专利名称：双价抗病基因植物表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物基因工程，特别是一种双价抗病基因(GAFP+NP-1)植物表达载体。
背景技术：
兔防御素属于α-防御素，该α-防御素防御素对革兰氏阴性菌、阳性菌、分枝杆菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用。其中NP-1抗菌谱广，抑菌活性强，并且由于其抗性机理独特，微生物不易对其产生抗性，因此兔防御素基因在植物抗病育种中有着极其广泛的应用前景和较高的应用价值。天麻抗真菌蛋白是从天麻块茎中分离和提纯的，体外抑菌结果表明对二十几种真菌均有一定的抗性。原核表达及转入烟草、棉花和番茄等结果表明，对真菌有一定的抑制作用。因此天麻抗真菌蛋白基因在植物抗病基因工程方面有巨大的潜力。
目前在植物抗病基因工程中常用的基因往往抗病特异性强，并多为单基因转化，因而只能控制某一病原或生理小种和株系，且病原菌较易产生抗性。将两个基因分别构建在不同的植物表达载体上，不利于将其同时转入植物，达到极大地提高转基因植株持续性抗病能力，扩大抗菌谱的范围的目的。选用抗菌谱较广的抗病基因以及采取多基因转化的策略，可极大地提高转基因植株持续性抗病能力，扩大抗菌谱的范围。
发明内容
本发明的目的是将兔防御素基因(NP-1)表达盒与天麻抗真菌蛋白基因(GAFP)表达盒重组，构建成双价抗病基因植物表达载体。
本发明的技术方案是一种双价抗病基因植物表达载体，含有在植物细胞中组成型表达的启动子、兔防御素基因、天麻抗真菌蛋白基因、终止子和筛选标记基因，其特征在于将其中的兔防御素基因、天麻抗真菌蛋白基因重组到植物细胞表达的载体上。该载体的转基因植物细胞将含有兔防御素蛋白、天麻抗真菌蛋白。
所述兔防御素基因的表达产物为兔防御素蛋白(NP-1)；兔防御素基因的5’端组装组成型表达启动子CaMV35S(花椰菜花叶病毒CAMV的35S启动子)，它能使兔防御素基因在植物细胞组成型表达；兔防御素基因的3’端组装了nos(章鱼碱合成酶基因)终止子。
所述天麻抗真菌蛋白基因的表达产物为天麻抗真菌蛋白基因；天麻抗真菌蛋白基因的5’端组成型表达启动子CaMV35S，它能使天麻抗真菌蛋白基因在植物细胞组成型表达；天麻抗真菌基因的3’端组装了nos终止子。
所述的基因重组方式是将兔防御素基因的表达盒与天麻抗真菌基因的表达盒串联，它能使兔防御素蛋白和天麻抗真菌蛋白基因在植物细胞组成型表达。
所述载体的质粒组装NPTII基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡那霉素筛选。
本发明与现有技术相比，其显著优点是本发明所述载体含有的两个抗病基因抗菌谱均较广，且抗菌机理不同，将该载体转化具有重要经济价值的农作物和林木，从而提高其持续性抗病能力，具有极为重要的意义。
四
附图是本发明双价抗病基因植物载体pBin35SGAFP-NP1的构建路线图。
从pBin35SNP1上切下35S-NP1-Nos片段，经过两步中间载体pDM302-FU和pGEM-7Zf，在一端加入HindIII酶切位点，然后连入载体pBin35SGAFP，最终得到载体pBin35SGAFP-NP1。
五具体实施例方式
双价抗病基因植物表达载体pBin35SGAFP-NPI的构建1、pBin35SNP1以EcoRI、HindIII酶切所得35S-NP1-nos片段，连接至EcoRI、HindIII酶切的pDM-302-FU载体片段，得pDM302-FU-NP1。经EcoRI，HindIII酶切鉴定得1.3kb左右条带，为35S-NP1-nos。
2、将pDM302-FU-NP1以EcoRI、XhoI酶切所得35S-NP1-nos片段，连接至EcoRI、XhoI酶切的pGEM-7Zf载体片段，得pGEM-NP1b，蓝白斑筛选所得阳性克隆，经EcoRI，XhoI双酶切鉴定，可见一条1.3kb左右条带，即35S-NP1-nos。
3、将pGEM-NP1b以HindIII酶切所得35S-NP1-nos片段，连接至HindIII酶切的pBin35SGAFP载体片段，得pBin35SGAFP-NP1，HindIII酶切切下1.3kb左右条带，说明35S-NP1-Nos已经成功插入。
权利要求
1.一种双价抗病基因植物表达载体，含有在植物细胞中组成型表达的启动子、兔防御素基因、天麻抗真菌蛋白基因、终止子和筛选标记基因，其特征在于将其中的兔防御素基因、天麻抗真菌蛋白基因重组到植物细胞表达的载体上。
2.根据权利要求1所述的双价抗病基因植物表达载体，其特征在于兔防御素基因的表达产物为兔防御素蛋白(NP-1)。
3.根据权利要求1所述的双价抗病基因植物表达载体，其特征在于兔防御素基因的5’端组装组成型表达启动子CaMV35S，它能使兔防御素基因在植物细胞组成型表达。
4.根据权利要求1所述的双价抗病基因植物表达载体，其特征在于兔防御素基因的3’端组装了nos终止子。
5.根据权利要求1所述的双价抗病基因植物表达载体，其特征在于天麻抗真菌蛋白基因的表达产物为天麻抗真菌蛋白基因。
6.根据权利要求1所述的双价抗病基因植物表达载体，其特征在于天麻抗真菌蛋白基因的5’端组成型表达启动子CaMV35S，它能使天麻抗真菌蛋白基因在植物细胞组成型表达。
7.根据权利要求1所述的双价抗病基因植物表达载体，其特征在于天麻抗真菌基因的3’端组装了nos终止子。
8.根据权利要求1所述的双价抗病基因植物表达载体，其特征在于将兔防御素基因的表达盒与天麻抗真菌基因的表达盒串联，它能使兔防御素蛋白和天麻抗真菌蛋白基因在植物细胞组成型表达。
9.根据权利要求1所述的双价抗病基因植物表达载体，其特征在于该载体的质粒组装NPTII(新霉素磷酸转移酶)基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡那霉素筛选。
全文摘要
本发明公开了一种双价抗病基因植物表达载体，它含有在植物细胞中组成型表达的启动子、兔防御素基因、天麻抗真菌蛋白基因、终止子和筛选标记基因，其特征在于将其中的兔防御素基因、天麻抗真菌蛋白基因重组到植物细胞表达的载体上。该载体的转基因植物细胞将含有兔防御素蛋白、天麻抗真菌蛋白。本发明所述载体含有的两个抗病基因抗菌谱均较广，且抗菌机理不同，将该载体转化具有重要经济价值的农作物和林木，从而提高其持续性抗病能力，具有极为重要的意义。
文档编号C12N15/65GK1597967SQ200410041718
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月18日 优先权日2004年8月18日
发明者陈英, 王义琴, 黄敏仁, 孙勇如, 王光萍, 张新叶, 王明庥, 诸葛强, 徐立安 申请人:南京林业大学