Gapc基因在增强植物抗病性中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及GAPC基因在增强植物抗病性中的用途。
【背景技术】
[0002] 植物病原微生物对农业生产造成巨大损失，如：烟草花叶病毒属病毒 (Tobamovirus)是危害我国农业生产的重要病毒病原之一，该属W烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV)和番茄花叶病毒（tomato mosaic virus,ToMV)为代表，能够在多种重 要经济作物上引起花叶病，症状主要有：花叶，叶片弯曲皱缩甚至枯萎，植株黄化矮化，果实 斑驳甚至崎形，导致作物生物产量显著降低，给农业生产造成重大损失。假单抱杆菌属了香 假单抱杆菌烟草专化型（Pseudomonas syringae pv.t油aci)是烟草种植过程中的重要病 原菌之一，能够为害叶、花、葫果和种子，造成植株腐烂，倒伏死亡，如被野火焚烧状。
[0003] 然而，目前增强植物对各种病害抗性的方法的研究，仍有待加强。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种能够有效增强植物抗病性的方法。
[0005] 首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现和工作而完成的：
[0006] 自瞻（此处特指巨自瞻）是一个在生物体内广为存在的蛋白降解途径，在植 物中一般是指细胞自身细胞质蛋白或细胞器被膜质包被形成自瞻小泡，运输至液泡并 与之融合，降解其所包裹的内容物的过程，目前植物中已鉴定出多个参与自瞻过程的蛋 白，如ATG6、ATG3、FIP200等。在植物中，自瞻响应R0S信号诱导并参与氧化蛋白的降 角军(Xiong Y, Contento A L, Nguyen P Q, et al. Degradation of oxidized proteins by autophagy during oxidative stress in Arabidopsis[J].Plant physiolo gy，2007, 143 (1) : 291-299.)，同时与植物的抗病反应息息相关。据报道，植物自瞻能够调控 过敏性坏死反应并且在植物抗病毒、细菌、真菌中发挥作用。
[0007] 发明人采用免疫共沉淀及质谱分析的方法，W本生烟草（Nicotiana benthamiana，简称Nb)自瞻过程中的关键蛋白ATG3为钓巧，筛选烟草的总蛋白，得到一个 与ATG3相互作用的蛋白一一胞质定位的GAPDH ;GAPC。
[000引其中，甘油醒-3-磯酸脱氨酶（GAPDH)是生物糖酵解途径中重要的酶，同时也具备 独立于糖酵解之外的多重功能，如动物细胞中，GAPDH参与基因转录、DNA复制、tRNA细胞核 外转运、DNA修复、细胞自瞻、细胞调亡、病原物侵染等；植物细胞中，该蛋白参与胚胎发育、 花粉管发育、根系发育化及ABA、R0S信号转导等。植物中，GAPDH有多个同工型蛋白，其中 胞质定位的GAPDH被称为GAPC (巧toplasmic GAPDH)。
[0009] 病毒诱导的基因沉默（VIG巧是根据植物对RNA病毒防御机制发展的技术，指携带 目标基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默，引起表型变化，进而根据表型 变异研究目标基因的功能。与对植物进行基因敲除的方法相比，VIGS能够侵染当代植物， 对目标基因进行沉默和功能分析，已广泛应用于烟草、番茄等的研究。
[0010] 因而，发明人在烟草中利用VIGS技术沉默GAPC，W研究基因沉默对植物的生长发 育有无影响，W及经沉默后植株的抗病性。结果，发明人惊奇地发现，沉默植株没有发育表 型，表明GAPC基因沉默后对植物生长发育等基本过程没有太大影响，适合育种。进一步，发 明人通过一系列方法研究发现，GAPC沉默的转N基因烟草对TMV抗性增强，对TMV-P50 (N基 因介导过敏性坏死反应的诱导因子）诱导的皿反应增强（皿反应即过敏性坏死反应，是指 抗病植物面对病原侵染时，病原侵染点处的细胞通常死亡，细胞死亡被限制在侵染点），对 烟草的致病细菌Pseudomonas syringae pv.t油aci(Pta)抗性增强。从而证明了沉默GAPC 增强了植物的抗病性。进一步的研究表明，沉默GAPC导致自瞻水平升高，可能影响植物免 疫反应，从而导致植物对病毒的抗性增强。
[0011] 因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了 GAPC基因在增强植物抗病性中的用 途。具体地，根据本发明的实施例，通过下调植物中GAPC基因的表达，增强所述植物的抗病 性。由此，能够有效实现增强植物抗病性。
[0012] 根据本发明的实施例，本发明所述的用途中所指植物并没有特别限制。根据本发 明的一些具体示例，所述植物为选自烟草、番茄、辣椒、马铃馨、大豆、水稻、小麦、玉米和棉 花的至少一种，优选烟草。由此，基于GAPC基因在增强植物抗病性中的用途，通过下调上述 植物中GAPC基因的表达，能够有效增强相应植物的抗病性。
[0013] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种增强植物抗病性的方法。根据本发 明的实施例，该方法在于：下调所述植物中GAPC基因的表达。由此，能够有效实现增强植物 抗病性。
[0014] 另外，根据本发明上述实施例的增强植物抗病性的方法还可W具有如下附加的技 术特征：
[0015] 根据本发明的实施例，本发明的方法适用的植物不受特别限制。根据本发明的一 些具体示例，所述植物为选自烟草、番茄、辣椒、马铃馨、大豆、水稻、小麦、玉米和棉花的至 少一种，优选烟草。即通过下调上述植物中GAPC基因的表达，能够有效增强相应植物的抗 病性。
[0016] 根据本发明的实施例，下调所述植物中GAPC基因的表达的方法也不受特别限制， 可W采用任何已知能够使植物特定基因的表达量下降的方法进行，例如VIGS技术、miRNA 干扰技术等，只要能够准确特异性地下调所述植物中GAPC基因的表达即可。
[0017] 根据本发明的一些实施例，针对所述植物，利用VIGS技术沉默GAPC基因，W便实 现下调所述植物中GAPC基因的表达。由此，能够准确、有效地实现下调所述植物中GAPC基 因的表达，且对植物生长发育无影响。
[001引根据本发明的实施例，通过W下步骤沉默GAPC基因：提供载体pTRVl和 PTRV2-GAPC，其中所述载体PTRV2-GAPC是通过将SEQ ID NO ;1所示的片段酶切至载体 PTRV2获得的；W及利用载体pTRVl和PTRV2-GAPC共转染植物，W便使所述植物中的GAPC 基因沉默。其中，载体 pTRVl (GenBank ;AF406990)和 pTRV2 (GenBank ;AF406991. 1)的载 体信息参见 Liu Y，Schiff M，Marathe R，et al.Tobacco Rarl,邸Sland NPRl/NIMll化e genes are required for N-mediated resistance to tobacco mosaic virus[J]. The Plant化urnal，2002, 30(4) : 415-429.，通过参照将其全文并入本文。本领域技术人员可W 根据上述的载体信息自行构建两个载体。由此，能够有效使目的植物的GAPC基因沉默。
[0019] 根据本发明的实施例，将携带载体pTRVl的农杆菌菌液和携带PTRV2-GAPC的农杆 菌菌液按照1 ;1体积混合，室温下放置4小时后，利用混合菌液对所述烟草进行注射，W便 实现所述共转染。由此，GAPC基因沉默效果好，效率高。
[0020] 根据本发明的另一些实施例，利用miRNA下调所述植物中GAPC基因的表达。即通 过将与GAPC基因同源的miRNA片段导入目的植物，通过miRNA和祀基因GAPC的mRNA碱基 配对引导沉默复合体巧ISC)降解该mRNA或阻碍其翻译，从而能够准确、有效地实现下调所 述植物中GAPC基因的表达。
[002U 根据本发明的实施例，所述miRNA具有SEQ ID NO ;2或SEQ ID NO ;3所示的序列， 具体如下：
[0022]沈Q ID NO ;2 ;TCATTCCCGTCAATTTTGCAT ;
[002引 SEQ ID NO ;3 ;TCAAAAATGCTTGACTTC。
[0024] 由此，通过能够有效下调所述植物中GAPC基因的表达。
[0025] 根据本发明的实施例，利用miRNA下调所述植物中GAPC基因的表达，是通过白菜 卷叶病毒系统将所述miRNA转入所述植物而实现的。由此，转化效率高，且不会影响目的植 物的生长发育。
[0026] 需要强调的是，发明人首次发现了 NbGAPC与NbATG3蛋白的相互作用，并发现 NbGAPC在植物自瞻、抗病过程中的负调控作用，从而提出了 GAPC基因在增强植物抗病性中 的用途，为植物抗病育种提供重要的理论支持。此外，利用本发明的增强植物抗病性的方 法，能够有效增强目的植物的抗病性，且简单方便、可重复性好，对植物的生长发育无影响， 适于推广应用。
[0027] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出