赋予植物抗病性的方法和材料的制作方法

专利名称：赋予植物抗病性的方法和材料的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及植物分子生物学。具体地，它涉及赋予植物抗病性的核酸和方法。
对在政府资助的研究和开发下作出的发明权利的声明本发明是在国立卫生研究院的批号GM47907和美国农业部批号No.9300834下，在政府的资助下完成的。政府对该发明有一定的权利。
背景技术：
赋予抗病性的基因座已经在许多植物种中被鉴别出。对许多植物-病原体之间相互作用的遗传分析已表明，植物含有赋予针对病原体具体种类(含有互补的无毒基因)抗性的基因座。对这些基因的分子水平的定性可提供赋予各种不同农作物抗病性的手段。
那些已经在分子水平定性的植物抗性基因分成4类。一种基因，玉米中的Hml，编码一种还原酶，它对真菌病原体Cochliobolus Carbonum有效(Johal等人，科学，258985-987(1992))。在番茄中，Pto基因赋予对表达avrPto无毒基因的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性，(Martin等人，科学，2621432(1993))。预计的Pto基因编码丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。番茄Cf-9基因赋予对携带无毒基因Avr9的真菌暗黄枝孢(Cladosporium fullvum)种类的抗性(Jones等人，科学，266789-793(1994))。番茄Cf-9基因编码推定的胞外LRR蛋白。最后，拟南芥(Arabidopsis thaliana)的RPS2基因赋予对表达avrRpt2无毒基因的丁香假单胞菌的抗性(Bent等人，科学，2651856-1860(1994))。RPs2编码具有LRR基序和P-环基序的蛋白质。
由黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)造成的细菌枯萎病影响几乎所有的农作物，并导致世界范围内广泛的作物损失。由稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo))造成的稻(Oryza sativa)细菌枯萎病是这种作物的主要疾病。已鉴别出在具有与众不同的抗性(Xa)基因水稻栽培品种中诱导抗性或易感性反应的Xoo品种。一种抗性源(Xa21)已经在稻(Oryza longistaminata)野生种中鉴别出(Khush等人，Proceedings of the International Workshop on Bacterial Blight of Rice(International Rice Research Institue，1989)和Ikeda等人，Jpn J.Breed 40(Suppl.1)280-281(1990))。Xa21是显性抗性基因座，它赋予对所有已知的Xoo分离株的抗性，而且唯一定性的是携带对Xoo 6抗性的Xa基因。对Xa21基因座的遗传和物理分析已鉴别出大量在11号染色体上紧密连锁的标记(Ronald等人，Mol.Gen.Genet.236113-120(1992))。然而，Xa21赋予对该病原体抗性的分子机制还不清楚。
为了克隆赋予对各种不同细菌、真菌和病毒疾病抗性的植物基因，进行了相当的努力。仅有一种害虫抗性基因被克隆在单子叶植物中。因为单子叶作物供养世界上绝大多数的人和动物，所以鉴别出这些植物中的抗病性基因是特别重要的。本发明针对这些及其他的需求。
发明概述本发明提供了分离的核酸构建物，它含有RRK多聚核苷酸序列，该序列在严紧条件下与SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3杂交。代表性的RRK多聚核苷酸序列是编码如SEQ.ID.No.4中所示的Xa21多肽的Xa21序列。RRK多聚核苷酸编码的蛋白质有富含亮氨酸的重复基序和/或细胞质蛋白激酶结构域。本发明的核酸构建物还含有可操作地连于RRK多聚核苷酸序列的启动子。启动子可以是组织特异型启动子或组成型启动子。
本发明还提供了一种核酸构建物，它含有连于异源多聚核苷酸序列的、来自RRK基因的启动子序列。代表性的异源多聚核苷酸序列包括赋予植物对病原体抗性的结构基因。
本发明还提供了一种含有重组的表达盒的转基因植物，该表达盒含有可操作地连于多聚核苷酸序列的、来自RRK基因的启动子；以及一种含有重组表达盒的转基因植物，该表达盒含有可操作地连于RRK多聚核苷酸序列的植物的启动子。尽管任何植物都可用于本发明，但是方便使用的是水稻和番茄。
本发明还提供了增强植物对黄单胞菌抗性的方法。该方法包括将重组的表达盒引入植物，该表达盒含有可操作地连于RRK多聚核苷酸序列的植物启动子。该方法可方便地用于水稻和番茄植物。
定义术语“植物”包括全植株、植物器官(如叶、茎、根等)、种子和植物细胞以及它们的子代。可用于本发明方法的植物的种类一般可宽至可进行转化技术的高等植物类型，包括单子叶和双子叶植物。
“异源序列”是来自不同种的序列，或者如果来自同一种则是对其最初形式经过充分修饰的序列。例如，可操作地连于异源结构基因的启动子可以是来自不同于获得该结构基因的种，或者，如果来自同一种，则其中之一或两者都对它们的最初形式进行了充分的修饰。
“RRK基因”是编码含有胞外LRR结构域、跨膜结构域和胞质蛋白激酶结构域的RRK多肽的一类新的抗病性基因中的成员(如在例如RLK5、Pto和Fen中所示(Martin等人，植物细胞61543-1552(1994))。如本文所用，LRR结构域是如

图1所示并在Cf-9和RLK5中发现的有约24个残基重复单元的区域。)。用此处所公开的序列和标准的核酸杂交和/或扩增技术，技术人员可鉴别出该类基因的成员。例如，来自Xa21基因的核酸探针可检测在58个水稻重组近交系中与blast(Pyricularia oryzae)抗性基因(Pi7)分离的多态性。相同的探针还可在携带xa5和Xa10抗性基因的近同基因系中检测多态性。
在某些优选例子中，这类抗病性基因的成员可以通过它们能够被简并的、对应于LRR和激酶结构域的PCR引物所扩增出而鉴别出。例如，已使用引物来分离番茄中的同源基因。用于该目的的代表性的引物是tcaag caaca atttg tcagg nca a/gat a/c/t cc(对于LRR结构域序列GQIP)和taaca gcaca ttgct tgatt tnan g/a tcncg g/atg(激酶结构域序列HCDIK)。
“Xa21多聚核苷酸序列”是Xa21基因如水稻Xa21基因的亚序列或全长多聚核苷酸序列，当它存在于转基因植物中时会将对黄单胞菌属(如X.oryzae)的抗性赋予植物。代表性的本发明多聚核苷酸包括SEQ.ID.No.3的编码区域。Xa21多聚核苷酸典型地长至少约3100-6500核苷酸，通常为约4000-4500核苷酸。
“Xa21多肽”是Xa21多聚核苷酸序列的基因产物，它有Xa21的活性，即能够赋予对黄单胞菌属的抗性。和其他RRK多肽一样，Xa21多肽的特征是存在含有富含亮氨酸的重复片段(leucine rich repeats，LRR)的胞外结构域和/或胞质蛋白激酶结构域。代表性的本发明Xa21多肽包括在SEQ.ID.No.4中。
在转基因的表达中，技术人员会认识到插入的多聚核苷酸序列不必完全相同，而可以是与起源的基因序列“基本相同”。如下所述，这些变异体被该术语所具体涵盖。
在插入的多聚核苷酸序列被转录和翻译从而产生功能性RRK多肽的情况下，技术人员会认识到，因为密码子的简并性，有大量多聚核苷酸序列可以编码相同的多肽。这些变异体都被术语“RRK多聚核苷酸序列”所具体涵盖。此外，术语特定地包括了全长的、与RRK基因序列基本相同(确定方法如下所述)的序列，以及编码出保留RRK蛋白功能的蛋白质的序列。因此，在此处公开的水稻RRK基因的情况下，上述术语包括这样的变异多聚核苷酸序列，这些序列与此处公开的序列基本相同而且编码的蛋白质能够使含有该序列的转基因植物有抗黄单胞菌或其他植物疾病或害虫的抗性。
按下述的最大对应性排列时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸残基序列分别是相同的，那么这两个多聚核苷酸或多肽就被称为是“相同的”。术语“互补于”在此处被用于指互补序列与参照的多聚核苷酸序列的全部或部分是相同的。
在两个(或多个)多聚核苷酸或多肽之间的序列比较一般是这样进行的，即在一片段或“比较窗”内比较两个序列的顺序，以鉴别或比较局部区域的序列相似性。用于比较目的的片段至少为约20个连续位置，通常为约50-200个，更常见为约100-150个，其中在将两个序列按最佳方式排列之后，将该序列与仅有相同数目的连续位置的参照序列进行比较。
对于比较，序列的最佳排列的进行可以用Smith和Waterman高级应用数学(Adv.Appl.Math.)2482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48443(1970)的同源性算法，Person和Lipman美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)(U.S.A.)852444(1988)的相似性搜索方法，或用计算机完成这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，在WisconsinGenetics Software Package中，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者通过目测。
“序列相同百分比”是通过在比较窗内比较两个最佳排列的序列而确定的，其中，在比较窗内的多聚核苷酸序列部分可包括为了最佳排列两个序列而与对照序列(它不含有插入或缺失)相比时的添加或缺失(如缺口)。百分比是这样计算的确定在两个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数目，用匹配的位置数目除以比较窗内位置的总数，然后将结果乘以100，得到序列相同百分比。
术语多聚核苷酸的“基本相同”指用标准参数和上述的程序(优选BESTFIT)与参照序列比较时，多聚核苷酸序列含有的序列至少有60％序列相同，较佳地至少80％序列相同，更佳地至少90％序列相同，最佳地至少95％序列相同。本领域的技术人员会认识到，通过考虑密码子的简并性、氨基酸相似性、阅读框位置等因素，可以对这些数值进行适当的调整，以确定由两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相同性。出于这些目的，氨基酸序列的基本相同一般指至少40％，较佳地至少60％，更佳地至少90％，最佳地至少95％序列相同。“基本类似”的多肽共有如上所述的序列，除了不相同的残基位置可以用保守性氨基酸改变所替换。保守性氨基酸替换指具有类似侧链的残基的相互替代。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸、苏氨酸；具有酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；而具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸置换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
另一个核苷酸序列基本相同的标志是两个分子可在合适的条件下相互杂交。合适的条件可以是高严紧或低严紧条件，在不同的情况下有所不同。一般，严紧条件可选择比特定序列在所定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5-20℃。Tm是约50％靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在所定的离子强度和pH下)。一般，严紧洗涤条件是在pH7，盐浓度为约0.02摩尔以及温度至少约60℃。然而，在严紧条件下并不相互杂交的核酸仍可能是基本相同的，如果它们编码的多肽是基本相同的。这在例如用遗传密码所允许的最大程度的密码子简并性来产生核酸拷贝时会发生。对于Southern杂交，高严紧洗涤条件可包括至少在65℃于0.1X SSC中洗涤一次。
可用标准程序并将此处公开的核酸(如SEQ.ID.No.1或3)用作探针，从cDNA或基因组文库中鉴别出本发明的核酸。低严紧杂交条件典型地包括在65℃用2XSSC洗涤至少一次。洗涤后优选在65℃用1X SSC洗涤。
如此处所用，特定的RRK基因(如此处公开的水稻Xa21基因)的同系物，是第二种编码氨基酸序列与第一种基因产物的多肽序列有至少25％相同或45％相似(如上确定)的蛋白质的基因(在相同物种或不同物种中)。一般相信，同系物具有共同的进化起源。
附图简述图1是富含亮氨酸重复片段的蛋白质的比较。
图2A-F显示了含有可与Xa21-特异性探针杂交的区域的BAC和粘粒克隆的部分限制性图谱。
图3显示了pB822(最活跃的拷贝)的限制性图谱。
图4显示了在含有来自pB822克隆的Xa21基因的转基因植物中，测量黄单胞菌抗性的测试结果。
图5显示了TRK1的位置图。
图6显示了TRL1的位置图。
优选实施例的描述本发明涉及植物RRK基因，如水稻的Xa21基因。来自RRK基因尤其是Xa21基因的核酸序列，可以被用于在植物中赋予对黄单胞菌或其他病原体的抗性。本发明可用于在会受病原体感染的所有高等植物中赋予抗性。因此，本发明可用于大量不同范围的植物类型，包括来自下列属的种胡桃属(Juglans)，草莓属(Fragaria)，百脉根属(Lotus)，苜蓿属(Medicago)，驴豆属(Onobrychis)，车轴草属(Trigonella)，胡卢巴属(Trigonella)，豇豆属(Vigna)，柑桔属(Citrus)，亚麻属(Linum)，老鹳草属(Geranium)，木薯属(Manihot)，胡萝卜属(Daucus)，拟南芥属(Arabidopsis)，芸苔属(Brassica)，萝卜属(Raphanus)，欧白芥属(Sinapis)，颠茄属(Atropa)，辣椒属(Capsicum)，曼陀罗属(Datrua)，天仙子属(Hyoscyamus)，番茄属(Lycopersicon)，烟草属(Nicotiana)，茄属(Solanum)，碧冬茄属(Petunia)，毛地黄属(Digitalis)，Majorana，菊苣属(Ciahorium)，向日葵属(Helianthus)，莴苣属(Lactuca)，雀麦属(Bromus)，天门冬属(Asparagus)，金鱼草属(Antirrhinum)，Heterocallis，Nemesis，天竺葵属(Pelargonium)，黍属(Panieum)，狼尾草属(Pennisetum)，毛茛属(Ranunculus)，千里光属(Senecio)，(Salpiglossis)，香瓜属(Cucumis)，Browaalia，大豆属(Glycine)，豌豆属(Pisum)，菜豆属(Phaseolus)，黑麦草属(Lolium)，玉蜀黍属(Zea)，燕麦属(Avena)，大麦属(Hordeum)，黑麦属(Secale)，三毛草属(Triticum)和高粱属(Sorghum)。
下面的描述对水稻中Xa21基因的分离和定性过程的实施例章节，是代表性的分离Xa21基因和其他RRK基因的通用方法。分离的基因然后可用于构建重组载体，以便将RRK基因表达赋予转基因植物。
一般，在下述的重组DNA技术中的术语和实验程序是本领域中熟知的和通常使用的。对于克隆、分离DNA和RNA、扩增和纯化使用标准技术。一般，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶反应根据制造商的说明进行。这些技术和各种其他技术一般按照Sambrook等人的“分子克隆-实验室手册”，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)进行。
Xa21和相关RRK基因的分离可以用多种技术来完成。例如，可使用基于此处公开序列的寡核苷酸探针来鉴别cDNA或基因组DNA文库中所需的基因。为了构建基因组文库，可通过随机断裂(如通过限制性内切酶)产生基因组DNA的大片段，然后与载体DNA连接从而形成可被包入合适载体中的多联体。为了制备cDNA文库，从所需的器官如叶子中分离出mRNA，然后用mRNA制备含有RRK基因转录物的CDNA文库。或者，可从表达RRK基因或同系物的其他组织中抽提而得的mRNA制备cDNA。
然后，用基于克隆的RRK基因如此处公开的水稻Xa21基因的探针，来筛选cDNA或基因组文库。可用探针与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离出相同或不同植物种中的同源基因。
或者，可用扩增技术从核酸样品中扩增出感兴趣的核酸。例如，用聚合酶链反应(PCR)技术从基因组DNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库中直接扩增出RRK和有关基因的序列。PCR和其他体外扩增方法还可用于，例如，克隆编码待表达的蛋白质的核酸序列，制备用作在样品中检测所需mRNA存在与否的探针的核酸，核酸测序或其他目的。
用于从组织中鉴别出RRK序列的合适引物和探针，可以通过比较此处提供的序列而得出。对于PCR的总体回顾，可参见PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications.(Innis，M，Gelfand，D.，Sninsky，J.和White，T.编辑)，AcademicPress，San Diego(1990)，该文献在此引用作为参考。
还可用熟知的技术如在科技文献中所描述的技术，合成多聚核苷酸。参见例如Carruthers等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418(1982)和Adams等人，J.Am.Chem.Soc.105661(1983)。然后或者通过合成互补链，在合适的条件下将链退火在一起，或者用合适的引物序列通过DNA聚合酶而添加互补链，可以获得双链DNA片段。
接着，如此处描述而制备的分离序列可用于在所需的植物中提供RRK基因表达，从而提供黄单胞菌抗性。技术人员会认识到，编码有功能的RRK蛋白的核酸(如SEQ.ID.No.2和4)不必具有与此处公开的代表性基因相同的序列。此外，与其他蛋白质一样，由RRK基因编码的多肽具有执行不同功能的不同结构域。因此，RRK基因序列不必是全长的，只要所需的蛋白质功能结构域被表达即可。如下详细描述的那样，本发明的蛋白质含有胞外的富含亮氨酸的重复片段结构域，以及胞内的激酶结构域。可用本领域技术人员熟知的各种重组DNA技术方便地设计出修饰的蛋白质链。例如，通过氨基酸置换、插入、缺失等可以在一级结构水平使链不同于天然存在的序列。修饰还可包括，将来自本发明蛋白质的结构域与来自其他害虫抗性基因的相关结构域进行互换。例如，本发明蛋白质的胞外结构域(包括富含亮氨酸重复片段的区域)可被番茄Cf-9基因的胞外结构域替换，从而提供对水稻真菌病原体的抗性。这些修饰形式可以大量组合形式使用，从而产生最终的修饰的蛋白质链。
为了在上述的技术中使用分离的RRK序列，制备适合转化植物细胞的重组DNA载体。用于转化各种不同的高等植物种的技术是众所周知的，并且描述于技术和科学文献中。例如，参见Weising等人，Ann.Rev.Genet.22421-477(1988)。
编码所需的RRK多肽的DNA序列，例如编码全长蛋白质的cDNA或基因组序列，可用于构建能够引入所需植物的重组表达盒。一个表达盒典型地包括RRK多聚核苷酸，该多聚核苷酸可操作地连于指导RRK基因序列在转化植物的所需组织中进行转录的转录和翻译起始调节序列。
例如，可采用能在再生植株的所有组织中指导RRK表达的植物启动子片段。这种启动子在此处被称为“组成型”启动子，它在绝大多数环境条件和发育或细胞分化阶段下是活跃的。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区域、来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumafaciens)的T-DNA的1′或2′启动子、和技术人员已知的来自各种不同植物基因的其他转录起始区域。
或者，植物启动子可指导RRK基因在特定组织中的表达，或者处在更精确的环境或发育控制下。这种启动子在此处被称为“诱导型”启动子。可影响诱导型启动子转录的环境条件包括病原体侵袭、厌氧条件或存在光。
处在发育控制下的启动子的例子包括仅在某些组织如叶、根、果、种子或花中引发转录的启动子。启动子的操作也可不同，这取决于它在基因组中的位置。因此，诱导型启动子在某些位置是全部或部分组成型的。
来自本发明的RRK基因的内源启动子可用于指导基因的表达。这些启动子还可用于指导异源结构基因的表达。因此，启动子可用于重组表达盒中以驱动基因的表达，而该基因可赋予对任何病原体包括真菌、细菌等的抗性。
为了鉴别启动子，分析此处描述的克隆的5′部分是否有启动子序列的序列特征。例如，启动子序列元件包括TATA盒共有序列(TATAAT)，它通常位于转录起始位点上游20-30碱基对处。在植物中，在TATA盒的更上游，在位置-80至-100处，典型地有一启动子元件，它具有一系列围绕着三聚核苷酸G(或T)NG的腺嘌呤。J.Messing等人，植物遗传工程(Genetic Engineering in Plants)，pp.221-227(Kosage，Meredith和Hollaender编辑，1983)。
如果需要合适的多肽表达，那么应在RRK编码区域的3′端引入聚腺苷酸化区域。聚腺苷酸化区域可来自天然基因，或来自各种不同的其他植物基因，或来自T-DNA。
含有来自RRK基因序列的载体典型地含有标记基因，该标记基因使植物细胞有可选择的表型。例如，标记基因可以编码抗生剂抗性，尤其是对抗生素如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性，对除草剂的抗性如对chlorosluforon或Basta的抗性。
这些DNA构建物可用各种常规技术引入所需植物宿主的基因组中。例如，对植物细胞原生质体或胚愈伤组织用诸如电穿孔、PEG穿孔、颗粒轰击和微注射等技术，可以将DNA构建物直接导入植物细胞的基因组DNA，或者用冲击方法如DNA颗粒轰击，可以将DNA构建物直接引入植物组织。或者，DNA构建物可与合适的T-DNA侧翼区域合并，然后导入常规的根瘤土壤杆菌宿主载体中。当细胞被细菌感染时，根瘤土壤杆菌宿主的毒力功能可以指导构建物和相邻的标记插入到植物细胞DNA中。
转化技术是本领域中熟知的，在科学和专利文献中有充分的描述。用聚乙二醇引入DNA构建物的方法描述于Paszkowski等人，欧洲分子生物学协会杂志(Embo J.)2717-2722(1984)。电穿孔技术描述于Fromm等人，美国科学院院报，825824(1985)。轰击转化技术描述于Klein等人，自然，32770-73(1987)。使用大量方法，可以转化谷类种如黑麦(de la Pena等人，自然，325274-276(1987))、玉米(Rhodes等人，科学，240 204-207(1988))和水稻(Shimamoto等人，自然，338274-276(1989)，用电穿孔；Li等人，Plant Cell Rep.12250-255(1993)，用轰击技术)。
根瘤土壤杆菌介导的转化技术在科学文献中充分描述。参见例如Horsch等人，科学，233496-498(1984)和Fraley等人，美国科学院院报，804803(1983)。尽管土壤杆菌主要用于双子叶，但是某些单子叶植物也可用土壤杆菌转化。例如Hiei等人，Plant J.6271-282(1994)中描述了用土壤杆菌转化水稻。
用上述任何的转化技术衍生而得的转化的植物细胞，可以被培养至再生完整的植株，该植株具有转化的基因型，从而具有所需的RRK控制的表型。这种再生技术依赖于在组织培养生长培养基中某些植物激素的作用，典型地依赖于已与RRK核苷酸序列一起被包含的抗生剂和/或除草剂标记。从培养的原生质体再生植物描述于Evan等人，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant CellCulture，pp.124-176，MacMillilan Publishing Company，New York，1983；和Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985。还可从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分而再生。这种再生技术在Klee等人，Ann.Rev.Of Plant Phys.38467-486(1987)中有全面描述。
本发明方法特别适用于将RRK多聚核苷酸以在自然界没有的方式和情况下引入转化的植物中。具体地，RRK多聚核苷酸可以不同于天然植物的特征而时常或大量地进行表达。
技术人员还认识到，在表达盒稳定地被引入转基因植物并证实可操作之后，它可以通过有性杂交而被引入其他植物。可以使用大量标准杂交技术中的任何技术，这取决于待杂交的种。
RRK基因表达的修饰效果可以在mRNA水平通过检测增加或减少而确定，例如通过Northern印迹法。此外，基因表达的表型效果可通过测量植物中的病痕长度而检测。下面描述了合适的确定抗性的分析方法。
以阐述方式给出下列实施例，它们不起限制作用。
实施例1也可以用基于图谱的克隆法来分离植物基因。该方法包括对与目标基因紧密连锁的DNA标记进行鉴定。对大的染色体区域进行基于图谱的克隆和物理分析获得成功的一个要求是得到含有基因组DNA大插入片段的基因文库。最近，Shizuya.H.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)89，8794-8797(1992)中描述了一种细菌人工染色体(BAC)系统，用于克隆人基因组DNA大片段。该系统使用基于F因子的载体，能够包含大于300kb的人基因组DNA片段。DNA能够高效克隆在大肠杆菌(E.coli.)中，操作简便，保存稳定。下文是利用该技术分离本发明基因的说明。
携带Xa21相关序列的BAC和粘粒克隆的分离BAC克隆A.材料与方法水稻高分子量DNA的制备将国际水稻研究会(IRRI)的一水稻系，携带Xa-21的IR-BB21用作植物材料。植物在暖房中生长3至5周。收集叶组织，用蒸馏水洗涤，然后粉碎。根据Hatano，S.等在(植物科学杂志)(Plant Scince)，83，55-64(1992)和Zhang，H.B.等人在植物(Plant)，7，175-184(1994)中所述，进行以下修改，从水稻组织中抽取高分子量DNA在液氮中，用冷的研钵与研杵将约20g叶组织研成粉末。将粉末搅拌悬浮在200ml冷的核萃取(NE)缓冲液(1MM亚精胺，1mM精胺，10mM Na2EDTA，10mm Trizma碱，80mM KCl，0.15％Triton-X100和0.4M蔗糖，pH9.4)中。将此混合物通过两层干酪滤布过滤到GSA瓶中，在4℃以1200g离心20分钟。弃去上清液，将细胞核沉淀(浅绿色)重悬在50ml冷的NE缓冲液中。重悬后的沉淀经80微米的筛过滤到一个50ml试管中以去除绿色的组织碎片，然后以1000g离心10分钟。如上所述再次将沉淀重悬和离心，但不经80微米的筛过滤。细胞核沉淀(约5×108个/ml)重悬在2.5ml SCE缓冲液(1M山梨醇，0.1M柠檬酸钠，60mM EDTA，pH7.0)中，埋入2.5ml 1％低熔点(LMP)琼脂糖(Ultrapure)中。80μl的块在25ml的ESP溶液(0.5M EDTA，pH9.3，1％十二烷基肌氨酸钠，5mg/ml蛋白酶K，Boehringer Mannheim)于50℃培养2天，期间更换一次缓冲液。每个块中含有5μgDNA。高分子量DNA的部分消化和利用PFGE的大小分离琼脂糖块在50℃对加有1mm PMSF(苯基甲基磺酰基氟)的TE(10mm Tris-HCl和1mM EDTA，PH8.0)进行两次1小时的透析，然后在室温下用HindIII缓冲液(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2和1mM二硫赤藓糖醇，pH7.9)进行两次1小时的平衡。在65℃用15分钟将块熔化，在37℃保温5分钟，然后部分消化。在DNA溶液中加入5至7单位/块的HindIII(NEB，USA)，在37℃孵育30分钟。加入1/10体积pH8.0的0.5％EDTA终止反应。用切割成2mm内径的尖嘴移液管将部分消化后的DNA马上加入0.8％LMP琼脂糖中，利用PFGE(CHEF DR II系统，BioRad USA)分离。使用了两种不同的PFGE方法构建文库。第一种，凝胶在150V电泳，使用8秒的起始和终止切换时间，在14℃进行16小时。未分离的DNA(≥200kb)集中成一条窄条带。第二种，凝胶在150V电泳，切换时间由60秒增加至90秒，在14℃进行16小时。将两种方法中含有部分消化的DNA的凝胶切下，浸在TE中，同时用溴乙锭染色凝胶的标记物泳道。从凝胶中切取含有大于200kb片段(第一种PFGE方法)或含有250-350kb片段(第二种方法)的琼脂糖条。琼脂糖条于4℃在TE中平衡2小时，放入1.5ml的试管中，在60℃熔化10分钟，用凝胶酶(Gelase)(Epicenter，USA)(每100g琼脂糖加1单位酶)消化，在45℃孵育1小时。将该DNA溶液直接用于连接反应。载体的制备和分离，以及连接反应载体pBeloBAC II，由H.Shizuya和M.Simon博土(California Institute ofTechnology，USA)提供。该载体在pBAC108L中插入了lacz基因。Shizuya等(1992)。将一个单菌落接种到5ml含有12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中，在37℃生长4至5小时，然后加入6毫升LB培养基。接种物在37℃生长约16小时，直至OD600nm达1.3-1.5。用Qiagen的质粒最大分离试剂盒(Qiagen，USA)分离质粒。载体DNA通过45,000RPM的氯化铯/溴乙锭平衡离心60小时进行纯化。使用固定的角转子70.1(Beckman，USA)，将转子减速至35,000 RPM离心1小时，使梯度松散。用HindIII将质粒消化完全，用凝胶电泳进行分析。载体末端用HK磷酸酶(Epicenter，USA)在30℃脱磷酸化1小时，每1μg载体DNA使用1单位的酶。在65℃加热30分钟使HK磷酸酶失活。在100μl中进行连接反应，其中用400单位的T4 DNA连接酶(NEB，USA)将约40ng经大小选择的水稻DNA(约85μl)与10ng HindIII消化的载体(1μl)连接(摩尔比约10比1，载体过量)。转化前，在ULTRAFREE-MC过滤试管(Millipore，USA)中，连接反应液用TE于4℃通宵透析。BAC转化根据如下设定，利用Cell-Porator(GIBCO-BRL，USA)以电穿孔法转化感受态的大肠杆菌DH10B细胞(GIBCOBRL，USA)电压400；电荷速度快；加压电阻4,000；电容300μ；电阻低。每一次电穿孔将13μl感受态细胞与0.5-1.0μl连接反应液混合。电穿孔后，将细胞转移到1ml SOC溶液(2％细菌胰蛋白酶解胨，0.5％细菌酵母提取物，10MM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCL2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖，pH7.0)中，在37℃轻微振荡(90-95RPM)培养45分钟。将细胞分散在含有氯霉素(12.5μg/ml)、X-gal(40μg/ml)和IPTG(异丙基硫-β-D-半乳糖苷)(0.072μg/ml)的LB培养板中。将板在37℃培养24小时。将含有水稻DNA插入片段的白色菌落选取到新鲜的LB培养板上，进行第二次颜色筛选。将BAC克隆转移到384格微滴板(Genetix，UK)上，格中含有60μl LB冷冻缓冲液(36mM K2HPO4，13.2mM KH2PO4，1.7mM柠檬酸，0.4MM MgSO4，6.8mM(NH4)2SO4，4.4％v/v甘油，12.5μg/ml氯霉素，LB)，在37℃培养24小时。由于95％以上的菌落在第二次筛选时仍为白色，在以下实验中只进行一次筛选，直接将白色菌落选取到384格微滴板上。将文库复制两次，保存在不同的两个-80℃冰箱中。滤膜的制备将384格微滴板上每一格中的BAC菌落都复制到Hybond N+滤膜(Amersham，USA)上。将滤膜放在含有LB/琼脂糖和12.5μg/ml氯霉素的塑料盒中，盒在37℃保温过夜，直至菌落直径达约2至3mm。如Nizetic，D等人在核酸研究(Nucl.Acids Res.)19，182(1990)；Hoheisel，J.D.等人在细胞(Cell)73，109-120(1993)中所述处理滤膜。杂交和洗涤条件如Hoheisel等人(1993)所述。用随机引物延伸反应来标记探针。Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.，生物化学分析(Anal.Biochem.)132，6-13(1983)；附录137，266-267(1984)。B.结果上述BAC文库包括11,000个克隆。用两种方法来构建该文库。具有7269个克隆的前半个文库是用Ramsay，M和Wicking，C.，在人分子遗传学方法(Protocols inHuman Molecular Genetics)，197-221(1991)中所述的压缩区带法经一次大小选择构建而成的。具有3731个克隆的后半个文库是利用对部分消化的DNA进行两次大小选择构建而成的。但是，两次大小选择不能提高DNA插入片段的平均大小。显然，在经大小选择的DNA溶液(只分离出250至350kb的DNA)中仍然有小分子DNA存在。以下实验证明，用于连接的350至500kb之间的DNA的两次大小选择提高了BAC克隆中的较大平均插入片段。在从文库中选出54个随机BAC克隆中，其中50个含有水稻DNA(93.0％)。部分克隆不含插入片段(7％)。DNA插入片段的大小在30至250kb之间，平均值为125kb。
用于构建BAC文库的高分子量DNA分离自纯化的水稻细胞核。低速离心(＜1000g)去除了大部分的叶绿体和线粒体。新BAC文库中发现叶绿体或线粒体克隆的低几率(＜0.3％)降低了细胞器DNA/细胞核DNA连接的可能性。
BAC文库被用于构建一组跨越Xa21基因座的毗连克隆(毗连(序列)群)。用两个Xa21连锁的DNA标记，RG103(1kb，参见Ronald等人，分子遗传学(Mol.Gen.Genet.)236113-120(1992))和pTA818(1.2kb，相当于Ronald等人的RAPD818)筛选BAC文库。在含Xa21的品系中发现RG103有8个拷贝，并与该品系中8个基因组HindIII DNA片段杂交。这些片段都在遗传和物理上与Xa21抗病性基因座连锁。pTA818与2个DNA片段杂交，其中最少一个片段与Xa21基因座连锁。Ronald等人(1992)。
用pTA818(2个拷贝)和RG103(8个拷贝)探针与7296个BAC克隆杂交。分别鉴定出7个与RG103杂交的BAC克隆和5个与pTA818杂交的BAC克隆。从这些克隆中分离BAC DNA，并用HindIII消化。用PFGE分离DNA片段。Southern分析显示，7个与RG103杂交的BAC克隆携带有RG103基因组HindIII片段的4种不同拷贝。探针与一段4.3kb和9.5kb片段杂交，与一段9.6kb和6.2kb片段杂交。DNA片段的大小是从用HindIII消化的λDNA推算的。
分离出4个携带一种pTA818 HindIII片段的BAC克隆，并鉴定出一个携带另一种拷贝的BAC克隆。含BAC的pTA818与标记PTA248(相当于Ronald等(1992)的RAPD248)杂交，这证实，这两个被克隆的RAPD标记基因均在60kb以内，且相互包含。Ronald等人(1992)。
鉴定出12个与2种克隆DNA序列(对应于水稻基因组中的10个DNA片段)杂交的BAC克隆，这略低于根据2x基因组当量筛选(7296个菌落，450,000kb基因组，平均插入大小125kb)预计的20个菌落。具体地说，在文库的这一部分，pTA818序列和4个RG103杂交序列(8个中的4个)过度表现。相反，另外4个RG103序列表现不足。这些克隆的DNA插入片段大小在40至140kb之间。
粘粒克隆A.材料与方法水稻叶中高分子量(HMW)DNA的制备携带Xa21基因座的水稻系1188用作分离HMW DNA的植物材料。收集120g的4至6周龄的叶组织，在液氮中用冷的研钵和研杵研磨成细粉。然后将粉末搅拌悬浮在800ml冷的H缓冲液[4mM亚精胺，1mM精胺，10mM EDTA，10mMTris-HCl，80mM KCl，0.5M蔗糖，1mM PMSF(苯基甲基磺酰基氯，使用前加入)，0.5％(v/v)Triton-X100，1/1000(v/v)β巯基乙醇(使用前加入)，pH9.5]中。混合物经80微米的筛过滤到GSA瓶中，将沉淀重悬在400ml H缓冲液中并再次过滤。合并两次的滤液，在4℃以3500rpm离心10分钟。将沉淀重悬在300ml洗涤缓冲液(与H缓冲液相同，但是不含PMSF和β巯基乙醇)中，在4℃以3500rpm离心10分钟。沉淀再洗涤两次，直至沉淀的颜色为浅绿色。将沉淀重悬在40ml洗涤缓冲液中，加入等体积的含2mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannhein)的裂解缓冲液(2％十二烷基肌氨酸钠，100mM Tris-HCl，0.5M EDTA，pH9.5)裂解细胞核。在50℃反应5小时，然后在室温下用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(24∶24∶1)萃取30分钟(温和倒转)，由此去除蛋白质。温和加入一层1/10体积的3M乙酸钠(pH5.5)和一层2体积的乙醇，并温和倒转数次，由此沉淀HMW DNA。最后，用大口径尖嘴移液管从乙醇中吸取DNA，用70％乙醇洗涤，干燥，溶解在1mlTE(10mM Tris-HCl，1mm EDTA，pH8.0)中静置过夜。通常，可从120g叶中分离得到250μg HMW DNA。插入DNA的制备(A)HMW DNA的部分消化预试验。将30μg(70μl)HMW DNA与10μl 10×Sau3AI缓冲液(NEB)混合，在37℃预热5分钟。然后在DNA溶液中加入20μl(2单位)Sau3AI，用大口径尖嘴吸管轻微混合，在37℃培养。在0，5，10，20，30和70分钟时取出等量的15μl，立即在冰上与0.5M EDTA 5μl(pH8.0)混合以终止反应。然后在低温室内，在0.3％琼脂糖/TBE凝胶中，以2V/cm凝胶长度电泳分析样品。
重复预试验，使用37℃时的最佳培育间期20分钟，可获得大规模的DNA部分消化。(B)大小选择在SW27转子中，在20℃，进行26,000rpm的5至40％蔗糖梯度离心13小时，分离部分消化的DNA。将毛细管伸入离心试管底部，以非常缓慢的速度吸取梯度溶液，由此小心收集0.8ml的各份溶液(总共20ml)。每份样品取20μl在0.3％琼脂糖凝胶上以2V/cm凝胶长度电泳36小时。将35至50kb的DNA组份汇集在一起。用等体积的水稀释蔗糖溶液，然后用2倍体积的乙醇沉淀DNA。使用标准方法进行不完全反应。连接、包装和转染粘粒载体pHC80由ScotHulbert博士提供。载体与插入DNA以2比1摩尔比例连接，最终浓度为0.8μg/μl。连接反应使用600单位T4 DNA连接酶(NEB，USA)在16℃进行过夜。连接后的DNA在体外用GigapackII包装提取物(Stratagene，USA)根据Stratagene的说明，进行包装，然后转染感受态细胞大肠杆菌NM554。文库的筛选将160个384格微滴板上的61440个粘粒菌落(大于5个基因组当量)转移到Hybond N+滤膜(Amersham，USA)上，形成两种密度。在第一种方法中，用手动复制仪(Genetix，U.K.)低密度(1536菌落/11.5×15cm滤膜)复制粘粒克隆，在含10μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂上生长过夜。用40张滤膜覆盖整个粘粒文库。在第二种方法中，用Beckman BiomekTM机动操作仪成排地高密度复制粘粒，使用与上述相同的方法进行生长。使用3×3排，将3456个菌落转移到一张8.5×12cm的滤膜上。为了在阴性背景上准确定位阳性菌落，在每个3×3栅格的头一个位置培养一个参照粘粒菌落(包含RG103标记基因)。其后的8个位置培养来自粘粒文库8个微滴板的菌落。此时，20张8.5×12cm的滤膜可覆盖整个文库。为了与一特殊探针杂交，RG103与该特殊探针以1∶4的比例混合，形成参照样式。
利用经以下修改的水蒸气浴方法裂解滤膜上的细菌并固定化菌落面向上在浸于裂解溶液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)的两张3MM Whatman上，室温下放置4分钟，装有滤膜的塑料盒在85℃的水蒸气浴中孵育6分钟，然后将滤膜转移到浸在中和溶液(1M Tris-HCl(pH7.4)，1.5M Nacl)中的3MM Whatman上，放置4分钟。浸在蛋白酶K溶液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM EDTA(pH8.0)，100MmNaCl，1％(v/v)十二烷基肌氨酸钠，250μg/μl蛋白酶K)中于37℃孵育20分钟，去除蛋白质和细胞碎片。滤膜在室温下用2×SSC溶液温和洗涤5分钟，干燥后距离10cm以UV处理2.5分钟。
根据以下标准方法进行杂交滤膜用预杂交溶液(7％SDS，0.5MNa2PO4(pH7.2)，1mM EDTA，100μg/ml ssDNA)在65℃处理2小时至通宵。用随机引物延伸法标记探针，在65℃通宵振荡杂交。室温下略微洗涤(40mMNa2PO4(pH7.2)，1％SDS)滤膜，然后将滤膜在相同的溶液中于65℃温和振荡孵育20分钟。B.结果用三个Xa21连锁标记(RG103、RAPD248和RAPD818)筛选粘粒文库。基因组Southern分析显示，三个标记在抗性品系中的拷贝数分别是8，1和2(未公开结果)。鉴定出6个与RG103标记杂交的阳性粘粒克隆，并经进一步的Southern分析所证实。但是，没有鉴定出含RAPD248和RAPD818的阳性克隆。
实施例2Xa21基因的鉴定在实施例1中分离的5个粘粒克隆和1个BAC克隆进一步以限制性酶图谱进行鉴定。图2A至2E是粘粒克隆的部分限制性酶切图。图2F是BAC克隆的部分限制性酶切图。
在其中一个克隆pB806中鉴定出一个开放读码框(SEQ.ID.No.1)。它包括启动子区、推定的内含子和一部分3’序列。SEQ.ID.No.2显示推定的氨基酸序列。推定的内含子已切除。
推定的氨基酸序列揭示了蛋白质的两项特性，这两项特性表明它是由一批新类型植物抗病性基因，本文中称RRK基因编码的。第一，由这些基因编码的蛋白质其胞外域包含了一块约23个串联富含亮氨酸重复序列(LRR)，平均长度为24个氨基酸。LRR基序已被认为在多种蛋白质中与蛋白质-蛋白质反应和配体结合有关。胞外域还包含位于LRR和信号肽之间的区域，其中包含SWNTS基序，该基序在许多蛋白质中是保守的，其中包括Df-9、PGIP和RLK5。此外，该蛋白还包含一个区域，与PLPK5和TMK1之类受体样蛋白激酶(PLPK)(Walker等人，植物杂志(Plant J.)3451(1993)；Chang等人植物细胞(Plant Cell)41263(1992)；Valon等人，植物分子生物学Plant Molec.Biol.)23415(1993))和番茄抗性基因产物Pto(Martin等人，科学(Scince)2621432(1993))具有高度的序列一致性。SEQ.ID.No.2中确定了信号域、胞外域(包含LRR区)，跨膜域和胞质激酶域。
图3是另一个克隆，pB822的限制性酶图，该克隆用于根据下文实施例3中所述的转化实验中所用的质粒。该克隆中的Xa21基因也被测序(SEQ.ID.No.3)。推定氨基酸序列(SEQ.ID.No.4)显示有相同的SEQ.ID.No.2中鉴定出的基序。
蛋白质激酶域携带有11个亚域，亚域中包含15个保守的蛋白质激酶特征性残基，两侧分别是一个33aa的并膜域(aa 677-707)和一个C末端域。推定的内含子在推定催化域中两个高度保守的残基P和E(aa892和aa893)之间。亚域VI(DIKSSN)和VIII(GTGYAAPE)中共有序列明显表明，Xa21具有丝氨酸/苏氨酸激酶(与酪氨酸相反)活性。
先前的研究证明，磷酸化的RLK5蛋白与2C型丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶的激酶反应域(KID)反应(Stone等人，科学(Scince)，266793-795(1994))。KID与磷酸化的含RLK5和TMK1蛋白质的LRR结合，但不能与S相关受体激酶ZmpK1和RLK4结合。该结果表明，拟南芥KID在功能上与动物蛋白的SH2结构域类似。将拟南芥受体样激酶RLK5、TMK1的序列与Xa21排列显示围绕着一个丝氨酸残基有一组保守性氨基酸(N/Q)X(L/V)S(G/S)(L/A)(F/V)(P/E)，该丝氨酸残基是最后一个残基(精氨酸)的羧基端，在所有蛋白质激酶中高度保守(Xa21基因产物的999位)。这些蛋白质中共有的羧基端位置与Rous肉瘤病毒的癌基因产物pp60c-Src中磷酸酪氨酸羧基端类似，后者是与含SH2结构域的蛋白质结合所必需的。在不与KID结合的S相关受体激酶ZmpK1，RLK4和SRK6和细胞间激酶中缺少这些保守性氨基酸。所以，该区域起着与KID蛋白高度亲和性和特异性结合位点的作用。所以可利用改变Xa21区域的氨基酸序列来改变对KID蛋白质的亲和性，由此调节LRR结构域的配体结合引起的胞间信号传递。
实施例3用Xa21基因转化植物可用上述Xa21基因转化水稻植株来证明该基因可使易感植株具有黄单胞菌抗性。对Li等人，植物细胞报道(Plant Cell Rep.)12250-255(1993)中的方法加以修改，以此将基因导入易感的水稻植株。简而言之，用潮霉素构建物pMON410(Monsanto提供)和含有目标序列的Bluscreipt载体进行共转化。此外，将pB822的Kpn片段克隆到pTA818载体中，该载体来自Invitrogen载体pcr1000并含有1kb的片段RAPD818(Ronald等人，同上)。形成的质粒称pC822。用潮霉素(30mg/L)选择植株，然后筛选对Xoo种6的抗性。
利用标准方法来测试转化株的黄单胞菌抗性。根据Kaufma等人，植物疾病报道(Plant Disease Rep.)57537-541(1973)中的方法进行实验。简而言之，Xoo种6在PSA平皿上生长3天。刮取细菌，悬浮在水中，调节OD值为109菌落形成单位/ml。将剪刀在悬浮液中浸一下，在距叶尖5cm处剪切转化植株(轰击后4个月)的叶。就接种后11天病痕的出现对植株进行评定。
图4显示病痕长度数据，来自使用含pC822克隆的基因的表达载体进行的实验。由不同的转化子发育成的个体106、-9、-22、11、-17、-1、-12、-4、16和29携带pC822构建物，并且，与易感的未转化对照(IR24)和用载体(1-15)转化的水稻植株相比，抗性提高。
实施例4从番茄中分离RRK基因如上所述，Xa21序列可用于利用简并引物或低严紧性杂交方法从其它植物种中分离RRK基因。本实施例说明了利用简并引物法从番茄中分离并鉴定两个RRK基因。
制备简并引物，使得PCR(聚合酶链反应)产物扩增LRR和激酶域间的序列，由此跨越跨膜域。正向引物来自Xa21和几种其它植物蛋白(例如，cf-9，RLK5和PGIP)的LRR区中的保守性基序。反向引物来自Xa21激酶域和其它植物丝氨酸-苏氨酸激酶域(例如，RLK5，Pto和Fen)(Martin等人，植物细胞(PlantCell)61543-1551(1994))的保守性基序。
用于PCR产物扩增的简并引物如下1.LRR区TCA AGC AAC AAT TTG TCA GGN CA(A/G)AT(A/C/T)CC(SEQ.ID.No.5)2.激酶区TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN(G/A)TC NCG(G/A)TG(SEQ.ID.No.6)TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN(G/A)TC(G/A)CA(G/A)TG(SEQ.ID.No，7)TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN(G/A)TC(T/C)CT(G/A)TG(SEQ.ID.No.8)PCRPCR条件如下(20微升的反应)首循环94℃，30秒(变性)55℃，30秒(退火)72℃，1分钟(延长)在其后的19轮循环中，每轮循环的退火温度下降1℃。在第20轮循环结束后，反应液在72℃孵育10分钟。
在使用上述引物的初扩增之后，使用以下特异性引物进行第二次扩增TAAGCAACAATTTG(SEQ.ID.No.9)TAACAGCACATTGCTTGA(SEQ.ID.No.10)此次扩增的条件如下94℃， 15秒55℃， 15秒72℃， 15秒35轮循环后，反应液在72℃孵育10分钟。
克隆PCR产物，用作筛选番茄cDNA文库的探针。番茄cDNA与寡聚dT引物杂交，与EcoRI衔接头连接，克隆到λGT11载体中，由此构建文库。
以上引物被用于分离属于抗病性基因RRK家族的两种番茄PCR产物和cDNA。第一种克隆TRK1(番茄受体激酶1)是一个250bp的PCR产物，被用于分离部分cDNA。DNA序列显示于SEQ.ID.No.11。TRK1的推定氨基酸序列显示于SEQ.ID.No.12。
该克隆在番茄基因组中有一两个拷贝，其中一个在酶切图上位于1号染色体的短臂，靠近黄单胞菌campestris pv.vesicatoria抗性基因(Rxl)(Zu等人，遗传(Genetics)141675-682(1995))(参见图5)。
第二个克隆TRL1(番茄受体样1)是一段496bp的PCR产物。DNA序列显示于SEQ.ID.No.13。推定的氨基酸序列为SEQ.ID.No.14。TRL1在酶切图上在3号染色体上的突变mcn的数个cM内，突变mcn引起植株的点状坏死，这是一种典型的防卫性表型。
以上结果显示，Xa21基因可用于从其它植物种中分离RRK基因。例如，分离得到的TRK1和TRL1基因是引起防卫反应的植物内信号传递途径的重要组成。这些基因可用于在番茄和其它植物种中以基因工程法产生抗病性。
以上实施例用于说明本发明而不是对其范围的限制。对本领域一般技术人员来说，本发明的其它改变形式是显而易见的，这些都在所附的权利要求范围之内。本文引用的全部公开文献、质粒和专利公开均被引用参考。SEQ.ID.No.1RRK-FaagctttctaaattatttaactctaagtctgttattatccccaagtacatcatcatcatacataatatttcatattcacgacatccttaagctagatgcttttggccattctcttatctttttaaagaaattctctcccaattaagatgagagtgtcttctagcaatttgccagtttttacaatgtctttgagtcctcacacattttcatgatgttaccaataaattacggacgccgtgtttagttctaaagtttttcttcaaacttacaacttttcaatcgcatcaaaactttctcctacacacacaaactttcaacttttccatcacatcgttccaatttcaaccaaacttccaattttggtatgaactaaacacagccgaaaacaaaatctgtgtgttatggccctgtttagattctaacttttccattacatcaaactttcctacatacacgaactttcaacttttccgtcacatcgtttcaattttttaaaacttccatttttaacgtggaactaaacacaacctatataacggaatttgtcaaaaactcaatggtgaaagtcacacctcacaggaagggcgcgctctagtcaagacatcattaaacaggtacacaggttgtactagcttgtcatgtttatcttgcgtctgcgagacgtaaatccatgccaaacaaaagtgcttctatagagatatcataaggatatggtttggggccatatccaactgctcaggagagatctcgttcggaggtgaggttagatgttcacctctccacacataacgaaggcgatcttcttcgcatatgattaggcattagataaaataaccttaaaaaataaatcaatatgatttttttagaaaaaaattatatacactaagtataagcattgtcaaggaggaagaaacacacactcccatatagagagatagaaacatagctataggtagtgtcactgagtattttccatcacgcatatccatataaaattagggggtgttacatccataggtgtaaagttttggcatgttatatcgagtattacgtagaatgccgtattaggtgtccgggcactaataaaaaaataattacagaatccgttagtaaaccgcgagataaatttattaagcctaattaatcccatcattaacaaatgtttaccgtagcaccacattgtcaaatcatggagcaattaggtttaaaagattcgtctcgcaaattagtcataatctgtgcaattagttatttttagactatatttaagacttcgtacaggtgttcaaacgttcgatgtgacatggtgcaaaattttagggtgtcatctagacactcccttaattagaaagttaggaagaggcggtaaagaacgcagcatgactgaaactttgaaaatttgataaggtacaccaactggagtatcttttattttcattgaagactttgaccagaagagcttgacccgtttttcttggagtagccagtaatgtttcattcttttccttttgctgggacttctttttattttttttgacaggagccatttgttgggacttgggatccctttactgttataggaccagtgcttgaatccaaacactgcattgatcagctcagctcattgtagcgcactcctccgcatgcATGGCGAGATCACCAACGTCGGTCATGATCTCTTCTTTGCTGCTGCTGCTGTTGATCGGCCCAGCGAGCAGTGACGATGATGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGTACCAGTACAGGCGGCGTCGCGGCGACGAACTCGCGCTGCTCTCTTTCAAGTCATCCCTGCTACACCAGGGGGGCTTGTACGCTGGCATCTTGGAACACGTCCGGCCACGGCCAGCACTGCACATGGGTGGGTGTTGTGTGCGGCCGCGCGCGCCGGCACCCACACAGGGTGGTGAAGCTGCTGCTGCGCTCGTCCAACCTGTCCGGGATCATCTCGCCGTCGCTGGGCAACCTGTCCTTCCTCAGGGAGCTGGACCTCAGCGACAACTACCTCTCCGGCGAGATACCACCGGAGCTCAGCCGTCTCAGCAGGCTTCAGCTGCTGGAGCTGAGCGGTAACTCCATCCAAGGGAGCATCCACGCGGCCATTGGAGCATGCACCAAGTTGACATCGCTAGACCTCAGCCACAACCAACTGAGATTGGTGCCAGCTGAAACATCTCTCGAATTTGTACCTTCACACCAATGGTTATGTCAGGAGAGATTCCATCTGATTTTGGGCAATCTCACTACGCCTTCAGTATTTGATTTGACCTGCAACAGATTATCACGGAGCTATACCTTCATCGCTAGGGCAGCTCAGCAGCAGTCTATTGACTATGAATTTTGTGCTACGAACAATCTAACTGGCATGATCCCCAATTCTATCTGGAACCTTTCGTCTCTAGCAGCGTTTAGCTGTCAAGCGAAAAACAAGCTAGGTGGTATGATCCCTACAAATGCATTCAAAACCCTTCACCTCCTCGAGGTGGTAGATATGGGCACTAACCGATTCCATGGCAAAATCCCTGCCTCAGTTGCTAATGCTTCTCATCTGACACGGCTTCAGATTGATGGCAACTTGTTCAGTGGAATTATCACCTCGGGGTTTGGAAGGTTAAGAAATCTCACAACACTGTATCTCTGGAGAAATTTGTTTCAAACTAGAGAACAAGAAGATTGGGGGTTCATTTCTGACCTAACAAATTGCTCCAAATTACAAACATTGGACTTGGGAGAAAATAACCTGGGGGGAGTTCTTCCTAATTCGTTTTCCAATCTTTCCACTTCGCTTAGTTTTCTTGCACTTGATTTGAATAAGATCACAGGAAGCATTCCAAAGGATATTGGCAATCTTATTGGCTTACAACATCTCTATCTCTGCAACAACAATTTCAGAGGGTCACTTCCATCATCGTTGGGCAGGCTTAGAAACTTAGGCATTCTAGTCGCCTACGAAAACAACTTGAGCGGTTCGATCCCATTGGCCATAGGAAATCTTACTGAACTTAATATCTTACTGCTCGGCACCAACAAATTCAGTGGTTGGATACCATACACACTCTCAAACCTCACAAACTTGTTGTCATTAGGCCTCTCGCACCTCGCACCACAATCAGGGTTGGATACCTACACATCTCAACCTCACAACTGTGTCATAGCCTTCACTATACCTAGTGGGTCCCAAATACCCCAGGTGAAATTAATTCAAATAGTCCAAACACCTATCAAAAAGATGATCAATGTATCAAAAAATACACTTGGAGGGATCAGATACCCACAAGAAATAGGGCATCTCAAAAATCTAGTAGAATTCATGCAGAATCGAATAGATATCAGTAAAATCCCTAACACGCTTGGTGATTGCCAGCTCTTACGGTATCTTTATCTGCAAAATAATTTGTTATCTGGTAGCATCCCATCAGCCTTGGGTCAGCTGAAAGGTCTCGAAACTCTTGATCTCTCAAGCAACAATTTGTCAGGCCAGATACCCACATCCCTTAGCAGATATTACTATGCTTCATTCCTTGAACCTTTCTTTCAACAGCTTTGTGGGGGAAGTGCCAACCATTGCGTGCTTTCGCAGATGCATCCGGGATCTCAATCCAAGGCAATGCCAAACTCTGTGGTGGAATACCTGATCTACATCTGCCTCGATGTTGTCCCATTACTAGAGAACAGAAAGCATTTTCCAGCTCTACCTATTTCTGTTTCTCTGGTCGCAGCACTGGCCATCCTCTCATCACTCTACTTGCTTATAACCTGGAACAAGAGAACTAAAAAGGGAGCCCCTTCAAGAACTTCCATGAAAGGCCACCCATTGGTCTCTTATCCGCAGTTGGTAAAAGCAACAGATGGTTTCGCGCCGACCAATTTGTTGGGTTCTGGATCATTTGCCTCAGTATACAAACGAAAGCTTGAAAATCCTAAGGCACTCAAGAGTTTCACTGCCGAATGTGAAGCACTACGAAATATGCGACATCGAAATCTTGTCAAGATAGTTACAATTTGCTCGAGCATTGATAACAGAGGGAACGATTTCAAAGCAATTGTGTATGACTTCATGCCCAACGGCAGTCTGGAAGATTGGATACACCCTGAAACAAATGATCAAGCAGACCAGAGGCACTTGAATCTGCATCGAAGAGTGACCATACTACTTGATGTTGCCTGTGCATTGGACTATCTTCACCGCCATGGCCCTGAACCTGTTGTACACTGTGATGTTAAATCAAGCAATGTGCTGTTAGATTCTGATATGGTAGCGCATGTTGGAGATTCTGGGCTTGCAAGAATACTTGTTGATGGGACCTCATTGATACAACAGTCAACAAGCTCGATGGGATTTAGAGGGACAATTGGCTATGCAGCACCAggtcagcaagtccttccagtattttgcattttctgatctctagtgctatatgaaatagtttttacctctagtgaaactgatggagaatataagtaattaattgaactaattaaattgcacaaaaataagattatttgccatatctattcagatgctaaatatagctagttcatagaggtacatattttttttatataggaatctagagctactacacactcaaatcaaattatgggtgttttctgctctacactgcaatatgaaatgattatcagaaggatcaaatttgagtaaatttgtcaattctacatttaagaaacacttttttttgtatgtactagttattacaattttttatttcaagaacttgcattgaccatgaaaagtacttggtactacttctaattcccacatggaggtggtgaaaataatatagatacaaaaacgaagtatcatatgttgtgtgatatactataatcacaatgaacacaaacaggattcgtaca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N LSGIISPSLGNLSFLRELDLSD NYLSGEIPPELSRLSRLQLLELSG NSIQGSIHAAIGACTKLTSLDLSH NQLRLVPAETSLEFVPSHQWLCQERFHLILGNLTTPSVFDLTC NRLSRSYTFIARAAQQQSIDYEFCAT NNLTGMIPNSIWNLSSLAAFSCQAKNKLGGMIPTNAFKTLHLLEVVDMGT NRFHGKIPASVANASHLTRLQIDG NLFSGIITSGFGRLRNLTTLYLWR NLFQTREQEDWGFISDLTNCSKLQTLDLGE NNLGGVLPNSFSNLSTSLSFLALDL NKITGSIPKDIGNLIGLQHLYLCN NNFRGSLPSSLGRLRNLGILVAYE NNLSGSIPLAIGNLTELNILLLGT NKFSGWIPYTLSNLTNLLSLGLSHLAPQSGLDTYTSQPHNCVIAFTIPS GSQIPQVKLIQIVQTPIKKMINVSK NTLGG IRYPQEIGHLKNLVEFMQNRID ISK IPNTLGDCQLLRYLYLQN NLLSGSIPSALGQLKGLETLDLSS NNLSGQIPTSLSRYYYASFLEPFFQQLCGGSANHCVLSQMHPGSQSKAMPNSVVEYLIYICLDVVPLLENRKHFPALPISVSLVAALAILSSLYLLITWNKRTKKGAPSRTSMKGHPLVSYPQLVKATDGFAPTNLLGSGSFASVYKRKLENPKALKSFTAECEALRNMRHRNLVKIVTICSSIDNRGNDFKAIVYDFMPNGSLEDWIHPETNDQADQRHLNLHRRVTILLDVACALDYLHRHGPEPVVHCDVKSSNVLLDSDMVAHVGDSGLARILVDGTSLIQQSTSSMGFRGTIGYAAPEYGVGHIASTHGDIYSYGILVLEIVTGKRPTDSTFRPDLGLRQYVELGLHGRVTDVVDTKLILDSENWLNSTNNSPCRRITECIVSLLRLGLSCSQDL*(F)PLSRRHPEISPTNZ*L“N”＝“G”F“N”＝“C”SEQ.ID.No.3ORF 3918(3075bp 被一个内含子(843bp)中断)ATGATATCACTCCCATTATTGCTCTTCGTCCTGTTGTTCTCTGCGCTGCTGCTCTGCCCTTCAAGCAGTGACGACGATGGTGATGCTGCCGGCGACGAACTCGCGCTGCTCTCTTTCAAGTCATCCCTGCTATACCAGGGGGGCCAGTCGCTGGCATCTTGGAACACGTCCGGCCACGGCCAGCACTGCACATGGGTGGGTGTTGTGTGCGGCCGCCGCCGCCGCCGGCACCCACACAGGGTGGTGAAGCTGCTGCTGCGCTCCTCCAACCTGTCCGGGATCATCTCGCCGTCGCTCGGCAACCTGTCCTTCCTCAGGGAGCTGGACCTCGGCGACAACTACCTCTCCGGCGAGATACCACCGGAGCTCAGCCGTCTCAGCAGGCTTCAGCTGCTGGAGCTGAGCGATAACTCCATCCAAGGGAGCATCCCCGCGGCCATTGGAGCATGCACCAAGTTGACATCGCTAGACCTCAGCCACAACCAACTGCGAGGTATGATCCCACGTGAGATTGGTGCCAGCTTGAAACATCTCTCGAATTTGTACCTTTACAAAAATGGTTTGTCAGGAGAGATTCCATCCGCTTTGGGCAATCTCACTAGCCTCCAGGAGTTTGATTTGAGCTTCAACAGATTATCAGGAGCTATACCTTCATCACTGGGGCAGCTCAGCAGTCTATTGACTATGAATTTGGGACAGAACAATCTAAGTGGGATGATCCCCAATTCTATCTGGAACCTTTCGTCTCTAAGAGCGTTTAGTGTCAGAGAAAACAAGCTAGGTGGTATGATCCCTACAAATGCATTCAAAACCCTTCACCTCCTCGAGGTGATAGATATGGGCACTAACCGTTTCCATGGCAAAATCCCTGCCTCAGTTGCTAATGCTTCTCATTTGACAGTGATTCAGATTTATGGCAACTTGTTCAGTGGAATTATCACCTCGGGGTTTGGAAGGTTAAGAAATCTCACAGAACTGTATCTCTGGAGAAATTTGTTTCAAACTAGAGAACAAGATGATTGGGGGTTCATTTCTGACCTAACAAATTGCTCCAAATTACAAACATTGAACTTGGGAGAAAATAACCTGGGGGGAGTTCTTCCTAATTCGTTTTCCAATCTTTCCACTTCGCTTAGTTTTCTTGCACTTGAATTGAATAAGATCACAGGAAGCATTCCGAAGGATATTGGCAATCTTATTGGCTTACAACATCTCTATCTCTGCAACAACAATTTCAGAGGGTCTCTTCCATCATCGTTGGGCAGGCTTAAAAACTTAGGCATTCTACTCGCCTACGAAAACAACTTGAGCGGTTCGATCCCGTTGGCCATAGGAAATCTTACTGAACTTAATATCTTACTGCTCGGCACCAACAAATTCAGTGGTTGGATACCATACACACTCTCAAACCTCACAAACTTGTTGTCATTAGGCCTTTCAACTAATAACCTTAGTGGTCCAATACCCAGTGAATTATTCAATATTCAAACACTATCAATAATGATCAATGTATCAAAAAATAACTTGGAGGGATCAATACCACAAGAAATAGGGCATCTCAAAAATCTAGTAGAATTTCATGCAGAATCGAATAGATTATCAGGTAAAATCCCTAACACGCTTGGTGATTGCCAGCTCTTACGGTATCTTTATCTGCAAAATAATTTGTTATCTGGTAGCATCCCATCAGCCTTGGGTCAGCTGAAAGGTCTCGAAACTCTTGATCTCTCAAGCAACAATTTGTCAGGCCAGATACCCACATCCTTAGCAGATATTACTATGCTTCATTCCTTGAACCTTTCTTTCAACAGCTTTGTGGGGGAAGTGCCAACCATTGGTGCTTTCGCAGCTGCATCCGGGATCTCAATCCAAGGCAATGCCAAACTCTGTGGTGGAATACCTGATCTACATCTGCCTCGATGTTGTCCATTACTAGAGAACAGAAAACATTTCCCAGTTCTACCTATTTCTGTTTCTCTGGCCGCAGCACTGGCCATCCTCTCATCACTCTACTTGCTTATAACCTGGCACAAGAGAACTAAAAAGGGAGCCCCTTCAAGAACTTCCATGAAAGGCCACCCATTGGTCTCTTATTCGCAGTTGGTAAAAGCAACAGATGGTTTCGCGCCGACCAATTTGTTGGGTTCTGGATCATTTGGCTCAGTATACAAAGGAAAGCTTAATATCCAAGATCATGTTGCAGTGAAGGTACTAAAGCTTGAAAATCCTAAGGCGCTCAAGAGTTTCACTGCCGAATGTGAAGCACTACGAAATATGCGACATCGAAATCTTGTCAAGATAGTTACAATTTGCTCGAGCATTGATAACAGAGGGAACGATTTCAAAGCAATTGTGTATGACTTCATGCCCAACGGCAGTCTGGAAGATTGGATACACCCTGAAACAAATGATCAAGCAGACCAGAGGCACTTGAATCTGCATCGAAGAGTGACCATACTACTTGATGTTGCCTGCGCACTGGACTATCTTCACCGCCATGGCCCTGAACCTGTTGTACACTGTGATATTAAATCAAGCAATGTGCTGTTAGATTCTGATATGGTAGCCCATGTTGGAGATTTTGGGCTTGCAAGAATACTTGTTGATGGGACCTCATTGATACAACAGTCAACAAGCTCGATGGGATTTATAGGGACAATTGGCTATGCAGCACCAGGTCAGCAAGTCCTTCCAGTATTTTGCATTTTCTGATCTCTAGTGCTATATGAAATAGTTTTTACCTCTAGTGAAACTGATGGAGAATATAAGTAATTAATTGAACTAATTAAATTGCACAAAAATAAGATTATTTGCCATATCTATTCAGATGCTAAATATAGCTAGTTCATAGAGGTACAGATTTTTTTATATAGGACTCTAGAGCTACCACACACTCAAATCAAATTATGGGTGTTTTCTGCTCTACACTGCAATATGAAATGATTATTACTTCTACATGAACTGATGGAGGAGTTTCAGAAGGATCAAATTTGAGTAAATTTTTTCAATTCTACATTTAAGAAACACTTTTTTTTCATATGCTAGTTACATTTTTTTATTTCACGAGCTTACATTGACCATGAAAAATACTTGGCACTACTTACTAATTCCCACATGGAGGTAGTGAAAATAATATAGATACAAAAACGAAATATCCTATGTTGTGTGATATACTATAATCACAATGAACACAAACAGGATTCGTACAAAAGTAATTAGCCATCATAGCAACTGATTGCTTGGGGTAACTGTATAGCACAATCATACCAAATTTCTTTAGATATGTATCTGTAAATTAGATTCTTAAAGTTAAATATGAAATTTCATTGGTATTTATGTTTCTTTATATAATAAAAATTAATCCAGCCTTTGCATCTATCATTTGTCCAGACATCCTTGTTATTTGTGATATTTAACACGTAAATTTACATAATTATACATCCAAGTTCTTTTTATTTAACACTGTAAATTTCAAATCGTACATGTTATAAAGAATGTACTATATTTCCTGCTCAAACAGAGTATGGCGTTGGGCTCATTGCATCAACGCATGGAGATATTTACAGCTATGGAATTCTAGTGCTGGAAATAGTAACCGGGAAGCGGCCAACTGACAGTACATTCAGACCCGATTTGGGCCTCCGTCAGTACGTTGAACTGGGCCTACATGGCAGAGTGACGGATGTTGTTGACACGAAGCTCATTTTGGATTCTGAGAACTGGCTGAACAGTACAAATAATTCTCCATGTAGAAGAATCACTGAATGCATTGTTTGGCTGCTTAGACTTGGGTTGTCTTGCTCTCAGGAATTGCCATCGAGTAGAACGCCAACCGGAGATATCATCGACGAACTGAATGCCATCAAACAGAATCTCTCCGGATTGTTTCCAGTGTGTGAAGGTGGGAGCCTTGAATTCTGASEQ.ID.No.41025个氨基酸A MISLPLLLFVLLFSALLLCPSSS 23B DDDGDAAGDELALLSFKSSLLYQGGQSLASWN 55TSGHGQHCTWVGVVCGRRRRRHPHR 80C VVK LLLRSSN LSGIISPS 98LGNLSFLRE LDLGDNY LSGEIPPE122LSRLSRLQL LELSDNS IQGSIPAA146IGACTKLTS LDLSHNQ LRGMIPREI 171GASLKHLSN LYLYKNG LSGEIPSA195LGNLTSLQE FDLSFNR LSGAIPSS219LGQLSSLLT MNLGQNN LSGMIPNS243IWNLSSLRA FSVRENK LGGMIPTNA 268FKTLHLLEV IDMGTNR FHGKIPAS292VANASHLTV IQIYGNL FSGIITSG316FGRLRNLTE LYLWRNL FQTREQDDWGFISD 346LTNCSKLQT LNLGENN LGGVLPNSF 371SNLSTSLSF LALELNK ITGSIPKD395IGNLIGLQH LYLCNNN FRGSLPSS419LGRLKNLGI LLAYENN LSGSIPLA443IGNLTELNI LLLGTNK FSGWIPYT467LSNLTNLLS LGLSTNN LSGPIPSE491LFNIQTLSIMINVSKNN LEGSIPQE516IGHLKNLVE FHAESNR LSGKIPNT540LGDCQLLRY LYLQNNL LSGSIPSA564LGQLKGLET LDLSSNN LSGQIPTS588LADITMLHS LNLSFNS FVGEVPT 611IGAFAAASG ISIQGNAKLCGGIP 634D DLHLPRCCPLLENRKH 650E FPVLPISVSLAAALAILSSLYLLITW676F HKRTKK682G GAPSRTSMKGHPLVSYSQLVKATDG 707H FAPTNLLGSGSFGSVYKGKLNIQDHVAVKVLKLENPKALKSFTA 751ECEALRNMRHRNLVKIVTICSSIDNRGNDFKAIVYDFMPNGSLE 795DWIHPETNDQADQRHLNLHRRVTILLDVACALDYLHRHGPEPVV 839HCDIKSSNVLLDSDMVAHVGDFGLARILVDGTSLIQQSTS 879SMGFIGTIGYAAPEYGVGLIASTHGDIYSYGILVLEI 916VTGKRPTDSTFRPDLGLRQYVELGLHGRVTDVVDTKLILDSENW 960LNSTNNSPCRRITECIVWLLRLGLSCSQELPSSRTPTGDIIDEL 1004I NAIKQNLSGLFPVCEGGSLEF 1025SEQ.ID.No.5TCAAGCAACAATTTGTCAGGNCA A/G AT A/C/T CCSEQ.ID.No.6TAACAGCACATTGCTTGATTTNAN G/A TCNCG G/A TGSEQ.ID.No.7TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN (G/A)TC (G/A)CA (G/A)TGSEQ.ID.No.8TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN (G/A)TC (T/C)CT (G/A)TGSEQ.ID.No.9TAAGCAACAATTTGSEQ.ID.No.10TAACAGCACATTGCTTGASEQ.ID.No.11TRK1开放读码框(DNA序列)TCGACGTCGAACAATCGCTTGTCTGGTGCACTTCCTAGTGCTATTGGAAACTATTCAGGGCTGAAGAATCTTGTGTTAACTGGAAATGGTTTCTCAGGTGATATCCCTTCTGATATTGGCAGACTAAAGAGCATCTTAAAGCTGGACCTGAGTAGAAACAACTTCTCTGGCACAATCCCTCCTCAGATTGGTAACTGTCTTTCCTTAACTTACTTGGATTTGAGCCAAAATCAACTTTCTGGTCCTATCCCAGTTCAAATTGCTCAAATTCACATCTTAAATTACATCAATATTTCCTGGAATCACTTCAACGAGAGCCTTCCCGCGGAGATTGGCTTGATGAAGAGTTTAACTTCAGCAGATTTTTCCCACAATAACTTATCTGGATCAATACCTGAAACAGGCCAATATTTATATTTCAACTCAACTTCCTTCACCGGCAACCCTTATCTCTCTGGATCCGACTCGACTCCTAGCAACATTACATCCAACTCACCGTCAGAACTTGGAGACGGAAGTGACAGCAGAACTAAGGTTCCTACAATATACAAGTTCATATTTGCATTTGGGCTCTTATTCTGCTCCCTCATTTTCGTTGTCTTAGCAATAATCAAGACAAGAAAGGGGAGTAAGAATTCAAATTTGTGGAAGCTGACAGCATTTCAGAAGCTTGAGTTCGGAAGTGAAGACGTCTTGCAGTGCTTGAAAGACAACAACGTCATAGGGAGAGGTGGAGCAGGGATAGTGTATAAGGGAACTATGCCAAATGGTGATCATGTCGCGGTGAAGAAATTGGGAATAAGCAAAGGCTCACATGATAACGGCCTATCTGCTGAACTTAACACATTAGGGAAGATCAGGCATAGGTACATTGTGAGACTGCTCGCGTTTTGTTCAAACAAGGAAGTCAACTTGCTAGTTTATGAGTACATGCTAAATGGAAGCTTAGGTGAAGTGCTTCATGGGAAGAACGGCGGGCAACTCCAATGGGAAACTAGGCTAAAAATAGCCATAGAAGCTGCCAAGGGCCTTTCTTATTTGCACCACGATTGCTCCCCTATGATAATCCACCGCGATGTCAAGTCCAACAATATATTGTTGAACTCTGAACTTGAAGCTCATGTTGCAGATTTTGGATTAGCCAAGTACTTTCGTAACAATGGTACCTCTGAGTGCATGTCTGCAATTGCAGGATCTTATGGCTACATTGCTCCAGAATATGCATACACGCTGAAAATTGATGAGAAAAGCGATGTGTATAGCTTTGGAGTGGTGTTGTTGGAGCTTATAACAGGACGAAGGCCAGTAGGAAATTTTGGAGAAGAAGGAATGGACATTGTACAATGGGCGAAAACGGAGACAAAATGGAGCAAAGAAGGGGTGGTGAAAATCTTGGATGAGAGGCTAAAAAATGTTGCAATTGTTGAAGCTATGCAAGTATTTTTTGTAGCAATGCTTTGTGTTGAAGAGTACAGCATTGAGAGGCCTACAATGAGGGAAGTAGTCCAAATGCTTTCTCAAGCTAAACAACCAAATACTTTCCAAATCCAATAASEQ.ID.No.12STSNNRLSGALPSAIGNYSGLKNLVLTGNGFSGDIPSDIGRLKSILKLDLSRNNFSGTIPPQIGNCLSLTYLDLSQNQLSGPIPVQIAQIHILNYINISWNHFNESLPAEIGLMKSLTSADFSHNNLSGSIPETGQYLYFNSTSFTGNPYLSGSDSTPSNITSNSPSELGDGSDSRTKVPTIYKFIFAFGLLFCSLIFVVLAIIKTRKGSKNSNLWKLTAFQKLEFGSEDVLQCLKDNNVGRGGAGIVYKGTMPNGDHVARSAGFAAASSRGGIVYKGTMPNGDHVAVKKLGISKGSHDNGLSAELNTLGKIRHRYIVRLLAFCSNKEVNLLVYEYMLNGSLGEVLHGKNGGQLQWETRLKIEAAKGLSYLHHDCSPMIIHRDVKSNNILLNSELEAHVADFGLAKYFRNNGTSECMSAIAGSYGYIAPEYAYTLKIDEKSDVYSFGVVLLELITGRRPVGNFGEEGMDIVQWAKTETKWSKEGVVKILDERLKNVAIVEAMQVFFVAMLCVEEYSIERPTMREVVQMLSQAKQPNTFQIQSEQ.ID.No.13TRL1DNA序列TCAAGCAACAATTTRTCAGGACAAATACCTTCAGGCTTGGCCAATGTGACCACACTGGCAGCATTTAACGTTTCTTTCAATAATCTGTCTGGGCCACTGCCTCTTAACAAAGATTTGATGAAGTGTAATAGTGTTCAGGGAAACCCCTTTCTGCAATCGTGCCATGTATTTTCTCTATCAACACCTTCTACAGATCAGCAGGGAAGAATAGGGGACTCACAAGATTCTGCTGCGTCTCCTTCAGGTTCAACCCAGAAAGGAGGGTGCAGCGGTTTCAACTCCATAGAGATTGCATCCATAACATCTGCGGCAGCTATTGTGTCAGTTCTTCTTGCTCTGATAGTCCTGTTCTTTTACACCAGAAAATGGAATCCAAGATCTAGAGTTGCTGGATCTACCAGGAAAGAAGTCACAGTGTTTACAGAAGTTCCGGTTCCTTTAACATTTGAAAATGTAGTGCGGGCCACAGAGATCTCAAATCAAGCAATGTGCTGTT
权利要求
1.一种分离的核酸构建物，其特征在于，它含有RRK多聚核苷酸序列，该多聚核苷酸与SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3在严紧条件下杂交。
2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，RRK多聚核苷酸序列编码具有富含亮氨酸重复片段基序的RRK多肽。
3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，RRK多聚核苷酸序列编码具有胞质蛋白激酶结构域的RRK多肽。
4.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，多聚核苷酸序列是全长的基因。
5.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，RRK多聚核苷酸序列是Xa21基因，它编码SEQ.ID.No.2所示的Xa21多肽。
6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，Xa21多聚核苷酸序列编码SEQ.ID.No.4所示的Xa21多肽。
7.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，Xa21多聚核苷酸如SEQ.ID.No.1所示。
8.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，Xa21多聚核苷酸如SEQ.ID.No.3所示。
9.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，还含有可操作地连于RRK多聚核苷酸序列的启动子。
10.如权利要求9所述的核酸构建物，其特征在于，启动子是组织特异型启动子。
11.如权利要求9所述的核酸构建物，其特征在于，启动子是组成型启动子。
12.一种核酸构建物，其特征在于，它含有来自RRK基因的启动子序列，该启动子序列连于异源的多聚核苷酸序列。
13.如权利要求12所述的构建物，其特征在于，异源多聚核苷酸序列是赋予植物抗病原体抗性的结构基因。
14.如权利要求12所述的构建物，其特征在于，启动子来自SEQ.ID.No.1。
15.一种转基因植物，其特征在于，它含有重组表达盒，该表达盒含有可操作地连于Xa21多聚核苷酸序列的植物启动子。
16.如权利要求15所述的转基因植物，其特征在于，植物启动子是异源启动子。
17.如权利要求15所示的转基因植物，其特征在于，该植物是水稻。
18.如权利要求15所示的转基因植物，其特征在于，该植物是番茄。
19.如权利要求15所述的转基因植物，其特征在于，RRK多聚核苷酸序列是Xa21基因，它编码SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.4所示的Xa21多肽。
20.如权利要求19所述的转基因植株，其特征在于，Xa21多聚核苷酸序列如SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3所示。
21.一种增加植物对黄单胞菌抗性的方法，其特征在于，该方法包括，将重组表达盒引入植物，该表达盒含有可操作地连于RRK多聚核苷酸序列的植物启动子。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，该植物组织来自水稻。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，该植物组织来自番茄。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，该多聚核苷酸序列编码SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.4所示的Xa21多肽。
25.如权利要求21所述的方法，其特征在于，该多聚核苷酸序列如SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3所示。
26.如权利要求21所述的方法，其特征在于，该启动子是组织特异型启动子。
27.如权利要求21所述的方法，其特征在于，该启动子是组成型启动子。
28.一种在植物中分离RRK序列的方法，其特征在于，该方法包括提供从植物中制备的DNA；将DNA与具有来自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的序列的引物接触；和确定扩增反应是否已发生。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，该DNA是cDNA。
30.一种来自用权利要求28所述的方法分离出的RRK基因的序列。
31.一种在植物中分离RRK序列的方法，其特征在于，该方法包括提供从植物中制备的DNA；将DNA与具有基于SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.4的氨基酸序列的序列的引物接触；和确定扩增反应是否已发生。
全文摘要
本发明提供的核酸可编码赋予对黄单胞菌属抗性的多肽。该核酸可用于产生对病原体有抗性的转基因植物。
文档编号B65D85/88GK1191573SQ96191493
公开日1998年8月26日 申请日期1996年1月17日 优先权日1995年1月17日
发明者P·C·罗纳德, 王国梁, 宋文远, V·绍博 申请人:加利福尼亚大学董事会