抗病植物及其培育方法

专利名称：抗病植物及其培育方法
技术领域：
本发明涉及抗病植物的培育方法，还涉及用于培育抗病植物的基因表达盒以及通过该方法培育出的转基因抗病植物。
背景技术：
植物虽然不像在动物中具有常见的免疫系统，但是植物体内确有一种特有的机制可自身防御病原体。例如，高等植物的过敏反应(hypersensitive response，HR)就是，植物感染部位的细胞迅速自融在局部将病原体包围，植物对病原体的侵入产生一种能动的防御性反应。已知这种反应是非亲和的宿主-病原体之间的相互作用以及非宿主-病原体之间相互作用的结果所致而产生的。这里所说的自融(cell suicide)可以看作是局部性程序细胞死亡(Dangl et al.Plant Cell81793-1807(1996))。除了引起HR机制，还诱导其它的防御反应(Hammond-Kosack and JonesPlant Cell 81773-1791(1996))如活性氧(active oxygen species)的产生、细胞壁的加强、植物抗毒素的产生、PR蛋白质等的有关防御蛋白质的生物合成。除了这种局部防御措施外，很多情况下，在植物非感染部位也加大了防御反应如PR蛋白质的积累等，结果导致整个植物体具有防御性。它被称作整体获得性抗性(systemicacquired resistance，SAR)，持续数周或数周以上，整个植物对继发性感染则具有抗性(Sticher et al.Annu Rev Phytopathol 35235-270(1997))。
植物启动如上所述高度分化的最初防御反应是直接或间接地由侵入的病原体所产生的被称作“诱导物(elicitor)”的分子识别性。而且科学家(Yang et al.Genes Dev 111621-1639(1997))认为作为防御措施的初期反应其中复杂信号逐级扩大是非常重要，所述复杂信号逐级扩大是指植物被感染后迅速产生活性氧或可逆蛋白质磷酸化。所述诱导物分子涉及很多种，它包括所谓的非特异性诱导物(elicitor)，例如寡糖类即很多菌类细胞壁成分壳多糖/脱乙酰壳多糖或葡聚糖的分解产物、或者如植物细胞壁的寡半乳糖醛酸，以及品种特异性诱导物如AVR9等病原菌的非病原性基因产物(Avr基因产物)或者具有中间特异性类型的诱导物如诱导物蛋白(elicitin)等(BollerAnnu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol46189-214(1995))。
Harpin是一种源于细菌的蛋白质诱导物，其诱导非宿主植物过敏进而导致细胞死亡(Wei et al.Science 25785-88(1992)，He et al.Cell731255-1266(1 993))。Harpin(harpinEa)最初源于洋梨和苹果的病原菌Erwinia amylovora Ea321菌株系，以及通过包含hrp基因簇的粘粒转化形成的大肠杆菌转化体，并作为最早的源于细菌的HR诱导物蛋白质纯化，且克隆出编码该蛋白质的hrpN基因(Wei et al.Science25785-88(1992))。后来，又在豆类的病原菌即丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.Syringae)61菌株系，通过筛选大肠杆菌基因表达文库和烟草叶上HR的活性作为指标经过鉴定并确定为由hrpZ基因编码的harpinpss(He et al.Cell 731255-1266(1993)以及特表平8-510127)。这两个harpin的同源性很低，只不过在22个氨基酸上看到比较高的同源性。而且关于harpin的病原性的作用机理至今还不清楚。除了上述的病原菌外，第3个蛋白质从番茄的病原菌即茄植物杆菌(Pseudomonas solanacearum)GMI 1000菌株系中鉴定出PopA蛋白质(Arlat et al.EMBO.J.13543-553(1994))，所述PopA蛋白质在非宿主的烟草里作为诱导HR的蛋白质(由PopA编码)。PopA基因与hrpN基因和hrpZ基因不同，PopA基因位于hrp簇的外侧，但受hrp调节子的调控，这一点与其它基因一致。以上所述3种蛋白质是一种富含甘氨酸的热稳定蛋白质，在非宿主烟草植物上诱导HR，至少在离体条件下依赖于hrp蛋白质分泌到细胞外。除此之外，其它报道还有HrpW蛋白质(Charkowski et al.J.Bacteriol.1805211-5217(1998))具有与上述相同功能的蛋白质源于丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.Tomato)DC3000菌株系，HrpZpst蛋白质、HrpZpsg蛋白质(Preston etal.Mol.Plant-Microbe.Interact.8717-732(1995))作为harpinpss同系物，harpinEch蛋白质(Bauer et al.Mol.Plant-Microbe. Interact.8484-491(1995))和hrpNEcc蛋白质(Cui et al.Mol.Plant-Microbe.Interact.9565-573(1996))作为harpinEa同系物。
由harpin而导致的局部坏死斑的形成并不是由于harpin的细胞毒性而导致所谓的坏死(necrosis)，从各种代谢抑制物的研究明确得知它是植物进行的一种阳性反应而导致的细胞死亡(He et al.Mol.Plant-Microbe.Interact.7289-292(1994)以及He et al.Cell.731255-1266(1993))，这种细胞过敏死亡有人认为是程序性细胞死亡中的一种(Desikan et al.Biochem.J.330115-120(1998))。将harpinpss加入拟南芥属(Arabidopsis)培养细胞，则诱导出NADPH氧化酶中的一个主要成分即gp91-phox同系物(J.Exp.Bot.491767-1771(1998))，或促细胞分裂剂激活性蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAP)(Desikan et al.Planta.21097-103(1999))，所述NADPH氧化酶在抗病反应的初期中氧化爆发作用(oxidative burst)起着非常重要的作用。进而harpin对整个植物来说可以赋予整体获得性抗性(SAR)。例如，通过人工方法将harpinEa注入到植物细胞内则可以将水杨酸或NIM基因介导的SAR诱导至拟南芥属(Arabidopsis)植物(Dong et al.The Plant J.20207-215(1999))，另外，harpinpss可以诱导黄瓜的SAR，并且对真菌、病毒、细菌可赋予广谱抗性(Strobel et al.Plant J.9431-439(1996))。
因此，有报告分析，将纯化的harpin通过人工的方法注入或者喷洒于植物体上可诱导细胞过敏死亡或获得性抗性反应(特表平11-506938、Strobel et al.Plant J.9431-439(1996)以及Dong et al.The Plant J.20207-215(1999))。但是，还没有报道，编码如harpin之类的诱导物蛋白的基因引入植物之后，如何培育转基因植物以及分析该转基因植物。
发明的概要一旦编码如harpin之类的诱导物蛋白的基因被引入植物之后，则植物将把一定量以上的诱导物蛋白进行表达，即使没有病原的正常情况下也是如此；或者在不包括受病原侵害器官的器官上也把一定量以上的诱导物蛋白进行表达，可以想象其结果是，产生各种意想不到的反应，而导致植物不能正常发育。本发明所要解决的技术问题就是提供一种具有转基因抗病植物并可诱导正当防御反应，以及培育该植物的方法。
本发明人经过刻苦钻研，发现通过引入Pseudomonas syringae pv.Syringae LOB2-1菌株系的hrpZ基因而转化形成转基因烟草植物，该烟草转基因植物对二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)的接种，产生了类似过敏反应，形成局部坏死斑并获得抗病，进而完成了本发明。尤其感到意外的是，即使使用在整个植物体的细胞中表达的组成型启动子(椰花菜花叶病毒35SRNA基因启动子)表达导致细胞死亡的harpin，所表达的植物也能够正常地发育。并且类似细胞过敏死亡的反应仅仅在病原菌接种之后才被诱导。本发明人又发现引入同样的hrpZ基因转化形成的水稻(rice)转基因植物也获得了抗稻瘟病(Magnaporthe grisea)的抗性，并显示出本研究具有广泛的应用价值。
本发明提供一种转基因抗病植物，它能把有效量的诱导物蛋白通过组成型、诱导型、器官特异型、或发育期特异型进行表达，其目的是诱导防御反应，所述转基因抗病植物主要通过使用表达盒进行转化，所述表达盒包括可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及由该启动子调控的编码诱导物蛋白的基因。


图1表示本发明的构建，以及引入植物的构建体。
图2所示照片表示在T0代转基因的烟草和水稻中通过Western分析检测harpinpss积累的例子。PC表示作为对照组大肠杆菌表达的harpinpss。
图3所示照片表示T1代转基因的烟草中产生的局部坏死斑的情况。
A引入PALL-hrpZ的个体(接种第5天，harpin的表达水平++)，B引入35S-hrpZ的个体(接种第7天，harpin的表达水平++)图4所示照片表示T1代转化的烟草具有抗二孢白粉病(右面为引入35 S-hrpZ的个体，harpin的表达水平++，左面为对照的SR1；两者均为接种的第11天)。

发明内容
本发明又提供培育转基因抗病植物的方法，所述转基因植物用于诱导防御反应并能把有效量的诱导物蛋白通过组成型、诱导型、器官特异型、或发育期特异型进行表达。该方法的步骤包括(a)通过使用表达盒获得转基因植物细胞，所述表达盒包括可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子，以及编码该启动子调控的诱导物蛋白的基因；和(b)使该转基因植物细胞再生为植物体。
本发明还将提供一种表达盒，它可用于培育转基因抗病植物。该表达盒至少包括(a)可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子；和(b)编码该启动子调控的诱导物蛋白的基因。
所述诱导物是指，引起植物产生防御反应的物质的总称。本发明除了蛋白质之外，还包括重金属离子、病原菌或植物细胞壁成分等。而本说明书中所说的诱导物，除了特殊情况，均为蛋白质诱导物。
本发明所说的诱导物蛋白可以是，在即将进行转化的植物中可引起适当防御反应的蛋白质，优选针对病害微生物具有诱导过敏反应活性的蛋白质。因此它包含harpin以及具有与harpin功能相同的harpin样蛋白质。harpin是一种依赖于hrp基因由III型分泌系统注入到植物中的蛋白质。例如，它包括除harpinpss(He et al.Cell 731255-1266(1993)以及特表平8-510127)外的harpinEa(Wei et al.Science 25785-88(1992)以及特表平11-506938)、PopA(Arlat et al.EMBO J 13543-553(1994))、hrpW蛋白质(Charkowski et al.J Bacteriol 1805211-5217(1998))。具有过敏反应诱导活性的蛋白质可以是，如(a)由序列表SEQ ID NOs2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在序列表SEQ ID NOs2所示的氨基酸序列具有一个或数个氨基酸被缺失、取代、添加或插入并且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；或者(c)至少与序列表SEQ ID NOs2所示的氨基酸序列具有不低于50％的同源性(优选不低于80％，更优选不低于90％，再优选不低于97％。)，并且具有过敏反应诱导活性的蛋白质。所述具有序列表SEQID NOs2所示氨基酸序列的蛋白质是一种新型蛋白。因此，本发明又可提供如下任何一种蛋白(a)由序列表SEQ ID NOs2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在序列表SEQ ID NOs2所示氨基酸序列中，具有一个或数个氨基酸被缺失、取代、添加或插入并且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；或者(c)与序列表SEQ ID NOs2所示的氨基酸序列至少具有不低于97％的同源性，并且具有过敏反应诱导活性的蛋白质(但是，从本发明的范围来看，不包括已知蛋白质)。
在本说明书中所说的氨基酸序列“同源”的含义是指在比较序列之间的构成每个序列的氨基酸残基的等同程度。这时，应考虑氨基酸的性质以及缺口(gaps)的情况(Wilbur，Proc，Natl.Acad.Sci.USA80726-730(1983)等)。同源性的计算可以使用市售的软件BLAST(AltschulJ.Mol.Biol.215403-410(1990)、FASTA(PeasronMethods in Enzymology 18363-69(1990)))等。
另外，在本说明书中所说氨基酸序列有“一个或数个氨基酸被缺失、取代、添加或插入”的含义是指，通过定点诱变等公知技术方法而被置换等，或者自然发生时有数个氨基酸被置换等。数个氨基酸的意思是指，例如不超过10个，优选不超过3-5个。
对于本领域技术人员来说，编码本发明表达盒所用的诱导物蛋白质的基因可以根据常规方法很容易分离得到。
所述编码诱导物蛋白质的基因可以为如下所示碱基序列的DNA分子(a)由序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列组成；(b)在序列表SEQ IDNOs1所示碱基序列中具有一个或数个碱基被缺失、取代、添加或插入并且编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列；(c)在严谨的条件下，与序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列杂交且编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列；(d)与序列表SEQ IDNOs1所示碱基序列的DNA至少具有不低于50％的同源性(优选不低于80％，更优选不低于90％，再优选不低于97％。)并且还编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列。所述具有序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列的DNA为新型DNA。因此，本发明又提供如下任一DNA分子组成的基因(a)由序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列组成；(b)在序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列中具有一个或数个碱基被缺失、取代、添加或插入并且编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列；(c)在严谨的条件下，与序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列杂交且编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列；(d)与序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列的DNA至少具有不低于50％的同源性(优选不低于80％，更优选不低于90％，再优选不低于97％。)并且还编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列(但是，从本发明的范围来看，不包括如Pseudomonas syringae pv.Syringae 61菌株系的hrpZ基因等已知的基因)。另外，关于碱基序列的同源性的计算可以使用市售的软件。
在本说明书中所说碱基序列有“一个或数个碱基被缺失、取代、添加或插入”的含义是指，通过定点诱变等公知技术方法被置换，或者自然发生时有数个碱基被置换等。数个碱基的意思是指，例如不超过10个，优选不超过3-5个。本说明书中所说的严谨条件是指，温度约为40℃以上，盐浓度约为6×SSC(1×SSC＝15mM柠檬酸钠缓冲液；pH7.0；0.15M氯化钠；0.1％SDS)，优选温度约为50℃以上，更优选约65℃以上的杂交条件。
本发明所使用的启动子可以是具有基因启动子功能的启动子，所述基因启动子在转基因植物中作为编码诱导物蛋白的基因启动子。本发明可以使用的启动子为可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子。
所述组成型基因表达的启动子(有时也称作组成型启动子)是指，在基因转录时，器官特异性和/或发育期特异性很低的启动子。所述组成型启动子包括如花椰菜花叶病毒35S启动子、遍在蛋白启动子(Comejoet al.Plant Mol.Biol 23567-581(1993))、肌动蛋白启动子(McElroy et al.Plant Cell 2163-171(1990))、α-微管蛋白启动子(Carpenter et al.PlantMol.Biol 21937-942(1993))、Sc启动子(Schenk et al.Plant Mol.Biol391221-1230(1999))。在转基因植物中，使诱导物蛋白进行组成型表达的表达盒包括，例如众所周知的组成型启动子。
所述可使诱导型基因表达的启动子(有时也称作诱导型启动子)是指，与光、病、创伤、诱导物相接触通过物理的或化学的刺激而诱导转录的启动子。所述诱导型启动子包括豌豆PAL启动子、Prp1启动子(特表平10-500312)、hsr203J启动子(Pontier et al.Plant J 5507-521(1994))、EAS4启动子(Yin et al.Plant Physiol 115437-451(1997))、PR1b1启动子(Tomero et al.Mol Plant Microbe Interact 10624-634(1997))、tap1启动子(Mohan et al.Plant Mol Biol 22475-490(1993))、AoPR1启动子(Warner et al.Plant J 3191-201(1993)。在转基因植物中，使诱导物蛋白进行诱导型表达的表达盒包括，如众所周知的诱导型启动子。
所述可使器官特异型基因表达的启动子(有时也称作器官特异型启动子)是指，在基因转录时赋予器官的特异性，如器官包括叶、根、茎、花、雄蕊、雌蕊等。所述器官特异型启动子包括例如，PPDK(Matsuokaet al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.909586-9590(1993))或PEPC(Yanagisawa and IzuiJ Biochem 106982-987(1989)以及Matsuokaet al.Plant.J.6311-319(1994)、Rubisco(Matsuoka et al.Plant.J.6311-319(1994))这种与光合作用有关的基因在绿色器官中使基因高度表达的启动子等。在转基因植物中，使诱导物蛋白进行器官特异型表达的表达盒包括，如众所周知的器官特异型启动子。
所说可使发育期特异型基因表达的启动子(有时也称作发育期特异型启动子)是指，在转录时赋予发育时期的特异性，如所述发育期包括发育初期、中期和后期等。发育期特异型启动子包括例如，在SAG12启动子(Gan and AmashinoScience 2701986-1988(1985))这样老化叶子中特异性表达的启动子。
本发明表达盒中用于亚克隆各主要DNA片断的载体可按照本领域常规方法将所要的基因连接入载体重组(质粒DNA)从而可方便地制备出用于所使用的载体，但不限于此例，具体地包括来自大肠杆菌的质粒，例如，pBluescript、pUC18、pUC19、pBR322。
为将本发明表达盒引入到目标植物中的载体优选使用用于植物转化的载体。所述用于植物的载体并不作特殊的限定只要它能够在植物细胞中进行表达它所应表达的基因而且还具有生产相关蛋白质能力的均可，比如，pBI221、pBI121(Clontech)以及由它们衍生的载体。另外，尤其是单子叶植物的转化可举例为，pIG121Hm、pTOK233(均为Hiei等，PlantJ.，6，271-282(1994))、pSB424(Komari等，Plant J.，10，165-174(1996))，超双元载体pSB21以及由它们衍生的载体等。本领域技术人员通过已知的方法将编码诱导物蛋白的基因引入(必要时，可重组启动子区域)到那些已知的载体上进而可构建包含有本发明表达盒的重组载体。例如，通过把hrpZ基因重组到超双元载体pSB21上则可构建包含组成型启动子和hrpZ在内的表达盒的重组载体。从该重组载体除去已有的启动子，再通过重组诱导型启动子则可构建包含诱导型启动子和hrpZ在内的表达盒的重组载体。
用于植物转化的载体优选，至少包括启动子、翻译起始密码子、目的基因(本发明的DNA序列或其部分序列)、翻译终止密码子以及终止子。另外，还可适当包括，如编码信号肽的DNA、增强子序列、目的基因的5′和3′侧的非翻译区、选择标记区。所述标记基因，除了以下抗生物质的抗性基因外如，四环素、氨苄青霉素、或卡那霉素、或新霉素、潮霉素或大观霉素，还包括，虫荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、β-内酰胺酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)等。
所述转植物基因的方法可举例为，土壤杆菌介导法(Horsch et al.，Science，227，129(1985)；Hiei et al.，Plant J.，6，271-282(1994))、叶盘转化法(Horsch et al.，Science，227，1229-1231(1985))、电穿孔法(Frommet al.，Nature，319，791(1986))、PEG法(Paszkowski et al.，EMBO J.，3，2717(1984))、显微注射法(Crossway et al.，Mol.Genet.，202，179(1986))、微粒轰击法(minute substance collision)(McCabe et al.，Bio/Technology，6，923(1988))等，只要是将基因引入所需的植物中其方法不作特殊限定。在上述的转基因方法中，优选利用接合操作等把载体引入土壤杆菌内，再使该土壤杆菌感染植物。所述感染方法对于本领域普通技术人员来说是众所周知的。例如包括，使植物体的一部分创伤，在该创伤部位接种细菌的方法；还有使植物体的胚胎组织(包括未成熟胚)接种细菌的方法；使愈伤组织接种细菌的方法；使细菌同植物细胞原生质体共培养的方法；或者使细菌感染植物叶片组织，即叶盘转化法。
得到的转化细胞可以根据适当标记物作为指标或者根据是否已表达所要的性状从而在其它的细胞中进行筛选。进一步地，通过利用现有技术使之再生，则能得到所要的转基因植物。
得到的转化体可以根据本领域技术人员所周知的各种方法进行分析。例如，以引入的基因DNA序列为基础合成寡核苷酸引物，用该引物通过PCR法可以分析转基因植物的染色体DNA。还可分析与引入的基因相对应的mRNA或者有无蛋白质表达。更进一步地还可分析植物体的外观(如，当引入编码产生局部坏死斑的蛋白质基因时，是否出现局部坏死斑或其坏死斑的大小、数目等)、抗病(如使植物体与病原菌接触时有无抵抗能力、或其抵抗程度)等。
在本发明转基因植物中，用于诱导防御反应可使有效量的诱导物蛋白质进行组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型表达。所说用于诱导防御反应的有效量是指，所表达的诱导物蛋白的量可使植物至少在其局部可引起有关防御反应(例如，细胞过敏死亡(局部坏死)的诱导)。优选有效量为，防御反应不仅仅是在局部，而是在整个植物体中的量，其结果就是遍布整个植物体(整体获得性抗性)。另外还优选当局部坏死斑达到非常大的程度时，该有效量不能超过坏死斑的局部组织枯死的量。
在本发明转基因植物中，优选诱导物蛋白质的有效量表达的标准为，通常由于不表达或者即使表达其表达量也很低且正常条件下明显不妨害植物生长的发育，当植物受到病原菌侵害刺激时则诱导产生防御反应。例如，当诱导物蛋白质为harpinpss时，通常，harpinpss不表达或者即使表达产生的局部坏死斑也不至于使植物体的器官枯死。当病原菌侵入时，优选harpinpss的基因表达量足以引起过敏反应。进一步优选harpinpss的基因表达量为即使病原菌侵入并积累了harpinpss又无法用肉眼观察到局部坏死斑，但是，整个植物体已具有抗病。
为了诱导上述的适当防御反应，例如，则应使用可诱导型基因表达的启动子。因此，在本发明的一种实施方式中，采用诱导型启动子和harpin基因联合进行表达。
为了达到适当防御反应除了使用诱导型启动子外，还可使用组成型启动子。因此，在本发明其它实施方式中，采用组成型启动子和harpin基因联合表达的方式。此时，作为产生适当防御反应的机理，例如，可推测harpinpss等的蛋白质虽然在植物细胞的细胞膜外或细胞壁上被识别，即使细胞质内积累了harpinpss蛋白，但在真菌侵入导致细胞破裂之前是无法识别植物细胞，其结果是，病原菌接种后产生过敏反应，或者在harpinpss的诱导活性上是否存在着引起病原菌接种的其他什么因素。
本发明转基因植物包括，抗二孢白粉病的转基因烟草，该烟草通过使用表达盒而进行转化，所述表达盒包括组成型或诱导型启动子、编码由该启动子调控的如harpinpss的诱导物蛋白的基因；转基因植物还包括抗稻瘟病转基因水稻，该水稻通过使用表达盒而进行转化，所述表达盒包括组成型启动子、编码由该启动子调控的如harpinpss的诱导物蛋白的基因。
本发明除了下面实施例所记载的烟草、水稻之外，还适用于其他植物，这些植物包括农作物，例如小麦、大麦、黑麦、玉米、甜菜、高粱、棉花、向日葵、花生、番茄、马铃薯、甘薯、豌豆、大豆、赤豆、莴苣、卷心菜、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜青、萝卜、菠菜、洋葱、胡萝卜、大蒜、茄子、南瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、草莓、葡萄等；观赏植物包括，例如拟南芥、矮牵牛、菊花、康乃馨、非洲紫罗兰、百日菊。另外，本说明书中所说的“转基因植物”都是通过本发明方法获得重组植物细胞，再通过该重组细胞再生为植物体以获得转基因植物的T0代，所说转基因植物不仅包含T0代，还包含由该T0代转化而得的后代(T1代)植物，然而只要保持抗病的性状均可称为本说明书中所说的“转基因植物”。还有，除了特殊描述之外，在本说明书中所说的“植物”，除植物体(个体)，还包括种子(包括发芽种子、未成熟种子)、器官或器官的一部分(包括叶、根、茎、花、雄蕊、雌蕊、以及它们的一部分)、植物培养细胞、愈伤组织、原生质体。
在下面实施例中分析的植物病害包括烟草的二孢白粉病和水稻的稻瘟病，但是作为烟草的其它病害还包括，野火病、细菌性萎焉病、TMV等，而作为水稻的其它病害还包括，鞘疫病(sheath blight disease)、细菌性叶疫病等，由本发明培育抗病植物的方法能够充分地赋予这些病害的抵抗能力。
使用限制性内切酶HindIII、XbaI消化pSB21再除去35S启动子，并整合玉米PPDK启动子0.9kb片断(Taniguchi et al.，Plant Cell Physiol4142-48(2000))。再用XbaI、SacI消化已完成的质粒，除去GUS基因之后，再插入上述的hrpZ XbaI-SacI片断。则构建PPDK-hrpZ(PPDK启动子-hrpZ基因-Nos终止子)。玉米PPDK启动子是一种在光合作用的器官上如叶肉细胞内高表达的启动子(Taniguchi et al.，Plant CellPhysiol 4142-48(2000))，推测通过使用该构建体转化的水稻在绿色器官上积累了hrpZ基因产物-harpinpss。
PAL启动子的克隆如下所述。抽提土壤杆菌LBA4404菌株(冈山大学，白石教授赠与)的质粒DNA，该质粒中的构建体(PSPAL1启动子-GUS基因-NOS终止密码子)包含PSPAL1(Yamada et al.，Plant CellPhysiol 35917-926(1994)以及Kawamata et al.，Plant Cell Physiol38792-803(1997))。另一方面，以报道过的PSPAL1启动子碱基序列(专利JP 1993153978-A1 22-JUN-1993；TAKASAGO INTERNATL CORP)为基础设计了反向引物PALRVXbaGGG GTC TAG AAT TGA TAC TAA AGT AAC TAA TG以及2个正向的引物PALFFHinTTG GAA GCT TAG AGA TCA TTA CGA AAT TAA GGPALFSHinCTA AAA GCT TGG TCA TGC ATG GTT GCT TC在PALRVXba与PALFS Hin组合中，扩增翻译起始点上游约0.45kb(转录起始点上游约0.35kb)的启动子区，在PALRVXba与PALFFHin组合中，扩增约1.5kb(PAL-L)的启动子区。使用所述的引物，以土壤杆菌质粒的DNA为模板进行PCR反应。所述PCR反应条件为，反应溶液的量为50μl、每种引物均为0.5μM、dNTP为0.2mM、1×ExTaq溶液、ExTaq DNA聚合酶(宝酒造)1U，所进行的PCR反应条件是94℃3分之后，94℃1分、50℃1分、72℃2分循环30次，然后再进行一次72℃6分的反应。PCR反应产物被克隆为载体pCRII(invitrogen).
PsPAL1启动子在翻译起始点142bp上游处具有HindIII酶切位点，因此，用限制酶XbaI完全消化PAL-S之后，再用HindIII进行部分消化，得到pCRII的0.45kb片断。用所述的HindIII、XbaI消化pSB21，以除去35S启动子，再整合PAL-S。另外，这里所用的pSB21载体框架部分唯一存在的PvuII位点将被除去，在唯一的EcoRI部位(位于Nos终止子之后)由PvuII接头取而代之，。进一步用XbaI、XhoI消化重组PAL-S的质粒，除去GUS基因后，插入前面所述的hrpZ XbaI-SacI 1.1kb片断。按照以上的步骤构建PALS-hrpZ。下面使用限制酶XbaI、SacI消化被重组到pCRII上的PAL-L，选出1.45kb PAL启动子，用同样的酶进行共消化得到载体pSB11，并把1.45kb PAL启动子重组到该载体上(Komari etal.，Plant J.10165-174(1996))。用XbaI、SmaI消化刚完成的质粒，并插入PALS-hrpZ的XbaI-PvuII片断(hrpZ-Nos终止子)。从而完成PALL-hrpZ的构建。PAL启动子虽然是组成型表达水平很低的启动子，但它是一种病原菌或创伤诱导极强的启动子(Yamada et al.，Plant CellPhysiol 35917-926(1994)以及Kawamata et al.，Plant Cell Physiol38792-803(1997))，通过PALS-hrpZ或PALL-hrpZ转化的烟草当产生了这种胁迫刺激时，推测会有更多的harpinpss在所刺激的部位积累。此时，推测PALL的harpinpss比PALS积累得更多。
含有如上所述构建的4种构建体，即35S-hrpZ、PALS-hrpZ、以及PALS-hrpZ、PALL-hrpZ(图1)的大肠杆菌菌株LB392，含有筛选标记基因重组的载体pSB4U(玉米泛激素启动子-潮霉素抗性基因(hptII)-NOS终止子)的土壤杆菌菌株LBA4404，以及含有辅助质粒pRK2013的大肠杆菌菌株HB101通过三菌系接合法(tri-parental mating system)进行同源重组将含有hrpZ的构建体引入土壤杆菌。
根据叶盘转化法(Horsch et al.，Science，227，1229-1231(1985))转化烟草。把温室内培育的烟草品种SR1的叶子用70％的酒精消毒30秒，然后再用稀释5倍的安替拂民消毒5分钟，用灭菌水洗涤2次后，切取约1cm大小的叶片，使之接种土壤杆菌的悬浮液。转化苗的诱导筛选时以及生根时的潮霉素浓度分别为50或100mg/ml、0或50mg/ml。按照转基因水稻的方法(Hiei等，Plant J.，6，271-282(1994))介导土壤杆菌转化源于水稻品种“月之光(Tsukinohikari)”和“Koshihikari”的未成熟胚的愈伤组织。
1) T0代的Western分析用研钵将发育至4-5个叶片期的转基因烟草植物和非转烟草植物(SR1)的叶片(2×2cm)放在0.1M HEPES-KOH pH7.5溶液中进行研磨。以15000g转速离心10分钟，离心后的上清液用作蛋白质标样。用Bio-RadProtein Assay kit(BIO-RAD)进行蛋白质定量分析。取20μg的蛋白质，按照Laemmni等方法(Nature 227680-685(1970))，通过SDS-PAGE法对蛋白质进行分级。使用12.5％PAGEL(ATTO)的凝胶，经电泳之后，把凝胶中的蛋白质带转移至PVDF(Millipore)膜上。PVDF膜在含有0.5％脱脂粉的1×TBS缓冲溶液中处理30分钟后，在室温下用含有1/1000(v/v)的抗harpinpss血清的相同溶液过夜震荡。二次抗体采用1/1000(v/v)浓度的抗山羊兔IgG过氧化物酶标记共轭物(MBL)或抗山羊兔IgG碱性磷酸酶共轭物(BIO-RAD)。而染色分别采用了HRP显色剂 (ColorDevelopment Reagent)(BIO-RAD)，碱性磷酸酶底物试剂盒II(alkalinephosphatase substrate kit II)(Vector laboratories)。通过使用密度计(GS-670型，BIO-RAD)比较已知浓度harpinpss标样的显色度来求出蛋白质的表达水平。T0代的Western分析结果一部分于图2所示，而其全部结果汇总于表1中。
蛋白质的表达水平可用4个阶段(+++、++、+、-)表示，它们各自总的可溶性蛋白质超过0.1％时则表示为(+++)，在0.05-0.1％之间则表示为(++)，低于0.05％时则表示为(+)，低于检测界限时则表示为(-)。后述表2、3和4相同。
表1 烟草T0代的Western分析结果构建体 再生个体harpinpss表达量a数- + ++ +++bPALS-hrpZ 101 8 1 0PALL-hrpZ 162 10 4 035S-hrpZ 156 2 1 6SR1 3 0 0 0a数值表示每个表达水平的个体数。bharpinpss表达水平用4个阶段(+++表达极高、++高度表达、+中等至低水平的表达、-低于检测界限的表达)表示。
当包含PAL启动子的构建体则80％以上的个体可检测出harpinpss的积累。另外，如所预想的，PALL比PALS高度表达(++)的个体所占比例大。另一方面，当包含35S启动子的构建体则在15个个体中有harpinpss的积累，虽然有6个个体完全没有积累harpinpss，但是获得了近半数的7个高度表达的个体。而且这其中有6个个体显示出蛋白质表达极高(+++)。更有趣的是在这些高度表达的个体中其植物的叶、茎、根或花器官中没有看到形态学上的变化，而且种子的育性几乎都是正常的。
2)T1代的Western分析和抗病的检测用T0代中harpinpss积累量很高的以下8个体系针对二孢白粉病菌(Erysiphe cichoracearum)的反应进行分析。所述8个体系包括KH1-2(PALS-hrpZ)、KC6-7(PALL-hrpZ)、KC8-1(PALL-hrpZ)、KK1-1(35S-hrpZ)、KK3-8(35S-hrpZ)、KK4-2(35S-hrpZ)、KK4-3(35S-hrpZ)、KK7-6(35S-hrpZ)。
选定T0代中harpinpss积累量高的烟草个体，得到自我繁殖后代(T1)的种子。把种子播种下去，连续观察约2个月左右，但在这段时间里没有看到形态学上的变化，同T0代的发育一样为正常发育，而且在叶表面上也没有看到过敏反应。然后又对4-5叶子期的转化烟草的T1代进行二孢白粉菌的喷雾接种，试测其抗病。用约2L的1.4×106孢子/ml二孢白粉菌孢子悬浮液喷雾播种于244个重组个体及4一个原品种个体之上。其结果是，接种后4或5天时在重组体的下部叶子上诱导出过敏反应样的局部坏死斑(图3A、B)。更惊人的是不仅仅PAL-hrpZ，在包含组成型启动子的35S-hrpZ构建体中，也诱导出病原菌感染后特异性出现局部坏死斑(图3B)。病原菌接种后的第5天局部坏死斑的出现频率在非重组体中为5％左右，而在35S-hrpZ构建体中是非重组体的6-14倍(30-71％)，在PAL-hrpZ重组体中是非转化体的4-5倍(20-27％)(表2)。其后，在PAL-hrpZ重组体中局部坏死斑的数目逐渐增加。推测PsPAL1启动子可能是与二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)发生反应的原故。harpinpss积累量和局部坏死斑的形成成正向关系(表3)，至少在我们进行的Western分析重组体个体中没有检测到harpinpss的积累，而这种局部坏死斑的发生是个例外情况。
为了研究在感染二孢白粉菌后所发生的局部坏死斑与抗病之间是否有存在着关联性，发明人研究了接种后第11天感染二孢白粉病的病状。研究结果表明，在非重组个体中没有二孢白粉菌丝生长受到抑制的现象，相反在35S-hrpZ构建体中有15-57％的个体，在PAL-hrpZ构建体中有13-18％的个体比非重组个体明显看到了轻微病状(图4，表2)。不仅仅是产生局部坏死斑的叶子就是不产生局部坏死斑的中部叶子至上部叶子其二孢白粉病蔓延也得到控制，认为这是整体获得性抗性(SAR)的作用。用棉染蓝染色观察二孢白粉菌的菌丝时，作为对照的原系统SR1患病叶其二孢白粉菌的菌丝在旺盛生长的叶表面上扩大，相反虽然在转化体叶表面上形成吸器，但其菌丝生长受到抑制，结果菌丝生长停止。本研究所使用的启动子为35S(组成型启动子)和PAL(诱导型启动子)，使用35S比使用PAL时局部坏死斑出现的频率高，而且至少在接种后第11天的研究中，获得许多高抗病个体(表2)。但是，当使用35S启动子时，在一些个体中与病原菌反应形成的局部坏死斑变得非常大(占叶表面的10％以上)，而且还观察到植株下部的叶子枯死掉。还有，即使在harpinpss积累的个体中有时用肉眼也观察不到局部坏死斑(表2)，像这样的个体就具有二孢白粉病抗性(在表2局部坏死斑(-)个体中，表示括号内的个体数。harpinpss表达水平均用++表示)。认为有可能是在非常微小的范围内发生了过敏反应。通过筛选这样的个体认为可以获得应用价值很高的抗病植物。在组成型启动子中控制转录hrpZ时没有病原菌的侵入则不产生局部坏死斑，该现象是由于harpinpss在植物细胞的细胞膜外或细胞壁上被识别，在细胞质中积累的harpinpss在直到引起细菌侵入而细胞破坏之前都不被植物细胞所识别，可以推论接种病原菌后产生了过敏反应。或者也许是在harpinpss的诱导活性上存在某种导致病原菌接种的因子、或者存在来自病原菌或植物以及其它什么因子、或者是该诱导活性需要诱导。
表2 烟草T1代中harpinpss积累量、局部坏死斑的形成以及与抗病的关系菌系名称 构建体 表达水平(T0)分析个体数(T1)KH1-2 PALS-hrpZ ++ 18KC6-7 PALL-hrpZ ++ 43KC8-1 PALL-hrpZ ++ 44KK1-1 35S-hrpZ+++ 23KK3-8 35S-hrpZ+++ 33KK4-2 35S-hrpZ++ 35KK4-3 35S-hrpZ+++ 7KK7-6 35S-hrpZ+++ 41SR1(对照) -41菌系名称 局部坏死斑产生的病斑进展 局部坏死斑产 病斑进展缓慢(其中为个体数缓慢的个体数)生的比例(接种的个体比例(接+++ ++ +-a第5天) 种第11天)KH1-2(PALS) 0 0 5(3) 13(0) 27％ 16％KC6-7(PALL) 0 1(1) 8(6) 34(1) 20％ 18％KC8-1(PALL) 0 1(0) 11(5)32(1) 27％ 13％KK1-1(35S)0 0 7(3) 16(1) 30％ 17％KK3-8(35S)0 2(0) 11(5)20(0) 39％ 15％KK4-2(35S)1(1) 4(3) 15(6)15(0) 57％ 28％KK4-3(35S)0 3(3) 2(1) 2(0) 71％ 57％KK7-6(35S)1(1) 4(4) 18(4)18(1) 56％ 24％SR1(对照) 0 0 2(0) 39(0) 5％ 0％a将局部坏死斑出现的程度用4个阶段(+++非常多、++多、+少、-无)表示表3.烟草T1代中harpinpss积累量和局部坏死斑产生数量的关系harpinpss的表达水平a局部坏死斑产生的程度b局部坏死斑产生频率(Western分析)+++ ++ + -+++ 1 41919 56％++ 0 53277 32％+1 61838 40％-0 15 18 25％SR1 0 02 39 5％aharpinpss的表达水平用4个阶段(+++表达极高、++高度表达、+中等至低水平的表达、-低于检测界限的表达)表示(SR1为-)。b将局部坏死斑出现的程度用4个阶段(+++非常多、++多、+少、-无)表示。
(2) 转基因水稻植物1)T0代的Western分析把harpinpss引入“月之光”品种。获得35个35S-hrpZ再生植物个体和26个PPDK-hrpZ再生植物个体。在这些构建体中没有看到转化率之间有明显差异。对转化当代(T0)进行Western分析，筛选出高表达的个体。
用与上述烟草同样的方法提取再生的转基因水稻品种(月之光)的蛋白质，并进行Western分析，T0代的Western分析结果如表4所示。
表4 水稻“月之光”T0代的Western分析结果构建体 再生个体 harpinpss表达量a数- + +++++b35S-hrpZ 35 175 130PPDK-hrpZ26 9 13 4 0a数值表示每个表达水平的个体数。b把harpinpss表达水平用4个阶段(+++表达极高、++高度表达、+中等至低水平的表达、-低于检测界限的表达)表示。
水稻“月之光”同烟草的情形相同并获得了高表达harpinpss的个体(参照图2)。包含35S-hrpZ启动子的构建体约半数个体检测出harpinpss的积累，尤其是高表达个体(++)的比例超过全部的1/3。包含PPDK-hrpZ启动子的构建体约2/3的个体中检测出harpinpss的积累，其中有4个个体是高表达的。更有趣的是在这些高表达个体的叶、根或花器中没有观察到形态学上的变化。另外，其种子的育性也几乎都是正常的，因此可以获得高表达个体的T1种子。
2)T0代的Western分析和T1代的抗病鉴定将harpinpss引入日本最重要的水稻品种Koshihikari。表5表示T0代的Western分析结果。
表5 水稻“Koshihikari”T0代的Western分析结果构建体 再生个体 harpinpss表达水平a数- + +++++b35S-hrpZ 78 18 33 216PPDK-hrpZ27 7 13 7 0a数值表示每个表达水平的个体数。b把harpinpss表达水平用4个阶段(+++对总可溶性叶蛋白质大于0.5％的积累量、++0.1-0.5％的积累量、+0.01-0.1％的积累量、-低于检测界限的表达)表示。
在引入35S-hrpZ构建体T0代的个体中，筛选其中harpinpss积累量非常高(表5中的+++)的4个个体(hrp5-8、hrp23-5、hrp24-1、hrp42-9)然后研究它们T1代对水稻稻瘟病的患病程度。所选定的4个高表达个体的种子育性是正常的，可获得很多自我繁殖的种子。把T1种子按照8粒×2行播撒在装有培植土的苗盆里，温室培育，当叶子长到4.8-5.2叶片时，鉴定叶片染病情况。水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)使用的是007小种(race)。在麦片-蔗糖琼脂培养基上接种培养稻瘟病菌(28℃、黑暗条件下)，菌落蔓延后，使用25℃下的近紫外光照射形成的分生孢子。用0.02％的Tween20调整悬浮液(1.5×105个分生孢子/ml)，在每3个苗盆中喷雾30ml悬浮液以进行稻瘟病菌的接种。经过喷雾接种的水稻在温度为25℃，湿度为100％的条件下，于加湿恒温仪内保持24小时，然后移入到温室内。温室的设定条件是，25℃光照16个小时，22℃暗处8个小时。接种6天后目测接种时最上部的展开叶子(第5片叶)对进展性病斑进行计数。其计数结果可通过Mann-Whitney U鉴定进行显著性差异的检测处理。
其结果，通过稻瘟病菌的接种并没有观察到局部坏死斑，但是在引入harpinpss的4个水稻系中，其中3个水稻系(hrp5-8、hrp42-9、hrp23-5)与对照组Koshihikari相比其平均进展性病斑数目减少了24-38％。而且这种减少是统计学上显著性的减少(表6)。以上结果显示，通过引入harpinpss可以增强水稻的抗病能力。
表6 引入harpinpss4个水稻系(T1代)对水稻稻瘟病的病性鉴定结果株系 供试个体数平均进展性病斑a(标 显著性差异的检测b准误差)hrp5-8 169.3(±1.0) 显著性(显著性水平1％)hrp23-52111.4(±1.3) 显著性(显著性水平5％)hrp24-12014.4(±1.4) 没有显著性差异hrp42-9149.4(±1.4) 显著性(显著性水平1％)Koshihikari6415.0(±0.7) -a接种6天后第5片叶子的鉴定结果。b由Mann-Whitney U对Koshihikari进行显著性差异的鉴定。
本发明首次发明了将编码harpin的基因连接于组成型启动子或诱导型启动子并引入植物中可赋予该植物的抗病。除阐明引入harpin的植物中蛋白质性质诱导物-harpin的作用机理外，还对局部或整体获得性抗性的原理作了进一步的阐明。另外，过去曾认为如果不使用诱导型启动子则很难培育出抗性植物，而通过培育引入harpinpss抗性植物表明即使使用组成型启动子也能培育出抗病植物，其适用范围广泛，而且还显示了本研究课题的广泛性。本发明提供的培育抗病植物的方法是通过将编码harpinpss的DNA序列整合至表达盒，再引入植物细胞中从而获得再生植物，所述表达盒包括如下序列在植物细胞中可发挥作用的适当的组成型、器官特异型·发育期特异型或者由环境胁迫或病虫害诱导的启动子序列，以及在植物细胞中可发挥作用的终止子序列，在本发明中已经显示出该研究课题在遗传工程学上的有效性和可行性。
序 列 表<110>日本烟草产业株式会社(Japan Tabacco Inc.)<120>抗病植物及其培育方法<130>YCT-640<150>JP 2000-271413<151>07.09.2000<160>2<210>1<211>1029<212>DNA<213>丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.Syringae)LOB2-1<400>1atg cag agt ctc agt ctt aac agc agc tcg ctg caa acc ccg gca atg 48Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15gcc ctt gtc ctg gta cgt cct gaa acc gag acg act ggc gcc agt acg 96Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Thr Glu Thr Thr Gly Ala Ser Thr20 25 30tcg agc aag gcg ctt cag gaa gtt gtc gtg aag ctg gcc gag gaa ctg144Ser Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu35 40 45atg cgc aat ggt caa ctc gac gac agc tcg cca ttg ggc aaa ctg ctg192Met Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu50 55 60gcc aag tcg atg gcc gcg gat ggc aag gca ggc ggc ggt atc gag gat240Ala Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp65 70 75 80gtc atc gct gcg ctg gac aag ctg att cat gaa aag ctg ggt gac aac288Val Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn85 90 95ttc ggc gcg tct gcg gac aac gcc tcg ggt acc gga cag cag gac ctg336Phe Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu100 105 110atg act cag gtg ctc agt ggc ctg gcc aag tct atg ctc gat gat ctt384Met Thr Gln Val Leu Ser Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu
115 120 125ctg acc aag cag gat ggc ggg gca agc ttc tcc gaa gac gat atg ccg432Leu Thr Lys Gln Asp Gly Gly Ala Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro130 135 140atg ctg aac aag atc gcg cag ttc atg gat gac aat ccc gca cag ttt480Met Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe145 150 155 160ccc aag ccg gac tcg ggt tcc tgg gtg aac gaa ctc aag gaa gac aac528Pro Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn165 170 175ttc ctt gat ggc gac gaa acg gct gcg ttc cgc tcg gca ctc gac atc576Phe Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile180 185 190att ggc cag caa ctg ggt aat cag cag agt ggc gct ggc ggt ctg gcg624Ile Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Gly Ala Gly Gly Leu Ala195 200 205ggg acg ggt gga ggt ctg ggc act ccg agc agt ttt tct aac aac tcg672Gly Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser210 215 220tcc gtg acg ggt gat ccg ctg atc gac gcc aat acc ggt ccc ggt gac720Ser Val Thr Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp225 230 235 240agc ggc aat agc agt ggt gag gcg ggg caa ctg atc ggc gag ctt atc768Ser Gly Asn Ser Ser Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile245 250 255gac cgt ggc ctg caa tcg gta ttg gcc ggt ggt gga ctg ggc aca ccc816Asp Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro260 265 270gta aac acc ccg cag acc ggt acg gcg gcg aat ggc gga cag tcc gct864Val Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ala Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala275 280 285cag gat ctt gac cag ttg ctg ggc ggc ttg ctg ctc aag ggc ctt gaa912Gln Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu
290 295 300gcg acg ctc aag gat gcc ggt caa acc gct acc gac gtg cag tcg agc960Ala Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Ala Thr Asp Val Gln Ser Ser305 310 315 320gct gcg caa atc gcc acc ttg ctg gtc agt acg ctg ctg caa ggc acc 1008Ala Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr325 330 335cgc aat cag gct gca gcc tga 1029Arg Asn Gln Ala Ala Ala340<210>2<211>342<212>prt<213>丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)LOB2-1<400>2Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Thr Glu Thr Thr Gly Ala Ser Thr20 25 30Ser Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu35 40 45Met Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu50 55 60Ala Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp65 70 75 80Val Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn85 90 95Phe Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu100 105 110Met Thr Gln Val Leu Ser Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu115 120 125Leu Thr Lys Gln Asp Gly Gly Ala Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro
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权利要求
1.一种转基因抗病植物，其通过使用表达盒进行转化，所述表达盒包括可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及编码该启动子调控的诱导物蛋白基因，所述植物用于诱导防御反应使有效量的诱导物蛋白可进行组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型表达。
2.如权利要求1所述的转基因抗病植物，其中所述可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及编码该启动子调控的诱导物蛋白基因被整合至基因组中。
3.如权利要求1或2所述的转基因抗病植物，其中所述诱导物蛋白为对病害微生物具有过敏反应诱导活性的蛋白质。
4.如权利要求3所述的转基因抗病植物，其中所述具有诱导过敏反应活性的蛋白质选自(a)由序列表SEQ ID NOs2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在序列表SEQ ID NOs2中，具有一个或数个氨基酸缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；或者(c)至少与序列表SEQ ID NOs2所示氨基酸序列具有不低于50％的同源性，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质。
5.如权利要求2所述的转基因抗病植物，其中所述编码诱导物蛋白的基因选自以下任一DNA中的基因(a)由序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列组成的DNA；(b)在序列表SEQ ID NOs1中，具有一个或数个碱基缺失、取代、添加或插入的碱基序列，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA；(c)在严谨条件下，与序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列DNA杂交，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA；或者(d)至少与序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列具有不低于50％的同源性，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA。
6.一种转基因抗病植物的培育方法，所述植物用于诱导防御反应可使有效量的诱导物蛋白进行组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型表达，其步骤包括(a)利用表达盒获得转基因植物细胞，所述表达盒包括组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及编码该启动子调控的诱导物蛋白的基因；以及(b)将该植物细胞再生为植物体。
7.一种表达盒，至少包括(a)可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子；以及(b)编码上述启动子调控的诱导物蛋白的基因；所述表达盒用于培育转基因抗病植物，该转基因抗病植物在诱导防御反应中可使有效量的诱导物蛋白进行组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型表达。
8.如权利要求7所述的表达盒，其中所述诱导物蛋白为对病害微生物具有过敏反应诱导活性的蛋白质。
9.如权利要求8所述的表达盒，其中所述具有过敏反应诱导活性的蛋白质选自(a)由序列表SEQ ID NOs2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在序列表SEQ ID NOs2中，具有一个或数个氨基酸缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；(c)至少与序列表SEQ ID NOs2所示氨基酸序列具有不低于50％的同源性，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质。
10.如权利要求7所述的表达盒，其中所述编码诱导物蛋白的基因选自以下任一DNA中的基因(a)由序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列组成的DNA；(b)在序列表SEQ ID NOs1中，具有一个或数个碱基缺失、取代、添加或插入的碱基序列，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA；(c)在严谨条件下，与序列表中SEQ ID NOs1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列DNA杂交，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA；或者(d)至少与序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列具有不低于50％的同源性，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA。
11.如权利要求7-10中任一项所述的表达盒，其用于培育整体获得性转基因抗病植物。
12.如权利要求7-11中任一项所述的表达盒，其中所述用于诱导防御反应可使有效量的诱导物蛋白在病害微生物感染时特异地表达。
13.如权利要求12所述的表达盒，其中包括组成型启动子或器官特异型或发育期特异型启动子。
14.一种重组载体，其中包括如权利要求7-13中任一项所述的表达盒。
15.一种基因，由下面任一DNA组成(a)由序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列组成的DNA；(b)在序列表SEQ ID NOs1中，具有一个或数个碱基缺失、取代、添加或插入的碱基序列，且编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列的DNA；(c)在严谨条件下，与序列表SEQ ID NOs1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列DNA杂交，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA；或者(d)至少与序列表中SEQ ID NOs1所示碱基序列具有不低于50％的同源性，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA。
16.一种编码下述任一蛋白质的基因(a)由序列表SEQ ID NOs2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在序列表SEQ ID NOs2中，具有一个或数个氨基酸缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；或者(c)至少与序列表中SEQ ID NOs2所示氨基酸序列具有不低于97％的同源性，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质。
17.一种下述任一蛋白质(a)由序列表SEQ ID NOs2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在序列表SEQ ID NOs2中，具有一个或数个氨基酸缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；或者(c)至少与序列表SEQ ID NOs2所示氨基酸序列具有不低于97％的同源性，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质。
18.如权利要求1-5中任一项所述的转基因抗病植物，其为抗二孢白粉病转基因烟草，该植物通过使用包括组成型或诱导型启动子的表达盒而进行转化。
19.如权利要求1-5中任一项所述的转基因抗病植物，其为抗稻瘟病转基因水稻，该植物通过使用组成型启动子的表达盒而进行转化。
全文摘要
本发明的研究课题就是提供一种转基因抗病植物并可适当诱导防御反应，以及培育该植物的方法。本发明提供一种表达盒，该表达盒包括可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及编码该启动子调控的诱导物蛋白基因。
文档编号C07K14/195GK1471356SQ01817905
公开日2004年1月28日 申请日期2001年9月7日 优先权日2000年9月7日
发明者高仓由光, 井上康宏, 桑田茂, 堤史树, 石田佑二, 二, 宏 申请人:日本烟草产业株式会社, 欣根塔有限公司