抗病植物的制作方法

专利名称：：抗病植物的制作方法抗病植物本发明涉及抗病植物，特别是能够抗卵菌(Oomycota)门生物体一一卵菌的植物。本发明进一步涉及能赋予抗病性的植物基因和获得这种抗病植物的方法，用于提供针对卵菌病原体的保护。已广泛地研究过植物对病原体的抗性，包括病原体特异性的和广镨的抗性两个方面。在很多情况下是通过抗性显性基因表明了抗性。这些品种-特异性或基因-对-基因的抗性基因已被鉴定了许多，其通过介导病原体识别。这种识别导致许多植物防御反应的活化，这些反应会阻止病原体生长。在植物育种中经常想要鉴定主要为单基因显性抗性基因的新来源。在新引入了单抗性基因的栽培品种中，抗病保护通常会迅速地被破坏，因为病原体进化和适应的频率极快，能恢复感染寄主植物的能力。因此，非常需要获得新的抗病性来源。其它抗性机理例如通过调节植物中的防御反应起作用，如通过隐性mlo基因在大麦中介导的针对白粉菌病原体禾布氏白粉菌大麦专化型(Blumeriagraminisf.sp.hordei)的抗性。带有野生型MLO基因突变等位基因的植物显示出几乎完全抗性，与真菌试图穿透单个受攻击的表皮细胞的细胞壁受挫相符。因此野生型MLO基因作为病原体反应的一种负向调节物发挥作用。这在W09804586中有说明。其它实例是隐性白粉菌抗性基因，是在筛选对二孢白粉菌(^Ts/;7/ec/c力oracear咖)的敏感性丧失的过程中被发现的。至今已经克隆了三个基因，称为PMR6，其编码一种果胶酸裂合酶-样蛋白质，PMR4，其编码胼胝质合酶，和PMR5，其编码未知功能的蛋白质。mlo和pmr这两个基因似乎能够特异性地引发对白粉菌的抗性，而非对卵菌如霜霉。已经通过两个主要方式获得广镨的病原体抗性，或系统形式的抗性如SAR。第一个是通过植物防御和细胞死亡的负调节物的突变，例如在拟南芥属(Arabidopsis)的cpr，lsd和acd突变体中。第二个是通过植物防御的诱导物或调节物的转基因过表达，例如在NPR1过表达植物中。这些已知的抗性机理的缺点是除病原体抗性之外，这些植物通常显示可检测的附加和不良表型，例如生长受碍或自发形成的细胞死亡。本发明的一个目的是提供一种广谱的，持久的而且不伴随不良表型的抗性形式。在促成本发明的研究中，筛选对霜霉病原体一一寄生霜霉(Hyaloperonosporaparasitica)的敏感度降低的拟南芥Mrs6油;^M"/fl/2fl)突变体。在高度敏感的拟南芥品系Leredsl-2中产生了EMS-突变体。详细分析了八个霜霉抗性(dmr)突变体，相应于6个不同的基因座。显微镜分析显示，在所有的突变体中，寄生霜霉的生长被严重降低。dmr3，dmr4和dmr5的抗性与植物防御的组成型活化有关。此外，dmr3和dmr4(但非dmr5)还能够抗丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)和Golovinomycesorontii。相比之下，在dmrl，dmr2和dmr6突变体内没有观察到植物防御的活化增加。该研究结果已经在VanDamme等人(2005)MolecularPlant-MicrobeInteractions18(6)583-592中被描述。但是该文章没有公开DMR基因的鉴定和表征。根据本发明，现在发现DMR1是编码高丝氨酸激酶(HSK)的基因。对于拟南芥属已经测序了五个不同的突变dmrl等位基因，每个在HSK蛋白质中导致不同的氨基酸改变。HSK是氨基酸甲硫氨酸，苏氨酸和异亮氨酸生物合成中的关键酶，因此被认为是必要的。各dmrl突变体显示HSK的缺陷，导致植物积累高丝氨酸。五个不同的等位基因显示出不同的抗性水平，与突变体中不同的高丝氨酸累积水平相关联。因此本发明提供一种植物，其能抵抗病毒、细菌、真菌或卵菌来源的病原体，特征在于与不能抗所述病原体的植物相比，该植物具有改变的高丝氨酸水平。这种形式的抗性对下述的病原体特别有效卵菌门，比如白锈属(Albugo)，丝嚢霉属(Apha誦yces)，圓梗霉属(Basidiophora)，盘梗霉属(Bremia)，Hyaloperonospora,Pachymetra，类霜霉属(Paraperonospora),Perofascia，霜疫霉属(Peronophythora)，霜霉属(Peronospora)，霜指霉属(Peronosclerospora)，Phytium，疫霉属(Phytophthora)，单轴霉属(Plasmopara)，Protobremia，假霜霉属(Pseudoperonospora),指梗霉属(Sclerospora)，Viennotia物种。该抗性基于植物中高丝氨酸水平的改变。更具体而言，该抗性基于植物中高丝氨酸水平的提高。这种提高的水平可通过多种方式获得。首先，可通过外部来源提供高丝氨酸。第二，可提高内源的高丝氨酸水平。这可通过降低高丝氨酸激酶基因的酶活性而获得，其会导致高丝氨酸转化率的降低，因而累积高丝氨酸。或者，可降低高丝氨酸激酶的表达。这同样会导致高丝氨酸转化率的降低因而累积高丝氨酸。提高内源高丝氨酸水平的另一个方式是通过增强其经由天冬氨酸途径的生物合成。降低高丝氨酸激酶基因的表达本身可通过多种方式获得，直接地，例如通过基因沉默，或间接地，通过修饰其调控序列或通过刺激对该基因的阻抑作用。可以在不同的水平实现调节HSK基因以降低其活性或表达。首先，该内源的基因可以被直接突变。这可以通过诱变处理获得。或者，可以通过转基因技术或通过基因渗入将修饰的HSK基因引入植物，或者可以在调控的水平上降低HSK的表达，例如通过修饰调控序列或通过基因沉默。在本发明的一个实施方案中，植物中高丝氨酸水平的增加(累积)是通过向植物施用高丝氨酸而获得。这通过用L-高丝氨酸处理植物而适当完成，例如通过用高丝氨酸溶液喷或者浸润。WO00/70016公开了用外源的高丝氨酸处理植物。该出版物公开了如何将高丝氨酸应用于植物使得该植物中苯酚浓度增加。该出版物未表明经如此处理的植物能够抵抗病原体。实际上，WO00/70016未公开也未暗示内源的高丝氨酸的增加会导致病原体抗性。或者，调节植物的氨基酸生物合成或者代谢途径来增加内源的高丝氨酸。在一个实施方案中，该增加的内源产生是内源HSK基因表达被降低的结果，因而导致高丝氨酸到磷酸-高丝氨酸的转化和随后生物合成甲疏氨酸和苏氨酸的效率降低。这种HSK表达的降低举例来说可以是HSK基因突变的结果，该突变导致mRNA减少或者蛋白质的稳定性降低。在另一个实施方案中，表达降低可以通过在转录或翻译水平上下调HSK基因表达而获得，例如通过基因沉默或者通过调控序列中能影响HSK基因表达的突变。获得基因沉默的一个方法实例是借助于RNAi。在另一实施方案中，内源高丝氨酸的水平提高可以通过诱导在高丝氨酸生物合成或新陈代谢方面的变化而获得。在具体的一个实施方案中，这是通过HSK编码序列中能产生酶活性降低的HSK蛋白质的突变从而导致高丝氨酸到磷酸-高丝氨酸的转化率降低而获得。另一个实施方案是上调天冬氨酸途径中的基因，引起植物中更多产生从而累积L-高丝氨酸。本发明基于在拟南芥属中对寄生霜霉的抗性的研究，但这是可以更广泛地应用于植物的总构思，具体而言是对病原体例如卵菌门感染敏感的农作物。本发明适于由卵菌所引起的许多植物疾病，例如但不限于莴苣的莴苣盘梗霉(Bremialactucae)，菠菜的Peronosporafarinosa，葫芦科成员例如黄瓜的古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，洋葱的Peronosporadestructor,十字花科成员例如巻心菜的寄生霜霉，葡萄的葡萄生单轴霉(Plasmoparaviticola)，番茄和马铃薯的蔓延疫霉(Phytophthorainfestans)，和大豆的大豆疫霉(Phytophthorasojae)。在这些其它植物中的高丝氨酸水平可以用上述的所有技术增加。但是，当通过遗传修饰HSK基因或通过鉴定HSK基因的突变来改变植物中的HSK基因表达，而该基因仍未知时，必须首先对其进行鉴定。抗性植物，特别是农作物，必须从这些植物物种中分离出直向同源的HSK基因。直向同源物定义为来自其它生物体的具有相同功能的基因或蛋白质。各式各样的方法可用于鉴定其它植物中的直向同源序列。鉴定植物物种中的HSK直向同源序列的方法，举例来说可以包含，在数据库中鉴定该植物物种的高丝氨酸激酶EST;设计扩增完整高丝氨酸激酶转录物或cDNA的引物；用该引物进行扩增实验，获得相应的完整转录物或cDM;和测定该转录物或cDNA的核苷酸序列。在仅部分编码序列已知的情况下扩增完整的转录物或cDNA的适用方法，是高级PCR技术5，RACE,3，RACE,TAIL-PCR，RLM-RACE和小载体PCR(vectorettePCR)。或者，如果得不到该目的植物物种的核苷酸序列，就以与该目的植物密切相关的植物物种的HSK基因来设计引物，基于通过多重核苷酸序列比对确定的保守结构域，用于PCR扩增直向同源序列。这类引物是适当简并的引物。评价指定序列是否为HSK直向同源物的另一个可靠的方法是鉴定交互最佳命中(reciprocalbesthit)。当使用Blast程序，用拟南芥属或别的植物物种的HSK蛋白质或DNA序列检索时，一个指定植物物种的候选直向同源HSK序列被鉴定为来自DM数据库的最佳命中。使用BlastX检索法，检索所获该指定植物物种的候选直向同源核苷酸序列与该DNA数据库(例如在NCBI或TAIR)之中存在的所有拟南芥属蛋白质的同源性。如果最佳命中和得分是与拟南芥属HSK蛋白质，则该指定DNA序列可以被描述为是直向同源物或直向同源序列。HSK在拟南芥属和稻中由单个基因编码，如从对这些植物物种公众可获得的完整基因组序列推导而来。在至今试验过的大部分其它植物物种中，HSK似乎是由单个基因编码，如通过分析来自公共DM数据库的mRNA序列和EST数据而确定的，除马铃薯，烟草和白杨之外，对这些植物已鉴定出两个HSK同源物。用公共数据库之中存在的信息，通过核苷酸和氨基酸比较，鉴定这些植物中的直向同源基因和蛋白质。或者，如果得不到期望植物物种的DNA序列，可通过异源杂交分离直向同源序列，其中使用拟南芥属或别的植物的HSK基因的DM探针，或通过PCR方法，利用在HSK编码序列中的保守结构域来限定引物。对于许多作物物种，可得到可用于设计引物的部分HSKmRM序列，用于随后PCR扩增完整mRNA或基因组序列，进行DNA序列分析。在一个具体的实施方案中，直向同源物是基因，其编码的蛋白质与拟南芥属HSK蛋白质或其它植物HSK蛋白质具有至少50%同一性。在一个更具体的实施方案中，同源性是至少55%，更具体地至少60%，更具体地至少65°/。，至少70%，至少75°/。，至少80%，至少85%，至少90°/。，至少95°/。或至少99°/。。。图1显示在公众可用的数据库中鉴定的以及通过对cDNA进行PCR扩增且随后测序而获得的直向同源HSK序列。鉴定直向同源HSK序列后，通过标准的分子生物学技术鉴定了该基因的调控以及编码序列的完整核苷酸序列。对此，通过用探针或引物进行DNA杂交或PCR，筛选该植物物种的基因组文库，所述探针或引物来源于已知的高丝氨酸激酶基因，例如上述探针以及引物，用于鉴定含有该HSK基因的基因组克隆。或者，高级的PCR方法，例如RM连接酶介导的RACE(RLM-RACE)，可用于直接从基因组DNA或反转录的mRNA扩增基因以及cDNA序列。DNA测序随后即可表征该完整的基因或编码序列。一旦已知该基因的DNA序列，将该信息用于制备以上述任一方式调节高丝氨酸激酶基因表达的手段。更具体而言，为荻得降低的HSK活性，该HSK基因的表达可以被下调，或可以通过氨基酸替换降低该HSK蛋白质的酶活性，所述替换来自HSK编码序列中核苷酸的改变。在本发明的一个具体实施方案中，HSK基因表达的下调是使用RNAi通过基因-沉默获得。为此，产生表达HSK反义构建体，最优化的微-RNA构建体，反向重复构建体，或联合的有义-反义构建体的转基因植物，以便产生能导致基因沉默的相应于HSK的dsRNA。在另一个实施方案中，通过RNAi下调了HSK基因的一种或多种调节物(在转录活化剂的情况下)。在另一实施方案中，调节物通过转基因过表达被上调(在阻抑蛋白的情况下)。在一个具体的实施方案中，通过从强启动子表达HSK基因的阻抑蛋白获得了过表达，例如通常用于植物生物技术的35S启动子。还可以通过在启动子，终止子区域或可能的内含子中调控元件的诱变获得HSK基因的下调。在很多情况下，HSK编码序列中的突变能导致氨基酸替换或过早的终止密码子，其负向影响所编码的HSK酶的表达或活小生。通过使用诱变化学物质例如乙基甲磺酸酯(EMS)，用y射线或快中子照射植物材料，或用其它方式，在植物中诱导这些及其他影响HSK表达的突变。产生的核苷酸改变是随机的，但是在经诱变处理植物的一个大集合中，HSK基因中的突变可以使用TILLING(靶向诱导的基因组中的局部损害)方法(McCallum等人(2000)Targetedscreeningforinducedmutations.Nat.Biotechnol,18，455-457，以及Henikoff等人(2004)TILLING.Traditionalmutagenesismeetsfunctionalgenomics.PlantPhysiol.135，630-636)容易地鉴定。该方法的原理是基于从M2代经诱变植物的大集合的基因组DMPCR扩增目的基因。通过DM测序或通过使用单链特异性核酸酶例如CEL-I核酸酶寻找点突变(Till等人(2004)Mismatchcleavagebysingle—strandspecificnucleases.NucleicAcidsRes.32，2632-2641)，鉴定了在目的基因中具有突变的个体植物。通过篩选许多植物，获得了突变等位基因的大集合，每个对基因表达或酶活性产生不同影响。基因表达或酶活性可以如下测试通过分析HSK转录物的水平(例如通过RT-PCR),用抗体或通过氨基酸分析定量HSK蛋白水平，测量高丝氨酸的积累(作为HSK活性降低的结果)。这些方法为本领域技术人员公知。本领域技术人员可以使用通常的病原体试验来判断高丝氨酸积累是否足以诱导病原体抗性。然后将期望降低了HSK活性或表达的植物回交或与其它育种系杂交，以便仅将期望的新等位基因转移到需要的作物背景中。本发明还涉及编码酶活性降低的HSK蛋白质的突变HSK基因。在一个具体的实施方案中，本发明涉及dmrl等位基因dmrl-l，dmrl-2，dmr卜3，dmr卜4以及dmr卜5。在另一实施方案中，本发明涉及莴苣(Lactucasativa)，葡萄(Vitisvinifera)，黄瓜(Cucumissativus)，菠菜(Spinaciaoleracea)以及番痴(Sola謡lycopersicum)HSK基因的突变型，如图10-14所示。本发明证实具有提高的高丝氨酸水平的植物显示针对病原体特别是卵菌来源病原体的抗性。利用这些知识本领域技术人员可以通过诱变或转基因方法主动地修饰HSK基因，而且能鉴定给定植物物种中积累高丝氨酸或具有导致高丝氨酸增加的HSK基因变体的至今未知的天然变体，以及根据本发明使用这些天然变体。本申请中术语"高丝氨酸激酶"以及"HSK"可互换使用。在下面实施例中举例说明了本发明，但并非旨在以任何方式限制本发明。在实施例中参考下列附图。图1显示拟南芥的HSK蛋白质和来自甜橙(Citrussinensis)，毛果杨(Populustrichocarpa)(1)，毛果杨(Populustrichocarpa)(2)，马铃薯(Solan認tuberosum)(2)，葡萄，莴苣，马铃薯U)，番痴，烟草(Nicotianabenthamiana),大花牵牛(Ipomoeanil)，大豆(Glycinemax)，菜豆(Phaseolusvulgaris)，黄瓜，菠菜，火炬松(Pinustaeda)，玉蜀黍(Zeamays)以及稻(Oryzasativa)的直向同源物的氨基酸序列比对，使用CLUSTALW(1.82)多重序列比对程序(EBI)。序列下方保守氨基酸以点标明，相同的氨基酸用星号标明。黑色三角形以及相应的正文表明在五个拟南芥属dmr突变体中被替换的氨基酸。表2显示拟南芥属HSKmRNA以及来自其它植物物种的直向同源序列的Genbank登录号以及Genlnfo标识符。图2显示接种后7天，突变体dmrl-l，dmrl-2，dmrl-3和dmr卜4以及亲本品系Leredsl-2上两个寄生霜霉分离抹Cala2以及Waco9形成的分生孢子梗的百分比。在亲本品系上形成的分生孢子梗设为簡。图3是DMR1克隆中的三个主要步骤的图解概要。a)对dmrl的初始作图，导致将基因座定位在2号染色体短臂上位置7，42和7，56Mb之间。设计了三个插入/缺失(INDEL)标记(标记F6P23，T23A1和F5J6的位置通过黑线标明)。这些标记被用于从若干100隔离的F2和F3植物中鉴定重组体。这些用于在收集的重组体中鉴定断裂点的INDEL标记和附加标记的引物序列列于表3。b)—个标记，At2gl7270(用灰线标明)，显示了最强的抗性连锁性。dmrl基因座可以进一步定界到含有8个基因的区域，at2gl7250-at2g17290。扩增并测序这八个基因，寻找编码序列中的突变，使用表4所述引物。对所有8个候选基因的DNA序列分析导致了发现在全部5个dmrl突变体中在At2gl7265基因中的点突变，c)每个dmrl突变体在At2gl7265基因中的不同位置具有点突变，该基因编码高丝氨酸激酶。图4显示HSK编码序列的示意图，以及在HSK编码序列中5个不同dmrl突变的位置和核苷酸替换(用黑色三角形标明的核苷酸替换以l位开始的ATG起始密码子为基准)。5'UTR和3'UTR以淡灰盒显示。核苷酸序列下面显示了蛋白质序列。HSK蛋白质含有推定的转运序列用于叶绿体靶向(深灰部分)。在HSK蛋白质中在其氨基酸(aa)位置编号处标明了5个dmrl突变产生的氨基酸变化(黑色三角形)。图5显示在天冬氨酸途径中高丝氨酸激酶的位置，该途径用于氨基酸苏氨酸，甲硫氨酸和异亮氨酸的生物合成。13图6显示利用两个不同的寄生霜霉分离林Waco9和Cala2接种后5天的分生孢子梗的数目/Leredsl-2苗。在用病原体接种后3天，用dH20，D-高丝氨酸(5mM)或L-高丝氨酸(5mM)浸润接种的幼苗。经L-高丝氨酸处理的幼苗显示完全没有分生孢子梗形成，因而具有抗性。图7显示经水，D-高丝氨酸(5mM)，或L-高丝氨酸(5mM)处理的幼苗中寄生霜霉的生长和发育，通过显微镜检用锥虫蓝染色的幼苗进行分析。a:对Leredsl-2幼苗HS处理后分生孢子梗的形成(10x放大)。L-高丝氨酸浸润后没有检测到分生孢子梗形成，而对照植物显示大量的孢子形成。b:吸器发育受L-高丝氨酸(5mM)浸润的影响(40x放大)，但在水或D-高丝氨酸处理的植物中则没有影响。图8和9分别显示拟南芥高丝氨酸激酶基因(At2gl7265，固-127281，GI:18398362)和蛋白质(At2gl7265,NP—179318，GI:15227800)的核苷酸和氨基酸序列。图10分别显示莴苣的高丝氨酸激酶编码序列(CDS)和蛋白质的核苷酸和预测氨基酸序列。图11分别显示葡萄的高丝氨酸激酶编码序列(CDS)和蛋白质的核苷酸和预测氨基酸序列。图12分别显示黄瓜的高丝氨酸激酶编码序列(CDS)和蛋白质的核苷酸和预测氨基酸序列。图13分别显示菠菜的高丝氨酸激酶编码序列(CDS)和蛋白质的核香酸和预测氨基酸序列。图14分别显示番茄的高丝氨酸激酶编码序列(CDS)和蛋白质的核苷酸和预测氨基酸序列。实施例实施例1在dmr突变体中负责病原体抗性的基因的表征VanDamme等，2005，上文公开了对寄生霜霉呈抗性的四个突变体，dmrl-l，dmrl-2,dmrl-3和dmrl-4。用寄生霜霉Cala2分离林(可获自Dr.E.Holub(WarwickHRI，Weilesbourne，UK或Dr.G.VandenAckerveken，生物学系，Utrecht大学，Utrecht,NL)接种后七天，通过计数每苗叶的分生孢子梗，可以检验抗性水平。对于高度敏感的亲本品系Leredsl-2(Parker等，1996,PlantCell8:2033-2046)，将分生孢子梗数目设置为100%。图2显示了与亲本品系苗相比，在感染的dmrl突变体上形成的分生孢子梗的减少。根据本发明，vanDamme等人2005，上文的dmrl突变体中负责寄生霜霉抗性的基因已通过对候选基因的作图和测序的组合而被克隆。通过图i普基础上的克隆分离DMR1。将dmrl突变体与FN2Col-O突变体杂交，产生作图群。由于在RPP2A基因中的快中子突变，FN2突变体对寄生霜霉分离林Cala2易感(Sinapidou等人，2004，PlantJ.38:898-909)。由于F1植物易感，全部5个dmrl突变体带有单隐性突变，且大约1/4的F2植物显示寄生霜霉抗性。在图3举例说明了DMRl的克隆操作，在下面更详细地进行了描述。首先通过对48林抗性F2植物进行基因分型而确定dmr1基因座的图谙位置位于2号染色体的短臂。从对650林F2植物附加筛选新重组体中，鉴定了约90林F2重组植物，在两个INDEL(插入/缺失)标记之间，分别为在7，2Mb的BACT24I12和在7，56Mb的BACF5J6(根据2004年l月的TIGR拟南芥属基因组版本5.0),这使得可以将该基因作图到含有5个BAC的重叠群的区域。测定F2植物的基因型和F3代的表型，以便精细作图dmr1基因座。dmrl突变可以作图到一个约130kb区域(包括3个重叠BAC克隆F6P23，T23A1和F5J6)，在两个INDEL标记之间，分别是位于7，42Mb的BACF6P23和7，56Mb的F5J6(根据2004年1月的TIGR拟南芥属基因组版本5.0)。这得到对于dmrl基因座一个30个推定基因候选物的区域，在TAIR编码AT2gl7060和AT2gl7380的拟南芥属基因之间。另外根据与基因AT2gl7190，AT2gl7200，AT2gl7270，At2gl7300,At2gl7310和At2gl7360基因关联的SNP设计分裂多态序列标记(CAPS)。用这些CAPS标记数据在该区域内分析5个剩余的重组体，留下8个候选基因，At2gl7230(NM—127277,GI:30679913)，At2gl7240(NM—127278，GI:30679916)，At2gl7250(NM—127279，GI:22325730)，At2gl7260(NM_127280，GI:30679922)，At2gl7265(NM-127281,GI:18398362)，At2gl7270(NM一127282，GI:30679927)，At2gl7280(NM一127283，GI:42569096)，At2gl7290(NM—127284,GI:30679934)。对全部8个基因的测序发现在五个dmrl等位基因dmrl-l，dmrl-2，dmrl-3,dmrl-4和dmrl-5中在AT2gl7265编码基因中的点突变，清楚地说明AT2gl7265是DMR1。图3显示带有不同等位基因点突变的dmrl的图解。At2gl7265编码高丝氨酸激酶(HSK),这是迄今为止显示出该功能的唯一拟南芥属基因。在拟南芥属中，HSK是由单基因At2gl7265编码的(Lee&Leustek，1999，Arch.Biochem.Biophys.372:135-142)。HSK是在天冬氨酸途径中的第四个酶，该途径是氨基酸苏氨酸，曱硫氨酸和异亮氨酸的生物合成所需的。HSK催化高丝氨酸到磷酸高丝氨酸的磷酸化作用(图5)。实施例2氨基酸分析磷酸高丝氨酸是拟南芥属中曱硫氨酸，异亮氨酸和苏氨酸生产过程中的中间产物。由于高丝氨酸激酶在氣基酸生产中具有关键作用，因此在亲本品系Leredsl-2和四个不同的dmrl突变体中测定游离氨基酸水平。为此，利用80%甲醇提取来自总叶片的氩基酸，然后利用2(^甲醇二次提取。千燥合并的提取物并溶于水。添加内标S-氨基-乙基-半胱氨酸(SAEC)后，在JOELAminoTacJLC-500/V(Tokyo,Japan)上，通过带有柱后水合茚三酮衍生作用的自动化离子交换层析来检测氨基酸。对四个不同的dmrl突变体和亲本品系Leredsl-2的氨基酸分析显示在dmrl突变体中高丝氨酸的积累，而在亲本品系Leredsl-2中检测不到该中间产物氨基酸。在dmrl突变体中的曱硫氨酸，异亮氨酸和苏氨酸的水平没有减少(表l)。表l亲本品系Lereds卜2和突变体dmrl-l，dmr卜2，dmrl-3和dmr卜4的2周龄幼苗地上部分中高丝氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸和异亮氨酸的浓度(pmol/mg鲜重)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由于dmrl突变体中的HSK活性降低，因此高丝氨酸积累。该效应可以通过天冬氨酸更强注入该途径导致甚至更高的高丝氨酸水平而进一步增强。底物高丝氨酸的高浓度仍将允许突变HSK的充分磷酸化作用，使得在dmrl突变体和亲本品系leredsl-2中甲硫氨酸，异亮氨酸和苏氨酸的水平不降低(表l)。实施例3应用L-高丝氨酸获得了病原体抗性为试验该效应是否是高丝氨酸特异性的，测试了立体异构体D-高丝氨酸。利用水，5mMD-高丝氨酸和5mML-高丝氨酸浸润整个幼苗。仅仅用天然氨基酸L-高丝氨酸处理产生了寄生霜霉抗性。水或D-高丝氨酸处理的幼苗未显示病原体生长大幅减少，对寄生霜霉易感。将浸润施加给两个拟南芥属登录号，Lereds1-2和Wseds1-1,分别对Cala2和Waco9敏感。测定分生孢子梗形成，作为寄生霜霉易感性的指标。用寄生霜霉接种后5天和用水，D-高丝氨酸或L-高丝氨酸浸润后2天计数分生孢子梗(图6)。L-高丝氨酸浸润明显地导致分生孢子梗形成降低和寄生霜霉抗性。通过拟南芥属幼苗锥虫蓝染色研究植物中病原体生长，进一步证实了该结果。用分离林Cala2接种植物。两天后用水，5mMD-高丝氨酸和5mML-高丝氨酸浸润处理植物。接种后5天对症状打分，清楚地表明只有L-高丝氨酸浸润的幼苗显示出病原体生长明显降低且没有形成分生孢子梗(图7)。显微镜分析显示只有在经L-高丝氨酸处理的叶片中，感染过程期间寄生霜霉产生的吸器(进食构造)被干扰。再次表明在植物中高丝氨酸水平的提高导致病原体抗性。实施例4在作物中鉴定HSK直向同源物1.根据序列同源性筛选文库图8和9显示了拟南芥的高丝氨酸激酶基因和蛋白质的核苷酸及氨基酸序列。将公共文库核苷酸及氨基酸序列与图8及9的序列相比较。该比较结果鉴定了甜橙，毛果杨(1)，毛果杨(2)，马铃薯(2)，马铃薯(l)，烟草，大花牵牛，大豆，菜豆，火炬松，玉蜀黍及稻中的完整HSK编码序列及预测氨基酸序列。如此鉴定的直向同源蛋白质的序列信息列于图1。至于许多其它植物物种，直向同源DNA片段可以作为与拟南芥属或其它植物HSK蛋白质序列的交互最佳命中通过BlastX鉴定。2.通过异源杂交鉴定直向同源物使用标准的分子生物学方法，通过与任何植物物种上的DNA杂交，用如图8所示的拟南芥HSKDM序列作为探针查找同源序列。使用该方法，通过对限制酶消化的DNA进行southern杂交或通过与基因组或cDNA文库杂交，检测直向同源基因。这些技术为本领域技术人员公知。作为替代探针，任何其它更密切相关的植物物种的HSKDNA序列可用作为探针。3.通过PCR鉴定直向同源物对于许多作物物种，可获得用于设计引物的部分HSKmRNA或基因序列用于随后PCR扩增完整的cDNA或基因组序列。当可得到5'及3'序列时，通过HSK特异性5'正向引物及3'反向引物PCR扩增缺失的内部序列。如果只有5'，内部或3'序列可用时，设计正反向两个引物。与可得到的质粒多接头引物联合，从目的植物物种的基因组及cDNA文库中扩增插入物。以类似的方式，通过高级PCR技术5，RACE,3'RACE,TAIL-PCR，RLM-RACE或小载体PCR,扩增缺失的5'或3，序列。例如，提供了莴苣HSKcDNA的测序。使用tblastn工具，从拟南芥属HSK氨基酸序列着手，从NCBI的GenbankEST数据库中鉴定了几个莴苣属HSKEST。EST的簇集及比对得到了一个5'HSK片段的共有序列及一个3'HSK片段的共有序列。为获得完整的莴苣HSKcDNA,对莴苣苗的mRNA^f吏用RLM-RACE试剂盒(Ambion)。使用在来源于EST的3，HSK共有序列中设计的引物(RlSla:GCCTTCTTCACAGCATCCATTCC)及来自该试剂盒的5，RACE引物获得5'mRNA序列。使用根据5'RACE片段i殳计的两个引物(Let3RACE0ut:CCGTTGCGGTTAATGAGATT，及Let3RACEInn:TCGTGTTGGTGMTCCTGAA)和来自该试剂盒的3'RACE引物，获得了3'cDNA序列。根据该装配顺序，设计新引物以扩增从cDM编码的完整HSK，提供核普酸序列及衍生蛋白序列，所述序列列于图10。类似方法被用于番茄(图14)及葡萄(图11)。已从基因组及EST数据库中鉴定了来自多于10个不同的植物物种的完整HSK编码序列。从DM序列的比对中，选择了编码序列中的保守区域用于设计简并寡核苷酸引物(对于简并核苷酸，缩写是根据所有合成寡核苷酸的公司所用的标准代码IUB核苷酸符号G-鸟嘌呤，A=腺嘌呤，T=胸腺嘧啶，C=胞嘧啶，R-A或G，Y-C或T，M-A或C,K-G或T，S-C或G，W-A或T,B-C或G或T，D=G或A或T，H-A或C或T，V-A或C或G，N-A或C或G或T)。用于获得指定植物物种的内部HSKcDNA序列的方法如下1.使用标准方法分离mRNA，2.使用寡dT引物及标准方法合成cDNA，3.使用简并正反向寡核苷酸进行PCR反应，4.通过标准的琼脂糖凝胶电泳分离PCR片段，从该凝胶分离预期大小的片段，5.使用标准方法将分离的PCR片段克隆到质粒载体中，6.通过PCR确定带有正确插入片段大小的质粒，通过DNA测序分析，7.使用blastX进行的序列分析显示哪些片段含有正确的内部HSK序列，8.然后该内部DNA序列可被用于设计基因-及物种-特异性的引物进行5'及3'RACE,通过RLM-RACE获得完整的HSK编码序列(如上所述)。例如，4^供了黄瓜HSKcDNA的测序。对于黄瓜而言，两个引物組合成功地从cDNA扩增了一段内部编码序列组合1:引物FlKom(GAYTTCYTHGGMTGYGCCGT)及M1RC(GCRGCGATKCCRGCRCAGTT)，；SJ且合2:克隆及测序扩增片段后，设计黄瓜HSK-特异性引物用于5'RACE(Cuc5RACE0ut:AGAGGATTTTTACTAAGTTTATTCGTG及Cuc5RACEInnAGACATAATCTCCCAAGCCATCA)及3'RACE(Cuc3RACB0utTGATGGCTTGGGAGATTATGTCT及Cue3RACEInnCACGAATAAACTTAGTAAAAATCCTCT)。最终扩增并测序了完整的黄瓜HSKcDNA序列(图12)。类似方法,皮用于菠菜(图13)。如该实施例所述鉴定的直向同源物可以使用众所周知的技术修饰，用于诱导能降低HSK表达或活性的突变。或者，该直向同源物的遗传信息可用于设计载体进行基因沉默。然后所有这些序列被用于转化相应的农作物以获得抗卵菌的植物。实施例5通过RNAi在拟南芥属中降低高丝氨酸激酶的表达通过RNAi在拟南芥属中已经实现了HSK沉默品系的产生。以相反的方向含有HSK外显子的两个约750bp片段的构建体被成功转化到拟南芥属Col-O登录号。分析转化体对寄生霜霉Waco9分离林的抗性。获得了几个赋予寄生霜霉抗性的转基因品系。对HSK表达和高丝氨酸积累的分析证实在转化品系中HSK基因被沉默，导致对寄生霜霉的抗性。实施例6种子的突变用诱变剂处理目的植物物种的种子以便在基因组中引入随机点突变。突变的植物生长结籽，筛选下一代中高丝氨酸积累的增加。这可通过测量氨基酸高丝氨酸的水平，通过监测HSK基因表达的水平，或用TILLING方法通过搜寻HSK基因中的错义突变，通过DNA测序，或通过任何其它用于鉴定核苷酸变化的方法而实现。选择的植物为纯合的，或通过自交或杂交而成为纯合的。测试所选具有增加的高丝氨酸水平的纯合植物对目的病原体的抗性是否增强，证实增强的疾病抗性。实施例7将突变等位基因转移到期望作物的背景中通过杂交和突变等位基因的基因型筛选获得了期望突变等位基因向作物中的基因渗入。这是目前作物标记辅助育种的标准程序。叁表2拟南芥属HSKmRNA表达序列标签(EST)和mRNA序列及来自其它植物物种的直向同源序列的GI编号(Genlnfo标识符)和Genbank登录号。GI编号(Genlnfo标识符，有时小写为"gi")是识别一个特定序列的独特整数。GI编号是一系列数字，连续地分配给每个由NCBI处理的序列记录。因而每当序列变化时GI编号也随之变化。NCBI会给在Entrez内处理的所有序列分配GI编号，包括来自DDBJ/EMBL/GenBank的核普酸序列，来自SWISS-PROT,PIR和许多其它的蛋白质序列。因而GI编号提供独特的序列标识符，其与详细说明确切序列的数据库来源无关。如果GenBank中的一个序列被修饰，甚至仅单个碱基对，也会给该更新的序列分配一个新的GI编号。登录号保持相同。GI编号始终稳定并且可检索。因此，参考该表中的GI编号可以清楚并明确地鉴定相应序列。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>67490638DR09226748933532C016299134354980CF39656367706241DR1179311724346534349136AAOFt，』fUCF390719nuns*7qi"548932595。/31fCO16205466689208yiqo，"3trDR011702c。anoq。u34350236LU丄t)2y(J3Cf39181967706323DR11801348932678C016213766981399DR05783234354850CF396433毛杲杨(Populustrichocarpa)1白杨毛果杨(Populustrichocarpa)2白杨马铃薯(Solan認tuberosum)1马铃薯基因组vl.0,LG—IX,149339-148242表达通过EST证实基因组vl.0,i架—66,1415935-141*7032表达通过EST证实ESTs马铃薯(Sola謹tuberosum)2马铃薯玉蜀黍(ZeaMays)玉米ESTsESTs66838966DR03707161238361DN58800739804315CK25136239801776CK2500659250052BE34052139832341CK27536321917848BQU69219249876BE34034539815050CK25807039804985CK25170239804987CK25170339825384CK26840639832342CK2753646683896*7DR0370729250394BE34086339825385CK26840721375072BQ51620339813353CK25637339793361CK24613139*793359CK24613039813352CK25637276021237DT94840776913306DV16506571446162DR82721271449720DR8307707811757691048486EB15890471439095DR82014576936546DV17477476012246DT939"6番莊(Solanumlycopersicum)莴苣(Lactucasativa)葡萄(Vitisvinifera)菠菜(Spinaciaoleracea)黄瓜(Cucumissativus)"78085419DV51381271766843DR96478076924795DV1701317i449067DR83011791875652DR83122578103551DV521S79rv"doQ，o78104654DV52307276926251DV17076878111568DV52996571773353DR97125"771425S52DR80700293282458EB67472278074199DV50263376293328DV032896"8075462DV5038969105475086469295DY23566574243218DT65113274242699DT650813101384764EB81"2891054*750EB16516871440426DR8214767812178078103550DV52197886469294DY23566491877777EB40773467014441CO44319076924*794DV1701307602123671446161DR82721178110960DV52935878074736DV50317071428043DR80909386469052DY23542271440425DR82147578121779■7B104653DV523(m37400920CF6378207807"98DV50263271449719DR83076958213736BP8"2137333245AW6215984386685UnigeneSGN-U223239来自SolGenomicsNetwork序列描述于本专利申请中序列描述于本专利申请中序列描迷于本专利申请中序列描述于本专利申请中序列描述于本专利申请中24西紅柿藤苣萄菜瓜莴葡菱黄用于DMR1基因座作图的插入/缺失(INDEL，大小差异标明在括号中)标记及分裂多态序列标记(CAP,多态限制位点标明在括号中)的引物序列引物名称BAC和/或TAIRAt代码正向引物序列反向引物序列类型(大小/酶)TAIRAt代码的GI编号T24I12AATCCAAATTTCTTAAACGAAGAGTGACINDEL18398180(At2gl6670)GCGAGAACACAAATGGTTGGAG<33！CCGTCAGATCAGTCCAGAAGCTGATGATINDEL23506018,(AT2gl7370-80)CTCATCTTGTTCGTGGAAAGTA(30)30679966f6p23cggtttcatgtcgaaagaagagaactgcinde:l22325728(AT2gl7060)GGAAGATCATAGTCAACCTTCC(37)T23A1TCCTTCCATGTCCGAACAAATTTGCTTCINDEIi42570808,AAACCACAGCCTTT(26)30679913GAATAGAGGTTGATCTCTTGTATGTTTTCAP306"898GGAAATCAAGAACTGGGCTGAT(Msel)AT2gl7200CCTCTCCACCCATTCGATCCATTTCGTCCAP30679902TCTAATTTCGAAGCAATCTAC(MboIIJGATGCAGCTAAATTACGAAAATATCAAACAP30679927ATCAGTGTGAAAAGCTCCTTC(MiaIII)AT2gl7300-05AGGTAGGATGGTATGCATGTTTTCTCTACAPTATGTTTGAACTAGCGATAGAAG(EcoRI)22325732AT2gl7310ATGGGTAACGAAAGCACATGTATAAGGTCAP425690"AGAGGATTAGTCTTCCCATAGA(Msel)AT2gl7360CCAACAAGTATCCTCCACATCAAACTTACAP30679959CTTTTGTTGTTATGAACTCCAC(MaeIi:O表4用于八个候选DMR1基因扩增及测序的引物序列，标明了候选基因的TAIR及GI4、码引物名称引物序列TAIR代码GI代码MvD17230.一FTTCCCGAAGTGTACATTAAAAGCTCAt2gl7230306"79913MvD17230.一RTATGTCATCCCCAAGAGAAGAAGACAt2gl723030679913MvD17240.-FCAATAAAAGCCTTTAAARGCCCACTAt2gl"724030679916MvD17240.一RTAGCTTCTGAAACTGTGGCATTACAAt2gl724030679916MvDl"7250—_1FCATGATTTG^GGGGTATATCCAAA^At2gl725022325730MvD17250_一1RGGAGGTGGGATTTGAGATAAAACTTAt2gl725022325730MvD17250一2FTAGCCTAGAACTCTCTGTTCGCAAGAt2gl725022325730MvD17250—一2RCATTATTTTGCGTAGTTGTGAGTGGAt2gl725022325730MvD17250一一3FCGAAGAAATCCTACAATCAACCATCAt2gl725022325730MvD17250一_3RTCTCACAATTCCCATCTCTTACTCCAt2gl725022325730MvD17260一-IFTTACTCATTTGGGTGAACAGAACAAAt2gl726030679922MvD17260—_1RATCATCCCTAATCTCTCTGCTTCCTAt2gl726030679922MvD17260一—2FGATTAAGATACGGGGAATGGAGTCTAt2gl726030679922MvD17260_一2RATGCAGACAAATAAGATGGCTCTTGAt2gl726030679922MvD17260—一3FGTTGTTGCTCCTGTCACAAGACTTAAt2gl726030679922MvD17260_—3RGAACAAAGACGAAGCCTTTAAACAAAt2gl726030679922MvD17265_一FGAGGACTGCATCTAGAAGACCCATAAt2gl726518398362MvD17265—_RTGGGCTCTCAACTATAAAGTTTGCTAt2gl"726518398362MvD17270—-F1TAACGGTAAAGCAACGAATCTATCCAt2gl727030679927MvD17270_-R1TCAAACTGATAACGAGAGACGTTGAAt2gl727030679927MvD17270—_F2TTGCGTTCGTTTTTGAGTCTTTTATAt2gl727030679927MvD17270一—R2AAACCAGACTCATTCCTTTGACATCAt2gl727030679927MvD17280—-FlTTTAGGATCTCTGCCTTTTCTCAACAt2gl728042569096MvD17280一_R1GAGAAATCAATAGCGGGAAAGAGAGAt2gl728042569096MvD17280一一F2GCTTAAATAGTCCTCCTTTCCTTGCAt2gl728042569096MvD17280—-R2TCTGCTGGTTCTCATGTTGATAGAGAt2gl728042569096MvD17290_F1CTCTCCTTCATCATTTCACAAATCCAt2gl729030679934MvD17290—-RlTTCCTCTCGCTGTAATGACCTCTATAt2gl729030679934MvD17290一J2TGCCACAGGTGTTGACTATGCAt2gl729030679934MvD17290;2TGCTCTTAAACCCGCAATCTCAt2gl729030679934MvD17290_F3GAAGATGGCTTTAAAGGTCAGTTTGTAt2gl"729030679934MvD17290—R3AGCAACAACAACTAAAAGGTGGAAGAt2gl72903067993权利要求1.植物，其能抵抗病毒、细菌、真菌或卵菌来源的病原体，特征在于与不能抗所述病原体的植物相比，该植物具有增加的高丝氨酸水平。2.权利要求l的植物，其中该病原体为卵菌门的生物体。3.权利要求2的植物，其中该病原体为白锈属，丝嚢霉属，圓梗霉属，盘梗霉属，Hyaloperonospora，Pachymetra，类霜霉属，Perofascia,霜疫霉属，霜霉属，霜指霉属，Phytium，疫霉属，单轴霉属，Protobremia，假霜霉属，指梗霉属，Vie画tia物种。4.权利要求2或3的植物，其中该植物及病原体选自莴苣的莴苣盘梗霉，菠菜的Peronosporafarinosa，葫，科成员例如黄瓜的古巴假霜霉，洋葱的Peronosporadestructor,十字花科成员例如巻心菜的寄生霜霉，葡萄的葡萄生单轴霉，番茄和马铃薯的蔓延疫霉，和大豆的大豆疫霉。5.权利要求l-4任一项的植物，在其高丝氨酸激酶基因中具有突变，该突变影响所编码酶的高丝氨酸激酶活性。6.权利要求5的植物，其中在高丝氨酸激酶基因中的突变导致在编码蛋白质中的氨基酸替换。7.权利要求l-4任一项的植物，在其高丝氨酸激酶基因的调控序列中具有突变，该突变影响所编码高丝氨酸激酶的表达。8.权利要求l-4任一项的植物，在其基因组内具有基于高丝氨酸激酶基因的基因-沉默构建体，其影响所编码高丝氨酸激酶的表达。9.权利要求l-4任一项的植物，在天冬氨酸途径中具有上调的基因，导致在该植物中内源高丝氨酸水平增加。10.权利要求5-8任一项的植物，其中该基因是如图8所示的拟南芥属基因At2gl7265(NM-127281,GI:18398362)的直向同源基因。11.权利要求5-8任一项的植物，其中该基因是如表2列表中鉴定的高丝氨酸激酶基因。12.权利要求5-8任一项的植物，其中该基因是具有如图10所示核苷酸序列及氨基酸序列的莴苣高丝氨酸激酶基因。13.权利要求5-8任一项的植物，其中该基因是具有如图11所示核苷酸序列及氨基酸序列的葡萄高丝氨酸激酶基因。14.权利要求5-8任一项的植物，其中该基因是具有如图12所示核苷酸序列及氨基酸序列的黄瓜高丝氨酸激酶基因。15.权利要求5-8任一项的植物，其中该基因是具有如图13所示核苷酸序列及氨基酸序列的菠菜高丝氨酸激酶基因。16.权利要求5-8任一项的植物，其中该基因是具有如图14所示核苷酸序列及氨基酸序列的番茄高丝氨酸激酶基因。17.用于获得植物的方法，该植物能抵抗病毒、细菌、真菌或卵菌来源的病原体，包括增加该植物中的内源高丝氨酸水平。18.权利要求17的方法，其中通过对该植物外部施用高丝氨酸而获得植物中内源高丝氨酸水平的增加。19.权利要求18的方法，其中高丝氨酸是通过用高丝氨酸喷或浸润处理幼苗而施用给植物。20.权利要求17的方法，其中通过该植物的高丝氨酸激酶基因的突变获得植物中内源高丝氨酸水平的增加。21.权利要求20的方法，其中该突变导致一个或多个导致高丝氨酸激酶活性降低的氨基酸改变。22.权利要求20或21的方法，其中该突变是通过对植物诱变处理而实现的，特别是用诱变剂或辐射处理。23.权利要求17的方法，其中通过降低该植物高丝氨酸激酶基因的表达获得植物中内源高丝氨酸水平的增加。24.权利要求23的方法，其中通过基因沉默或RNAi实现植物高丝氨酸激酶基因的表达降低。25.权利要求23的方法，其中通过在启动子区域，终止子区域或内含子中调控元件的诱变实现该植物高丝氨酸激酶基因表达的降低。26.权利要求23的方法，其中通过高丝氨酸激酶基因阻抑蛋白的过表达实现植物高丝氨酸激酶基因的表达降低。27.权利要求26的方法，其中该高丝氨酸激酶基因是从35S启动子表达的。28.权利要求23的方法，其中通过编码高丝氨酸激酶活化或调节蛋白的植物基因的沉默或突变实现植物高丝氨酸激酶基因的表达降低。29.权利要求17的方法，其中通过诱导天冬氨酸途径中的改变而实现植物中内源高丝氨酸水平的增加。30.权利要求21到29任一项的方法，其中待突变的高丝氨酸激酶基因是如图8所示的拟南芥属基因At2gl7265(NM一127281,GI:18398362)的直向同源基因。31.权利要求30的方法，其中该直向同源基因是具有如图IO所示核苷酸序列及氨基酸序列的莴苣高丝氨酸激酶基因。32.权利要求30的方法，其中该直向同源基因是具有如图11所示核苷酸序列及氨基酸序列的葡萄高丝氨酸激酶基因。33.权利要求30的方法，其中该直向同源基因是具有如图12所示核苷酸序列及氨基酸序列的黄瓜高丝氨酸激酶基因。34.权利要求30的方法，其中该直向同源基因是具有如图13所示核苷酸序列及氨基酸序列的菠菜高丝氨酸激酶基因。35.权利要求30的方法，其中该直向同源基因是具有如图14所示核苷酸序列及氨基酸序列的番茄高丝氨酸激酶基因。36.编码具有降低了的酶活性的高丝氨酸激酶的突变植物HSK基因。37.权利要求36的突变植物HSK基因，选自dmrl等位基因dmrl-l，dmr卜2，dmrl—3，dmrl—4以及dmrl-5。全文摘要本发明涉及一种植物，其能抵抗病毒、细菌、真菌或卵菌来源的病原体，其中与不能抗所述病原体特别是卵菌门生物体的植物相比，该植物具有增加的高丝氨酸水平。本发明进一步涉及用于获得植物的方法，该植物能抵抗病毒、细菌、真菌或卵菌来源的病原体，包括增加该植物中的内源高丝氨酸水平。文档编号C12N9/12GK101316931SQ200680043318公开日2008年12月3日申请日期2006年11月1日优先权日2005年11月1日发明者A·F·J·M·范登阿克维肯,M·M·A·范达默申请人:乌得勒支大学控股有限责任公司