用于检测视黄醇结合蛋白(rbp)的胶体金免疫比色法试剂盒及其制备方法
【专利摘要】一种检测视黄醇结合蛋白(RBP)的胶体金免疫比色法试剂盒及其制备方法，本发明属于体外诊断试剂领域，用于判断个体急性肾损伤的情况是否出现。本方法是以胶体金颗粒为载体，将视黄醇结合蛋白(以下均简称为RBP)抗体与胶体金颗粒进行偶联，在相应的检测装置内，使样品中的RBP蛋白与偶联后的金颗粒接触，形成抗原-抗体-金复合物，造成金颗粒在检测波长下吸光度的改变，并且吸光度的改变量与RBP蛋白浓度程正相关，进而达到检测样本中RBP蛋白的目的。本试剂盒并且具备较高的分析灵敏度。
【专利说明】用于检测视黄醇结合蛋白（RBP)的胶体金免疫比色法试剂 盒及其制备方法 发明领域
[0001] 本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及用于检测视黄醇结合蛋白（RBP)的胶体 金免疫比色法试剂盒 技术背景
[0002] 视黄醇结合蛋白（Retinol Binding Protein，RBP)为血液中视黄醇（维生素A) 的转运蛋白。1961年Berggard在免疫电泳中发现在a 2-球蛋白区域能形成一条长沉淀线 的蛋白质，曾称为长a 2-球蛋白。在以后几十年中，人们对这种蛋白质的分子结构、生物学 特性等进行了全面研究，发现这种蛋白质广泛地分布于正常人体液中，属a ^球蛋白，具有 从肝细胞中转运视黄醇至周围组织的功能。现认为血液中RBP主要以视黄醇、前白蛋白结 合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，RBP便与前白蛋白分离，自肾小 球滤出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。近年来的深入研究表明RBP含量改变能够敏感 地反映近端肾小管功能、肝功能损害程度，是反映肾脏、肝脏及营养性疾病发展、转归的敏 感指标。
[0003] RBP分子由一条多肽链及小部分碳水化合物组成，不含中性糖和氨基已糖，分子量 为21，000,沉降系数S^w 2. 3S，等电点pH 4. 4~4. 8,半衰期3~12小时。RBP经硫酸乙 基葡聚糖层析（SlfoethySephadex Chromatography)得到A、B两个峰，二乙氨基乙醇葡聚 糖（DEAE-S印hadex)层析A、B两部分后可获得六^^与B pB2四组分。免疫扩散法显示RBP 的四个组分抗原性是一致的。
[0004] RBP主要由肝细胞合成，广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中。在血液 中，RBP与视黄醇、前白蛋白以1 : 1 : l(mol)的复合物形式存在，转运体内90%的视黄醇 至机体组织，当RBP与细胞表面的RBP受体结合时，视黄醇进入细胞内，复合物解体，游离的 RBP从肾小球滤出，其中绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收，并被分解，供组织利用，仅 有少量从尿中排出。当体内锌、铁缺乏及严重感染等疾病能降低RBP的生物合成。
[0005] RBP的提纯方法主要有普通提纯法、亲和层析法和快速蛋白液相层析法（Fast Protein Liquid Chromatography，FPLC)三类。测定血、尿中的RBP方法较多，有放射免疫 扩散、免疫浊度、免疫电泳、酶联免疫吸附和放射免疫分析，但其中灵敏度高、实用性强的仅 为放射免疫分析法（RLA)和酶联免疫吸附法（ELISA)。
[0006] 1、与肝病的关系：Smith等用放免法检测109例正常人和71例肝病患者血清中 RBP的水平。31例肝硬化（经组织学诊断有24例Laenner's肝硬化、6例坏死后肝硬化和 1例胆汁性肝硬化）及急、慢性肝炎的血清RBP水平均显著低于正常对照组，并发现急性病 毒性肝炎病程早期血清RBP含量降低较晚期更明显。作者对35例急性病毒性肝炎血清RBP 水平与血清胆红素、谷草转氨酶及碱性磷酸酶活力作相关分析，发现RBP与血清胆红素、谷 草转氨酶和碱性磷酸酶活力均显著负相关，提示血清RBP水平能准确、灵敏地反映肝功能 变化。Bosin等用ELISA法测定了 20例肝硬化、5例肝肾综合征的血、尿RBP水平（20例肾 功能正常的肝硬化均为酒精性肝硬化），发现20例肝硬化患者血清RBP水平均显著低于正 常对照组，尿RBP水平与正常组相同；5例肝肾综合征血清RBP显著低于正常，而尿RBP显著 高于正常，此结果表明检测血、尿RBP水平有助于单纯性肝硬化与肝肾综合征的鉴别诊断。
[0007] Bankson等用免疫浊度法测定血清RBP得出了相似的结果，30例肝脏疾病患者血 清RBP水平显著低于正常对照组。
[0008] 2、与肾脏病的关系：Smith等人用放免法检测了 26例慢性肾脏疾病血清RBP水 平，慢性肾孟肾炎9例、慢性肾小球肾炎6例、结石肾1例，糖尿病性肾硬化2例、系统性红斑 狼疮性肾病2例、肾硬化2例及原因不明肾脏病4例，结果26例患者血清RBP水平显著高 于正常组。另外，Bosin等人测定了 4例急性肾小管坏死、14例慢性肾功能衰竭患者血、尿 RBP、肌酐、白蛋白的含量，发现急性肾小管坏死、慢性肾功能衰竭血、尿RBP、肌酐含量均显 著高于正常，白蛋白含量在血液中降低、尿液内增高。作者还分析2例肝肾综合征发病前后 尿RBP的变化，肝病综合征发生前后血肌酐及尿RBP各升高35倍和600倍，表明血、尿RBP 的改变与传统的反映肾功能指标相一致。
[0009] 尿RBP、0 2-微球蛋白（0 2_M)均属反映近端肾小管功能的小分子蛋白。以往0 2_M 是常规的指标，但近几年来随着对小分子蛋白理化特性的深入研究发现，温度、口!1对02-M 的影响较大。Bernard等人对比了 RBP与02-M作为肾小管功能指标的敏感性以及在酸性 尿液中的稳定性。结果表明150例正常人尿标本中有10%的pH < 5. 5、32. 7% pH < 6,当 pH为5. 5时，尿内0 2-M开始快速分解，甚至尿液在膀胱内就开始分解了，pH 5. 0、37 °C、温 育2小时后80% 2-M分解；RBP在pH4. 5时仍稳定，仅在pH4. 0、37°C温育2小时后有40% 分解。作者还对68例各种慢性肾脏疾病患者尿RBP与0 2-M含量作相关分析，发现尿pH调 整前后，二者相关系数各为〇. 86和0. 94,提示如果不存在pH影响，RBP与0 2-M反映肾功 能的灵敏度、特异性非常相似。Blumsohn等观察pH与温度对正常及病理状态下RBP、0 2-M 的影响，报道了相似的结果，当pH等于4、温度为4°C和20°C、48小时后02-M已分解70% 和90%，RBP仅分解5%和25% ;当pH不变、温度37°C时，4小时后02-M仅剩5%，而RBP 分解55%，表明在室温或4°C条件下，正常及异常尿液中RBP稳定性好，是一个比0 2-M更 实用、可靠的肾功能指标。
[0010] 3.与其它疾病关系：Smith等人还测定了 14例甲状腺机能亢进和低下者血清 RBP水平，结果前者较正常人低（31.2±3. lμg/ml)，后者高于正常人（57. 2±7. lμg/ml)。 Winkler等分析了正在接受营养疗法的营养性疾病患者血浆蛋白变化，发现血浆RBP的变 化早于白蛋白和转铁蛋白，并与氮平衡的相关性高于白蛋白和转铁蛋白，表明血清RBP水 平是反映营养性疾病疗效的灵敏、特异性指标。另外，Vaquist等用放免扩散法测定了 19例 正常人和35例消化系统疾病患者血清RBP水平，发现除9例慢性腹泻外，其余患者血清RBP 水平均显著低于正常人。作者还分析了血清RBP与维生素A及暗适应能力的关系，发现血 清 RBP与维生素A含量的相关系数为0. 879,当血清RBP低于正常一半时，患者才出现暗适 应能力降低，提示血清RBP含量能更灵敏地反映维生素A缺乏症。
【发明内容】
[0011] 本发明所要解决的问题是进一步提高检测人体液样本中RBP蛋白含量的分析灵 敏度，提供一种特异性好，灵敏度高的分析RBP蛋白的胶体金匀相免疫比色试剂盒，可以用 于精确测定体液样本中0_140mg/L的RBP蛋白含量。另外本发明还在于提供一种关于RBP 蛋白检测试剂盒的制备方法。
[0012] 为了解决上述问题，本发明采用胶体金匀相免疫反应法，检测体液样本中的RBP 蛋白含量。标记RBP抗体的胶体金颗粒在540nm处有最大吸收峰，当环境中存在RBP蛋白 时，会形成抗原-抗体-金复合物，而此时540nm处的最大吸收峰将随着样本浓度的升高而 减弱，且660nm处的最大吸收峰将随之增加。通过检测并计算540nm吸光度的减少和660nm 吸光度的增加，与已知浓度的样本相联系，进而形成校准曲线，从而即可达到定量测量体液 样本中RBP蛋白的含量。
[0013] 本发明提供以下技术方案：
[0014] 一种关于RBP检测胶体金匀相免疫检测试剂盒，其主要的目的是用于检测人个体 体液样本中RBP蛋白的含量，本发明试剂盒中主要由用于形成校准曲线的已知RBP蛋白的 校准品（RBP校准品），反应缓冲液试剂（试剂1)，胶体金标记物试剂（试剂2)三部分组成。 其中RBP校准品是由校准品稀释液和RBP蛋白按照一定比例配制成不同浓度梯度，其浓度 范围为〇mg/L-140mg/L，反应缓冲液试剂是由磷酸盐和牛血清白蛋白配制而成的能够提供 本发明所需要的免疫学反应的且具有pH缓冲能力的溶液，胶体金标记物试剂是由金标记 的抗人源RBP蛋白的抗体和悬浮标记物的缓冲液组成。
[0015] 首先，根据试剂盒检测需要制备主吸收峰为450nm± 10nm的胶体金颗粒。
[0016] 其次配制试剂1，其主要组成应为50mM PBS pH8. 0溶液，其中溶解有 PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白等多聚物或生物大分子中的一种物质或两种 及其以上，并且控制pH值应在7. 0-9. 0之间。
[0017] 第三，配制试剂2为，其主要组成应为50mM PBS pH8. 0溶液，其中溶解有 PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐温20,牛血清白蛋白和Triton X-100等多聚物或生物大分 子中的一种物质或两种及其以上，并且控制pH值应在7. 0-9. 0之间。将标记RBP抗体后的 金颗粒浓缩，并用此步骤配制的溶液复悬。用去离子水或超纯水稀释复悬后胶体金标记物 试剂（试剂2) 50倍后，并以去离子水或超纯水做空白，在540nm± 10nm处的检测吸光度，若 吸光度在〇. 2000Abs-0. 3000Abs的范围内，则认为试剂2中标记RBP抗体的金颗粒浓度合 格，若不符合上述要求，则进一步调整试剂2中金颗粒浓度，直至符合要求。
[0018] 最终使用时，将RBP校准品（或样本），试剂1和试剂2按照一定的比例和次序混 合，检测吸光度的变化，即可反应出样本中待检测的RBP含量。
[0019] 使用本发明方法，具有高灵敏度特性，可以分析RBP含量在140mg/L以下的样本。 本发明可以同时用于检测不同基质的体液样本，如血清，血浆，尿液中RBP蛋白的含量，不 需要对样本或试剂做其它技术处理，包括增加或减少测试样本量，增大或降低试剂1和试 剂2的比例，具备高灵敏度，高特异性，高准确度和良好的重复性等优点，适合于全自动生 化仪，半自动生化仪和紫外-可见光分光光度计使用。
[0020] 本发明主要目的在于提高对于人体液样本中RBP蛋白含量检测的特异性和分析 灵敏度，在本发明中通过控制标记物的反应条件和金颗粒的大小，以及合适的测量条件，从 而达到上述目的。
[0021] 具体而言，本发明可以提供一种高分析灵敏度的RBP检测试剂盒，其主要特性在 于在Omg/L-8. 75mg/L的范围内具备高分析灵敏度，在0mg/L-140mg/L的范围内具备较好的 线性，对于临床诊断而言具有较好的指导意义。其中试剂盒内包含的试剂1、试剂2和校准 品，以体积计算，校准品用量（或待测样本用量）为2uL-10uL，试剂1用量为200uL-250uL， 试剂2用量为50uL-100uL。
[0022] 本发明中所述的金颗粒大小应以最大吸收峰和吸收峰峰宽控制，通过调整氯金酸 与还原剂的比例，使制的胶体金颗粒的最大吸收峰在540nm±20nm范围内，优化条件使得 颗粒大小进一步得到控制，制的的胶体金颗粒的最大吸收峰在540nm± 10nm范围内，进一 步对实验条件优化，制的胶体金颗粒的最大吸收峰在540nm±5nm的范围内，此时胶体金颗 粒大小最为合适。
[0023] 本发明中所阐述的胶体金匀相试剂1和试剂2中，其缓冲液选用PBS缓冲液，pH 值控制在7. 0-9. 0间，进一步通过实验优化缓冲条件，pH值控制在7. 5-8. 5间，RBP蛋白 与标记的抗体反应较为合适，再进一步优化实验条件发现，pH控制在8. 0±0. 2时，RBP蛋 白与标记的抗体反应最为合适。并且在试剂1中所述的多聚物和生物大分子主要包括 PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白，并在其中加入含量约为0. 1% (质量体积比） 的叠氮钠。试剂2中所述的多聚物和生物大分子PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐温20,牛 血清白蛋白和TritonX-100,并在其中加入含量约为0. 1% (质量体积比）的叠氮钠。在试 剂2中，标记后的抗体在试剂2中的含量以吸光度的方式进行控制，即将含有标记物的试剂 2用去离子水或超纯水稀释50倍以后，以去离子水或超纯水做空白（参比），检测540nm下 的吸光度应在〇. 20Abs-0. 25Abs范围内。试剂2中RBP抗体与胶体金的标记依靠金颗粒表 面带电对RBP抗体的吸附而完成。
[0024] 本发明中所叙述的用于检测或监测体液样本中RBP蛋白含量的试剂盒，其中包括 RBP蛋白校准品和校准品稀释液两部分组成。校准品稀释液由PBS缓冲液、牛血清白蛋白和 叠氮钠组成，其中PBS缓冲液控制pH值在7. 0-9. 0之间，优化后的pH控制在8. 0±0. 5,添 加牛血清白蛋白和叠氮钠的量为0. 1% -0. 5% (质量体积比）。校准品由校准品稀释液稀 释 RBP 蛋白纯品制成，含量为 0mg/L，8. 75mg/L，17. 5mg/L，35mg/L，70mg/L，140mg/L。
[0025] 本发明中采用胶体金匀相免疫比色法测定样本中的RBP蛋白的含量。标记有颗 粒均一，大小合适金颗粒的RBP抗体，与样本中的RBP蛋白，在缓冲液中形成RBP蛋白-抗 体-金具有三维结构的复合物，从而使原本金颗粒在540nm的吸光度减弱，并且在660nm处 的吸光度加强，通过将这种改变与校准品中已知的RBP蛋白浓度相对应，进而形成检测系 统的校准曲线，当未知RBP蛋白浓度的体液样本以同样的反应模式与标记物反应时，通过 计算上述吸光度的改变，对应校准曲线从而达到定量测量的目的。
【附图说明】
[0026] 图1本发明试剂与对照试剂线性验证结果，以稀释度为横坐标，以检测结果为纵 坐标作图，本发明试剂具有优于同类检测项目试剂盒线性的特点。
[0027] 图2本发明试剂与对照试剂校准曲线实验结果，样本中RBP蛋白含量每变化一个 浓度单位，本发明试剂的吸光度信号变化为对照试剂的约2. 5倍，本发明灵敏度明显优于 对照试剂。
[0028] 图3标记物沉降检测实验结果，本发明试剂标记物在40天内未发生明显沉降。
【具体实施方式】
[0029] 实施例
[0030] 本发明中若不做特殊说明，则表述含量的百分比浓度均表示质量体积比，即 g/100mL
[0031] 实施例1
[0032] RBP校准品的制备
[0033] 用重组人RBP蛋白（市售）溶于校准品稀释液（牛血清白蛋白0.5%，叠氮钠 0. 1%，PBS缓冲液pH 8. 0)制备出不同浓度梯度的校准品，采用九强RBP胶乳免疫比色试 剂盒检测配制校准品，每个浓度梯度检测3次，取检测结果的平均值，定值为Omg/L (校准品 稀释液，未添加 RBP 蛋白），8. 75mg/L，17. 5mg/L，35mg/L，70mg/L，140mg/L。
[0034] 反应缓冲试剂（试剂1)的制备
[0035] 取 80mL 50mM PBS pH8. 0 的缓冲液中加入 PEG6000-200005g，聚蔗糖-4001g，牛血 清白蛋白〇. 5g，叠氮钠0. lg，最终用相应的缓冲液定容至100mL，并用0. 22um微孔滤膜过 滤，即制成反应缓冲试剂（试剂1)，其中PEG6000-200005 %，聚蔗糖-4001 %，牛血清白蛋白 0. 5%，叠氮钠 0. 1%。
[0036] 胶体金标记物试剂（试剂2)的制备
[0037] 胶体金标记物试剂（试剂2)的制备过程主要分为三部分，即标记物制备，空白缓 冲液的制备，标记物的复悬三个步骤。
[0038] 标记物的制备
[0039] 将市售的氯金酸和柠檬酸三钠溶解，并分别配制成1 %的水溶液，将1L的去离子 水或超纯水煮沸，接着加入10mL的氯金酸溶液保持沸腾约lmin后，加入10mL的柠檬酸三 钠溶液，随着时间的变化溶液再次沸腾，溶液颜色随之由明黄色转变为紫黑色，接着短时间 转为酒红色，之后保持沸腾lOmin后，冷却备用。
[0040] 将制备好的的胶体金溶液用浓度为20 % 1(20)3溶液调整pH值至8. 0后，按比例加 如一定体积的RBP抗体（市售），充分搅拌lh，即完成抗体的标记过程。
[0041] 抗体标记完成以后，可用10% NaCl溶液检查标记量是否合适，当按照1 : 10的体 积比例加入NaCl溶液后，当不出现黑色沉淀时的抗体最小用量，为最佳标记量。
[0042] 标记物空白缓冲液的制备
[0043] 取 80mL 50mM PBS pH8. 0 的缓冲液中加入 PEG6000-2000020g，聚蔗糖-400 5g，牛血清白蛋白0. 5g，叠氮钠0. lg，吐温201g，TritonX-100 lg，最终用相应的缓 冲液定容至100mL，并用0. 22um微孔滤膜过滤，即制成反应缓冲试剂（试剂1)，其中 PEG6000-2000020 %，聚蔗糖-4005 %，牛血清白蛋白0? 5 %，叠氮钠0? 1 %，吐温20 1 %， Triton X-100 1%〇
[0044] 标记物复悬
[0045] 将标记好的胶体金颗粒在6000rpm下离心40min，收集沉淀，之后用上述标记物空 白缓冲液复悬收集的沉淀，并将浓度按照本发明的权利要求（4)将标记物调整至合适的浓 度即可。
[0046] 线性验证
[0047] 1、取一例具有急性肾损伤表象的临床病人血清样本约2mL，向其中加入人源的 RBP蛋白纯品，制得一线性高值样本。
[0048] 2、选用市场上技术较为成熟的RBP蛋白胶乳微球比浊法试剂盒做对照试剂，在东 芝120FR全自动生化仪上录入胶乳比浊法对照试剂盒参数，并用其试剂盒配套校准品校准 其试剂，检测上述高值样本三次，已三次检测结果的均值130. 27mg/L为最终定值结果。
[0049] 3、在东芝120FR全自动生化仪上，录入本发明的实验参数，并用已经校正的校准 品经行试剂校准。
[0050] 4、将上述的线性高值样本用生理盐水做倍比稀释，稀释比例为1/2,1/4,1/8， 1/16,1/32,1/64,与原线性高值样本组成一个梯度样本组。
[0051] 5、用上述对照试剂和本发明的试剂分别检测上述样本，每个试剂每个样本检测三 次，以三次结果均值最终的检测结果，然后比较本发明和再对照试剂的线性，结果表1和图 1所示。
[0052] 表1线性验证结果
[0054] 表1为线性实验结果数据统计，在本发明和对照试剂盒的检测范围内，将高值样 本倍比6次稀释，用对照试剂和本发明试剂分别检测
[0055] 分析灵敏度验证
[0056] 1、选用市场上技术较为成熟的RBP蛋白胶乳微球比浊法试剂盒做对照试剂，在东 芝120FR全自动生化仪上录入胶乳比浊法对照试剂盒参数，并用其试剂盒配套校准品校准 其试剂。
[0057] 2、在东芝120FR全自动生化仪上，录入本发明的实验参数，并用已经校正的校准 品经行试剂校准。
[0058] 3、比较两个试剂在200mg/L以下浓度的校准点吸光度的变化，结果如表2和图2 所示。注：由于对照试剂与本发明试剂的检测原理不相同，所以在绘制图2时将对照试剂吸 光度变化做相反数处理。
[0059] 表2分析灵敏度实验结果
[0060]
[0061] 表2为分析灵敏度实验结果数据统计，实验样分析本发明试剂和对照试剂分析灵 敏度，
[0062] 标记物沉降监测
[0063] 由于标记物溶液为胶体溶液，所以在长时间静止放置后应验证其是否发生颗粒沉 降现象。本例目的在于验证本发明是否会存在标记物沉降现象。
[0064] 1、取两只50mL烧杯，用酸性重铬酸钾浸泡24小时后，用去离子水清洗干净，100°C 烘干处理4h。
[0065] 2、将对照试剂盒中的标记物试剂倒入其中一只烧杯中，将本发明试剂标记物倒入 另一只烧杯中，两只烧杯同时搅拌lh。
[0066] 3、用微量移液器在溶液表面2-5mm处分别吸取对照试剂和本发明试剂各60uL，并 用去离子水稀释只至3mL，震荡混合均匀。
[0067] 4、以去离子水作为参比，在540nm处检测两试剂标记物稀释后的吸光度，每个试 剂检测三次，以三次结果的均值，作为最终检测结果。
[0068] 5、将上述两只烧杯封口，2_8°C下静置每隔10天检测一次，重复上述步骤3和步骤 4,对比静置前后吸光度变化，实验结果如表3和图3所示。
[0069] 表3标记物沉降监测实验结果
[0070]
[0071] 标记物对反应杯污染实验
[0072] 由于标记物溶液为金颗粒胶体溶液，所以会在反应杯表面存在吸附现象。本例在 于验证本发明试剂是否会出现吸附污染现象。
[0073] 取三只洁净的石英比色杯，以空气为参比，分别记录其在540nm处杯空白吸光度。
[0074] 1、用本发明试剂标记物装填比色杯至其3/5高度处，浸泡lh。
[0075] 2、取出标记物后，每只比色杯用去离子水反复清洗10次
[0076] 3、在每只比色杯中装填去离子水至比色杯4/5高度处，每隔lh换水一次，共换水 三次。
[0077] 4、自然晾干比色杯中的水分，以空气为参比，检测每只比色杯在540nm处吸光度。
[0078] 5、对于对照试剂标记物重复上述步骤1至步骤5操作，比较两试剂标记物是否会 对比色杯造成吸附污染，实验结果如表4所示。
[0079] 表4标记物对比色杯污染实验数据
[0080]
[0081] 根据实验结果分析，对照试剂标记物长时间放置于比色杯中会吸附至比色杯表 面，本发明试剂标记物在相同时间内未对比色杯有明显的吸附现象。
【主权项】
1. 一种RBP检测胶体金匀相免疫检测试剂盒，包括RBP校准品，反应缓冲液试剂，胶体 金标记物试剂，其特征在于一种匀相定量检测检体中RBP含量的基于胶体金比色法的体外 诊断试剂。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于RBP校准品是由校准品稀释液和RBP蛋 白按照比例配制成不同浓度梯度，其浓度范围为0mg/L-140mg/L，反应缓冲液试剂是由磷酸 盐与牛血清白蛋白配制具有pH缓冲能力的溶液，胶体金标记物试剂是由金标记的抗人源 RBP蛋白的抗体和悬浮标记物的缓冲液组成。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于胶体金颗粒的主吸收峰为450nm± 10nm。4. 根据权利要求1-3所述的试剂盒，其特征是反应缓冲液试剂是反应条件的控制性溶 液，包括50mM PBS pH8. 0溶液，PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白等多聚物或生 物大分子中的一种物质或两种及其以上，并且控制反应缓冲液试剂的PH值为7. 0-9. 0。5. 根据权利要求1-3所述的试剂盒，其特征是胶体金标记物试剂是反应条件的控制 性溶液，包括50mM PBS pH8. 0溶液，PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐温20,牛血清白蛋白和 Triton X-100等多聚物或生物大分子中的一种物质或两种及其以上，将标记RBP抗体后的 金颗粒悬浮于此溶液中，并且控制pH值应在7. 0-9. 0之间，组成胶体金标记物试剂。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于中标记RBP抗体的金颗粒浓度合格的 依据为离子水或超纯水稀释胶体金标记物试剂50倍后，以去离子水或超纯水做空白，其在 540nm± IOnm 处的吸光度的范围为 0. 2000Abs-0. 3000Abs。7. 根据权利要求6所述，试剂盒其特征在于反应体系溶液组成为校准液或样本、反应 缓冲液试剂和胶体金标记物试剂，其中样本量范围为2uL-20uL，反应缓冲液试剂的体积应 控制在2-10倍于胶体金标记物试剂的体积。8. 制备权利要求1-7任意一项所述的试剂盒，其特征是RBP蛋白胶体金匀相检测试剂 盒的制备方法，包括以下几个步骤： 1) 将多聚物或生物大分子用去离子水或超纯水溶解，配制成反应缓冲液试剂。 2) 将氯金酸与还原剂按照一定比例混合，随之用去离子水或超纯水加热煮沸，制的主 吸收峰为450nm±10nm的胶体金颗粒。 3) 将待标记的RBP抗体与金颗粒相混合制成标记RBP抗体-金标记物。 4) 将制成的标记物与不含有金颗粒的胶体金标记物试剂按照一定比例混合，制成检测 试剂盒所需要的胶体金标记物试剂 5) 将市售的人源RBP蛋白按照所需浓度梯度，用校准品稀释液配制成浓度在Omg/ L-140mg/L范围内的校准品，用于在仪器上配合反应缓冲液试剂和胶体金标记物试剂形成 校准曲线，以达到定量检测的目的。
【文档编号】G01N33/68GK105891501SQ201510144082
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年3月31日
【发明人】郭成志, 王志新
【申请人】北京科美生物技术有限公司