应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种应用iTRAQ技术研宄水稻响应稻瘟 病菌侵染蛋白质组变化的方法。
【背景技术】
[0002] 植物抗病性及抗病机制研宄是当今植物病理学和植物抗病育种研宄的热点和焦 点。在自然情况下，植物经常处于生物胁迫或非生物胁迫之中。当受到外来病原菌侵染 时，植物将通过改变自身蛋白质组的表达模式或酶类的活性等方式以抵制病原物的入侵。 植物的抗病性的产生涉及到一系列复杂的信号传导过程，目前已有研宄从各种植物中发现 与鉴定了一些与病原物侵染相关的抗病途径被激活。
[0003] 但目前多数研宄集中在利用基因芯片、基因表达序列分析等技术分析植物与病原 物互作过程中激活的抗病信号传导途径，由于这些技术主要是基于mRNA水平的变化，不能 真实的反映蛋白水平的变化，不利于揭示植物与病原物的具体互作机制。
[0004] 蛋白质是生理功能的执行者和生命现象的直接体现者，其丰度、结构、稳定性、亚 细胞定位及与其他生物大分子的相互作用时刻处于动态变化之中，对整个蛋白质组进行功 能分析、鉴定及其翻译后修饰的研宄，能更加客观准确地揭示生命现象。蛋白质组学也很早 被用于水稻与稻瘟病菌互作的研宄中，但大多数还是基于2D电泳分离和质谱鉴定联合应 用，属于对于一个细胞或组织的蛋白质进行的定性研宄，仅能确定蛋白质的身份但不能对 蛋白质的功能给出最终定论。因此，这些被鉴定出来的蛋白数量、种类有限，很少被继续深 入的研宄，也未能被有效的用于水稻的抗病育种中。
[0005] 事实上，蛋白质在浓度上的变化对于实现其在细胞中的功能来说极其重要，这些 浓度的变化往往能揭示细胞的真实生命代谢过程。因此，在蛋白质组学研宄中，对蛋白质的 相对和绝对浓度进行测量显得尤为重要。相对和绝对定量同位素标记（isobarictagsfor relativeandabsolutequantitation，iTRAQ)是由美国应用生物系统公司在2004年推 出的研宄蛋白质组的新技术，可以同时对1个基因组表达的全部蛋白质或1个复杂的混合 体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定，不仅降低了实验过程中所引入的技术误差，还 克服了 2-DE不能对低丰度、极大和极小、极碱性和疏水蛋白进行有效分离的问题，使得全 面分析蛋白质组的变化成为可能。iTRAQ技术已成为目前蛋白质组学定量方法中一个十分 重要的技术，其作用已经在许多生物体和组织研宄中得到证明，但尚未见到该技术用于水 稻与稻瘟病互作的差异蛋白质组学研宄的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺点与不足，提供一种应用iTRAQ 技术研宄水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法。用以克服现有技术的研宄效果不准 确的问题。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种应用iTRAQ技术研宄水稻响应稻瘟病 菌侵染蛋白质组变化的方法，通过定量蛋白质组学技术以较为全面、准确的分析抗、感病水 稻品种响应稻瘟病侵染后的蛋白质组变化，所述定量蛋白质组学技术为iTRAQ技术。
[0008] 所述的应用iTRAQ技术研宄水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，包含以 下步骤：
[0009] A?植物材料与叶片蛋白的提取；
[0010]B.对步骤A所得的蛋白质样品进行进一步FASP酶解、肽段标记、SCX分级及LC-MS质谱分析；
[0011] C.对上步所得的质谱鉴定结果进行数据查库、定量分析，获取水稻-稻瘟病菌互 作过程中整个蛋白质组的变化情况。
[0012] 步骤A中所述植物材料与叶片蛋白的提取，具体步骤为分别取接种稻瘟病菌前后 Oh和24h不同时间点的抗病材料及感病材料叶片，进行液氮研磨、离心、裂解处理，并进行 蛋白质量的SDS-PAGE电泳检测。
[0013] 步骤B中所述步骤是在肽段定量后各组样品分别取约90yg，按照AB公司试剂盒 iTRAQReagent_8plexMultiplexKit(ABSCIEX)说明书进行FASP酶切、肽段标记后进行 的SCX预分级，并进一步进行质谱鉴定。
[0014] 步骤C中所述步骤是将经质谱分析及Mascot查库后的结果合并后以Peptide FDR< 0. 01筛选过滤；对共同鉴定到的蛋白进一步进行GO聚类分析，选取差异倍数>1. 2 或〈0. 8、p-value〈0. 05的蛋白进行进一步分析，获取水稻-稻瘟病菌互作过程中整个蛋白 质组的变化情况。
[0015] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤A的具体步骤为：
[0016] 1)对抗病材料及感病材料的3. 5-4叶期的水稻幼苗进行稻瘟病菌的接种，接种 0h、24h后取样，迅速置于液氮中冷却后置于-80°C中保存备用；
[0017] 2)取水稻组织样品，用液氮研磨成粉末并转入50ml离心管中，加入25ml提取 液-20°C沉淀lh;离心10000rpm，45min，弃上清；空气干燥后按10:1体积加入SDTbuffer， 祸旋混勾，沸水浴5min;超声破碎后沸水浴5min，离心取上清，利用BCA法进行蛋白质定 量；
[0018] 3)取20yg蛋白质样品，按体积比5:1加入5X上样缓冲液，沸水浴5min，离心 14000g20min，取上清进行12. 5%SDS-PAGE电泳；恒流14mA，电泳90min后对胶进行考马 斯亮蓝染色。
[0019] 步骤2)中所述的提取液为TCA与丙酮体积比为1:9,添加有65mMDTT。
[0020] 步骤 2)中所述的SDTbuffer的组分为 4%SDS，ImMDIT，150mMTris-HCl，pH8. 0。
[0021] 步骤2)中所述的超声破碎的条件为80w，超声10s，间歇15s，共10次。
[0022] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤B的具体步骤为：
[0023] (1)取400yg样品，加入65mMDTT，沸水浴5min，冷却至室温；加入200y1UA buffer混勾，转入超滤离心管，离心14000g，15min;加入200ylUAbuffer离心14,000g， 15min，弃滤液；加入 100y1IAA，600rpm振荡lmin，避光室温 30min，离心 14000g，lOmin; 加入 100ulUAbuffer，离心 14000g，10min重复 2 次；加入 100ylDissolutionbuffer，离 心 14000g，lOmin重复 2 次；加入 40y1Trypsinbuffer，600rpm振荡lmin，37°C16_18h; 换新收集管，离心14000glOmin，取滤液，0D28(I肽段定量；
[0024] (2)肽段标记及SCX分级：
[0025] 各组样品分别取约90yg，按照AB公司试剂盒iTRAQReagent-8plex MultiplexKit(ABSCIEX)说明书进行样品标记；将标记后的所有肽段混合，采用AKTA PurifierlOO(GEHealthcare)仪器进行SCX预分级，收集穿流及洗脱fraction30份，根据 SCX色谱图每组样品合并成10份，冻干后C18Cartridge(Sigma)脱盐；
[0026] (3)质谱分析鉴定：
[0027] 每份样品采用纳升流速HPLC液相系统EasynLC进行分离；缓冲液:A液为0. 1 % 甲酸水溶液，B液为0. 1 %甲酸乙腈水溶液；色谱柱以95 %的A液平衡；样品由自动进样 器上样到上样柱ThermoscientificEASYcolumn(2cm*100tim5um-C18)，再经分析柱 ThermoscientificEASYcolumn(75ym*100mm3ym-C18)分离，流速为 250nl/min;相关 液相梯度如下：〇min-100min，B液线性梯度从0%到35% ;100min-108min，B液线性梯度从 35%到100% ;108min-120min，B液维持在100% ;然后每份样品经毛细管高效液相色谱分 离后用Q-Exactive质谱仪（ThermoFinnigan)进行质谱分析。
[0028]步骤（1)中所述的UAbuffer为 8MUrea，150mMTris-HCl，pH8. 0。
[0029] 步骤（1)中所述的Trypsinbuffer的配方为在40y1裂解液中添加4yg胰蛋白 酶。
[0030] 步骤（3)中所述的乙腈水溶液中乙腈为84%。
[0031] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤C的具体步骤为：
[0032] 原始数据经降噪、去同位素步骤后获得峰图列表；同时建立参考蛋白序列数据库， 使用蛋白质鉴定软件Mascot2. 2对参考数据库进行搜素进行肽段及蛋白质的鉴定，进一 步对鉴定质量评估，并对基本信息、定量信息及差异蛋白分别进行分类统计；将差异倍数 >1. 2倍或〈0. 8倍、且经统计检验其p-Value〈0. 05的蛋白确定为差异蛋白，获取水稻-稻瘟 病菌互作过程中整个蛋白质组的变化情况。
[0033] 作为本发明的一种优选技术方案，对所有鉴定到的差异蛋白进行G0功能注释分 析（http://www.geneontology.org);进一步通过Pathway分析，确定蛋白参与的主要生理 生化代谢途径和信号传导途径；最后对各蛋白在各样品之间的相对含量进行比较，从而获 得一些感兴趣的重要蛋白。
[0034] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤C之后进一步利用RT-PCR技术对所鉴定出 的差异蛋白进行验证。
[0035] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0036] 本发明能够较完整的鉴定出参与水稻-稻瘟病菌互作过程中的差异蛋白，本发明 实施例利用该方法鉴定了一些水稻响应稻瘟病侵染过程中的发生变化的蛋白；本发明方法 对深入揭示水稻-稻瘟病互作机制提供了一个方法借鉴；在利用转基因技术培育抗稻瘟病 品种上具有重要的参考价值。其优点和效果分述一下：①能快速和有效地筛选到与水稻抗 病相关联的候选基因；②本发明很好的利用iTRAQ这一高通量、准确的蛋白质组学研宄手 段来研宄与水稻抗病相关的候选基因；③可以广泛应用于植物抗病等性状的研宄和开发并 且结合转基因技术来培育抗病性强的植物（作物）新品种。
【附图说明】
[0037] 图1.水稻叶片总蛋白的质量检测图；
[0038] 图2.不同处理之间差异表达蛋白比对图；其中：A为全部差异蛋白，B为上调差异 蛋白，C为下调差异