一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及畜禽病毒病检测、诊断领域，具体是涉及一种检测鸡新城疫病毒强毒株的胶体金试纸卡的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]新城疫是由新城疫病毒引起一种禽的急性、高度传染性疾病，主要侵害鸡和火鸡，亦可感染其他禽类、鸟类及人类，是世界公认的两大最重要的禽类传染病之一。近年来，新城疫的流行趋势发生了变化，以发病率低、临床症状不明显、死亡率低、蛋用鸡产蛋量下降为特征的非典型新城疫，使得新城疫的防治变得更加复杂和棘手，也为NDV的检测提出了更高的要求。随着新城疫弱毒疫苗的广泛应用，单纯对NDV检测已不能满足生产的需要。亟须建立一种快速区分NDV强毒株和弱毒株的检测技术，以便有针对性地采取相应的防治措施。因此，对NDV强弱毒株的诊断鉴定十分有必要。
[0003]胶体金免疫层析技术是结合胶体金技术和免疫层析技术而建立的一种快速免疫学检测技术，其优点是快速、简单、特异、灵敏、直观和成本低等，近年来逐渐广泛应用于兽医学领域。单克隆抗体用于NDV诊断，具有快速、灵敏和特异性强的优点，并可用于强毒和弱毒的鉴别诊断，这是传统的血清学方法所达不到的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡及其制备方法，可以临床快速检测新城疫病毒强毒株，用于区分新城疫病毒强毒株、弱毒株的临床诊断。
[0005]本发明为解决上述技术问题的不足，所采用的技术方案如下:
[0006]1、一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡，其特征在于:
[0007]所述的鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡包括胶体金试纸条和扣板式卡槽；扣板式卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔，且扣板式卡槽上设置有观察区和加样区；胶体金试纸条主要由支持板、NC膜(硝酸纤维素膜)、金标单克隆抗体垫、样品垫和吸收垫组成；
[0008]所述的NC膜设置在支持板的中部，NC膜一侧的支持板上依次粘贴有含有金标单克隆抗体垫和样品垫，NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫；
[0009]所述NC膜的中部有一条含有新城疫病毒强毒株多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠二抗的质控线；
[0010]胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内；卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区，加样孔对应胶体金试纸条的样品垫。
[0011]所述样品垫中金标单克隆抗体为鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体；所述NC膜中新城疫病毒强毒株抗体为兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体；所述NC膜中羊抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体。
[0012]2、一种制备上述的鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡的制备方法，其特征在于:包括以下步骤:
[0013](I)制备 NC 膜
[0014]兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体的制备:采用致病因子剔除、抗原表位保留的浓缩的新城疫病毒强毒株作为免疫原，提取IgG抗体，制备多克隆抗体；
[0015]检测线的制备:采用三维喷膜仪，调整喷液量为45?50dotS/mL/cm，用包被缓冲液稀释兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体，浓度为56?60 μ g/mL，在NC膜中适当位置划线，即为检测线，晾干备用；所述的包被缓冲液为经过0.40?0.45uL滤膜过滤的0.05?0.07M、ρΗ9.6的CBS缓冲液(碳酸盐缓冲液)；
[0016]质控线的制备:采用三维喷膜仪，调整喷液量为45?48dotS/mL/cm，用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体，浓度为1.6?1.8mg/mL，在NC膜上与检测线平行的位置划线，与检测线间隔4?5_，即为质控线；
[0017]NC膜组装制备:晾干检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的NC膜；用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干，封存备用；所述的封闭工作液为含质量百分比的2.5% BSA,2.5?3.0%脱脂奶粉和0.01M、pH7.0的CBS缓冲液混合后，用0.45?0.48 μ L滤膜过滤得到的封闭工作液。
[0018](2)制备涂覆金标单克隆抗体垫
[0019]鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体的制备:以原核表达并纯化的新城疫病毒强毒株F蛋白进行小鼠免疫，ELSIA鉴定抗体效价及活性后，选取合适小鼠进行单克隆抗体的制备。用20mM含质量百分比为1.5% BSA和0.1 % NaN3、3%四硼酸钠的稀释缓冲液(水溶液)将金标单克隆抗体稀释至终浓度0.05mg/ml ;裁取规格为300 X 7_的玻璃纤维棉，将金标单克隆抗体溶液用单向喷点仪，以5 μ L/cm的速度(大约20ng/条)，均匀喷洒于玻璃纤维棉上，56°C干燥lh，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。
[0020](3)组装新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡
[0021]将涂有检测线和质控线的NC膜粘贴在支持板的中部，在NC膜的一侧依次粘贴含有金标单克隆抗体的玻璃纤维棉和样品垫，在NC膜的另一侧粘贴吸收垫，得到试纸板，将试纸板切割成不同宽度的试纸条，将试纸条安放于卡槽中即为新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡。
[0022](4)新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡使用及判定
[0023]新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡在诊断新城疫病毒强毒株中应用，用棉签采集病鸡眼、气管、肛门分泌物，在稀释液中反复挤压棉签让分泌物充分溶解。将所得的稀释液样本滴加在本试纸卡的样品垫中，在试纸卡的检测线、质控线位置均出现红色条带时，新城疫病毒强毒株检测为阳性；仅质控线出现一条红色条带时，为阴性结果；在试纸卡的质控线未出现红色条带时为无效结果。
[0024]进一步地，步骤(I)中检测线和质控线的线宽为1mm，两线相距4mm，位于膜的中间，距NC膜的边距6?7_。
[0025]有益效果
[0026]本发明所述的胶体金试纸卡利用胶体金免疫层析技术，通过试纸卡中NC膜上分别喷涂含兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体的检测线和含羊抗鼠IgG抗体的质控线，能够临床检测新城疫病毒强毒株，为养殖企业提供一种临床诊断新城疫病毒强毒株的试纸卡，该试纸卡具有特异性强、灵敏度高、检测快速的优点，且不需要使用仪器设备，成本低廉，操作方便，能广泛应用于新城疫病毒强毒株的诊断，为区分新城疫病毒强毒株、弱毒株奠定了基础。
【附图说明】
[0027]图1是本发明的胶体金试纸卡的结构示意图；
[0028]图中:1、扣板式卡槽2、支持板，3、加样孔4、样品垫5、金标抗体垫6、NC膜7、观察区8、吸收垫
【具体实施方式】
[0029]实施例1
[0030]一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡，所述的鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡包括胶体金试纸条和扣板式卡槽；扣板式卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔，且扣板式卡槽上设置有观察区和加样区；胶体金试纸条主要由支持板、NC膜(硝酸纤维素膜)、金标单克隆抗体垫、样品垫和吸收垫组成；
[0031]所述的NC膜设置在支持板的中部，NC膜一侧的支持板上依次粘贴有含有金标单克隆抗体垫和样品垫，NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫；
[0032]所述NC膜的中部有一条含有新城疫病毒强毒株多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠二抗的质控线；
[0033]胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内；卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区，加样孔对应胶体金试纸条的样品垫。
[0034]所述样品垫中金标单克隆抗体为鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体；所述NC膜中新城疫病毒强毒株抗体为兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体；所述NC膜中羊抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体。
[0035]实施例2
[0036]一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡的制备方法，包括以下步骤:
[0037](I)制备 NC 膜
[0038]兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体的制备:采用致病因子剔除、抗原表位保留的浓缩的新城疫病毒强毒株作为免疫原，提取IgG抗体，制备多克隆抗体；
[0039]检测线的制备:采用三维喷膜仪，调整喷液量为45?50dotS/mL/Cm，用包被缓冲液稀释兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体，浓度为56?60 μ g/mL,在NC膜中适当位置划线，即为检测线，晾干备用；所述的包被缓冲液为经过0.40?0.45uL滤膜过滤的0.05?
0.07M、ρΗ9.6的CBS缓冲液(碳酸盐缓冲液)；
[0040]质控线的制备:采用三维喷膜仪，调整喷液量为45?48dotS/mL/cm，用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体，浓度为1.6?1.8mg/mL，在NC膜上与检测线平行的位置划线，与检测线间隔4?5_，即为质控线；
[0041]NC膜组装制备:晾干检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的NC膜；用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干，封存备用；所述的封闭工作液为含质量百分比的2.5% BSA、2.5?3.0%脱脂奶粉和0.01Μ、ρΗ7.0的CBS缓冲液混合后，用0.45?0.48 μ L滤膜过滤得到的封闭工作液。
[0042](2)制备涂覆金标单克隆抗体垫
[0043]鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体的制备后，用20mM含质量百分比为1.5% BSA和0.1% NaN3、3%四硼酸钠的稀释缓冲液将金标单克隆抗体稀释至终浓度
0.05mg/ml ;裁取规格为300X7mm的玻璃纤维棉，将金标单克隆抗体溶液用单向喷点仪，以5 μ L/cm的速度(大约20ng/条)，均勾喷洒于玻璃纤维棉上，56°C干燥lh，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。
[0044](3)组装新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡
[0045]将涂有检测线和质控线的NC膜粘贴在支持板的中部，在NC膜的一侧依次粘贴含有金标单克隆抗体的玻璃纤维棉和样品垫，在NC膜的另一侧粘贴吸收垫，得