0009] 4)利用流式细胞仪测定步骤3)所得的固定细胞的细胞周期，并计算细胞的增殖 速率，绘制细胞生长曲线；
[0010] 5)利用步骤4)所得的细胞生长曲线测定待测细胞的增殖速率。
[0011] 优选地，步骤1)所述细胞为鹿茸间充质干细胞；所述不同时间点，是在细胞培养 的12h、24h、36h、48h、60h和72h取样；所述取样，是用直径100mm的培养皿取10 6个细胞。
[0012] 优选地，步骤2)所述秋水仙素处理，是利用终浓度80-120 y g/ml的秋水仙素对细 胞进行处理。
[0013] 更优选地，所述秋水仙素处理，是利用终浓度100 μg/ml的秋水仙素对细胞进行 处理。
[0014] 优选地，步骤2)所述静置，静置的时间为6h。
[0015] 优选地，步骤3)所述固定处理，是利用70%的乙醇固定细胞。
[0016] 优选地，步骤4)所述利用流式细胞仪测定细胞周期，固定好的细胞样品用PBS洗 绦，PI染色后，用流式细胞仪分析G2/M期细胞比例。
[0017] 所述方法的具体步骤如下：
[0018] 1)在含有5% C02培养箱中培养鹿茸间充质干细胞，并在细胞生长的12h、24h、 36h、48h、60h 和 72h 取样；
[0019] 2)利用终浓度100 y g/ml的秋水仙素对步骤1)获得的细胞样品进行处理，处理后 静置6h，同时设置未经秋水仙素处理的空白对照组；
[0020] 3)利用70%的乙醇对步骤2)所得的处理样品及对照组样品进行固定处理，获得 固定细胞；
[0021] 4)利用流式细胞仪测定步骤3)所得的固定细胞的细胞周期，并计算细胞的增殖 速率，绘制细胞生长曲线；
[0022] 5)利用步骤4)所得的细胞生长曲线测定待测细胞的增殖速率（如图1)。
[0023] 所述任一方法用于测定细胞的增殖速率和生长曲线。
[0024] 本发明获得的有益效果如下：
[0025] 本发明选用常规细胞分裂阻断剂一秋水仙素阻断细胞周期，与标记抗体相比，秋 水仙素价格低廉，并且没有种属特异性。利用流式细胞仪测定样品细胞周期的分布，比较秋 水仙素加入前后细胞周期的变化AG2/M，评估细胞增殖速率，通过连续测定不同时间点的 AG2/M绘制生长曲线。通过与常规检测方法MTT法和细胞计数法的比较，AG2/M的结果细 胞计数法的结果一致，此方法比MTT法更准确。
[0026] 与现有技术相比，本发明是在保证流式细胞仪精度的基础上，大大降低测定成本， 拓宽了应用范围。
【附图说明】
[0027] 图1为依据A G2/M绘制生长曲线。
[0028] 图2为根据本发明方法、MTT法和细胞计数法绘制的生长曲线；
[0029] (AP:鹿茸间充质干细胞，FP:脸部骨膜细胞，293T :293T细胞）。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0031] 以下实施例所使用的材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规材 料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0032] 实施例1
[0033] 本实施例提供了利用MTT法和细胞计数法来绘制细胞生长曲线的方法，步骤如 下：
[0034] 1)利用常规0)2培养箱培养细胞，并在细胞生长的12h、24h、36h、48h、60h和72h 取样；
[0035] MTT 法：在细胞生长的 12h、24h、36h、48h、60h 和 72h 添加终浓度 20ug/ml 的 MTT， 2h后，移去培养液，加入DMSO,混匀后测定OD值。
[0036] 细胞计数法：在细胞生长的12h、24h、36h、48h、60h和72h，用胰酶将细胞悬浮，用 血球计数板计数。
[0037] 2)根据上述两种方法所得的结果，并计算细胞的增殖速率，绘制生长曲线（如图2 中间和右侧的生长曲线）。
[0038] 实施例2
[0039] 1)利用常规方法培养间充质干细胞，并在细胞生长的24h取样；
[0040] 2)利用终浓度100 yg/ml的秋水仙素对步骤1)培养的细胞样品进行处理，处理后 静置2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h，同时设置未经秋水仙素处理的空白对照组；
[0041] 3)利用70%的乙醇对步骤2)所得的处理样品及对照组样品进行固定处理，获得 固定细胞；
[0042] 4)利用流式细胞仪测定步骤3)所得的固定细胞的细胞周期，并计算细胞的增殖 速率；
[0043] 5)利用步骤4)所得的细胞的增殖速率，绘制生长曲线。
[0044] 结果表明，时间太短A G2/M太小，时间过长A G2/M增速放缓甚至下降，最终确定 最佳处理时间为4-8h。
[0045] 实施例3
[0046] 1)利用常规方法培养间充质干细胞，并在细胞生长的12h、24h、36h、48h、60h* 72h取样；
[0047] 2)利用终浓度80yg/mL、100yg/mL和120yg/mL的秋水仙素对步骤1)培养的细 胞样品进行处理，处理后静置6h，同时设置未经秋水仙素处理的空白对照组；
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