一种利用聚多巴胺生物检测表面进行抗原检测的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学检测领域，具体地说是一种利用聚多巴胺生物检测表面进行 抗原检测的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 聚多巴胺（PDA)是一种具有粘附性、亲水性及生物相容性的仿生高分子。可以通 过将DA溶解在碱性的水溶液（如10mMtris-HCl缓冲液，pH= 8. 5)中，在有氧的条件下 静置或者搅拌均可以生成具有粘附性的聚多巴胺（PDA)。
[0003]聚多巴胺具有活性的酚羟基、含氮官能团和双键，对几乎所有基底均具有粘附性， 可实现对玻璃、纤维、石英等的表面修饰。这种经PDA修饰的表面可以继续利用聚多巴胺的 反应性进一步反应，从而在在材料表面生成新的功能层。例如，利用与含巯基、氨基等化合 物反应形成单分子层、
[0004] 通过化学镀形成金属层以及通过大分子接枝形成生物活性层等。这些新的功能层 可以进一步用于电化学传感器、细胞成像、药物包埋释放等医学领域。
[0005] 目前聚多巴胺在电化学传感器和药物包埋释放等方面已得到广泛应用，但是聚多 巴胺在疾病诊断、食品检测和环境监测中的应用有待进一步研宄，如果将聚多巴胺应用于 生物检测界面的制备，并进一步应用于医学、食品和环境检测，将具有广阔的开发前景。
[0006]本发明公布了一种利用聚多巴胺生物检测表面进行抗原检测的方法。本发明首先 通过多巴胺（DA)的自聚合在基底表面修饰上一层聚多巴胺（PDA)，之后利用聚多巴胺的化 学反应性进一步与抗体发生反应，将抗体修饰在PDA表面，进而通过双抗夹心法检测样品 中抗原的含量，并研宄其在生物医学、食品、环境等检测领域的相关应用。
[0007] 该方法制备的新型聚多巴胺生物检测表面具有很高的应用价值。综合以上技术和 相关背景，我们所阐述的方法较为新颖，且重现性较好，准确率较高。同时由于聚多巴胺具 有良好的粘附性，几乎可以修饰所有基底表面，拓展了生物检测的应用范围，在生物医药、 疾病诊断、食品安全、环境检测方面具有良好的应用前景。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是拓展聚多巴胺在疾病检测、食品安全、环境监测中的应用，通过制 备新型聚多巴胺生物检测表面，并将该表面应用于医学、食品与环境检测，拓展聚多巴胺的 应用范围，同时为疾病诊断、食品与环境检测提供新的思路。
[0009] 本发明的工艺包括以下步骤：
[0010] (1)制备检测界面：通过多巴胺（DA)的自聚合在基底表面修饰上一层聚多巴胺 (PDA)胶层，将能与待测抗原特异性结合的抗体（一抗）接枝到聚多巴胺（PDA)胶层表面； [0011] (2)接入抗原：将待测样品中能与上述抗体特异性结合的抗原与抗体结合；
[0012] (3)形成"夹心":加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体（二抗）；
[0013] (4)加入上述酶的发光底物，通过光学方法测定底物浓度，从而得到样品中抗原的 含量。
[0014] 所述基底包括孔板、玻璃、纤维、石英和塑料。
[0015] 步骤⑴中聚多巴胺直接与抗体溶液反应过夜制备抗体检测界面，或，使用戊二 醛作为交联剂，聚多巴胺先与多官能团化合物反应，再与抗体溶液反应过夜制备抗体检测 界面。
[0016] 所述多官能团化合物包括多聚甲醛、乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、环氧氯丙 烷、环己烷甲醛和环戊烷羧酸。
[0017] 所述光学方法包括化学发光法、分光光度法如紫外光谱法和荧光光谱法。
[0018] 上述方法用于生物医学检测时所述抗原包括血液、尿液、唾液、汗液、体液标本中 降钙素原（PCT)、甲胎蛋白（AFP)、甲状腺球蛋白TG、人绒毛膜促性腺激素hCG、胰岛素、甲状 旁腺激素（PTH)、骨钙素、癌胚抗原、铁蛋白、糖类抗原、前列腺特异抗原PSA、鳞状细胞癌抗 原SCCA、组织多态性抗原TPA、促黄体生成激素、雌二醇、睾酮、垂体泌乳素、肌钙蛋白T、衣 原体、弓形虫、AB0血型抗原、ABH抗原、人游离前列腺特异性抗原（fPSA)、人总前列腺特异 抗原（tPSA)、过氧化物酶金葡菌A蛋白、狂犬病毒抗原RV-Ag、人淋巴细胞抗原、人组织多肽 抗原（TPA)、人痢疾内阿米巴抗原、单纯疱瘆病毒抗原、人糖连抗原724和人新型隐球菌抗 原。
[0019] 上述方法用于食品检测时所述抗原包括黄曲霉、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、沙 门氏菌、军团菌、大肠杆菌、李斯特菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌、伏马 毒素、赭曲毒素、河豚毒素、CP4EPS蛋白、免疫球蛋白、氨苄西林钠、脱氧雪腐镰刀菌烯酮和 展青霉素黄曲霉毒素。
[0020] 上述方法用于环境监测时所述抗原包括垃圾焚烧飞灰中的二噁英，土壤中的苏云 金芽孢杆菌的Bt杀虫蛋白，土壤中的除草剂毒莠定、莠去津、西玛津、扑草净甘草磷和丁草 胺，水环境中的甲氰菊酯，环境中的甲胺磷、氟虫腈、除虫脲、甲基对硫磷和毒死蜱。
[0021] 本发明中，多巴胺通过自聚合形成聚多巴胺沉积在基底表面，通过聚多巴胺的化 学反应性与抗体反应形成PDA-抗体检测界面，通过抗体与抗原的特异性反应接入待测抗 原；加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体（二抗），形成"双抗夹心";之后加入酶的发光 底物，发光底物在酶的作用下发生化学反应并释放大量的能量，产生激发态的中间体。这种 激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用光学方法测定底物浓度， 从而得到样品中抗原的含量。
[0022] 本发明的创新性和优势如下：
[0023] 1、将聚多巴胺应用于检测界面的制备，并应用于生物医学、食品安全、环境监控等 领域具有创新性，同时拓展了聚多巴胺的应用范围。
[0024] 2、新型聚多巴胺生物检测表面的制备方法较为新颖，且重现性较好，准确率较高， 具有很高的应用价值。
[0025]3、由于聚多巴胺具有良好的粘附性，几乎可以修饰所有基底表面，拓展了生物医 学检测的应用范围。
【附图说明】
[0026] 图1是PDA-抗体界面检测标本中抗原含量示意图。
[0027] 图2是PDA膜的制备与表征，其中图2a为不同反应时间对PDA膜接枝率的影响； 图2b为不同DA浓度对PDA膜接枝率的影响，图2c和2d分别为PDA膜的SEM图和拉曼光 谱图。
[0028] 图3是"一步法"（a)和"两步法"（b)测得的不同浓度PCT抗体的接枝率以及两 者接枝率的比较（c)。
[0029] 图4是"一步法"（a)和"两步法"（b)测得的不同浓度甲胎蛋白抗体的接枝率以 及两者接枝率的比较（c)。
[0030] 图5 "一步法"制备的PDA-抗体检测界面测得的PCT抗原（a)和AFP抗原（b)发 光值随浓度的变化曲线。
[0031] 图6是"两步法"制备的PDA-抗体检测界面测得的PCT抗原（a)和AFP抗原（b) 发光值随浓度的变化曲线
[0032] 图7a是使用"一步法"制备的PDA-抗体检测界面检测肉制品中沙门氏菌含量。
[0033] 图7b是使用"两步法"制备的PDA-抗体检测界面检测土壤中莠去津含量。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明，但仅是对本发明的示例性 说明，而非对本发明范围的限制。
[0035] 实施例1 :PDA膜的制备与表征
[0036] 选取5mg/mLDA溶液，测定不同反应时间对聚多巴胺接入量的影响，结果如图 2(a)所示。由图可知，随着反应时间的增加，基底的吸光度增加，PDA接入量增大；当DA含 量为5mg/mL时，反应4h和6h后吸光度变化不大，故可选取4小时作为最佳PDA反