一种表面展示pedv核心抗原coe蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法
【专利摘要】本发明涉及动物生物医药工程领域，具体公开了一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。本发明采用酵母α凝集素表面展示系统来表达PEDV的抗原核心基因COE基因，使COE蛋白锚定在酵母的细胞壁上，提供一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。该重组毕赤酵母可制备成具有良好产业化前景的新型疫苗产品，随着这些疫苗的推广应用，对养猪业危害严重的病毒性腹泻的预防起到积极的作用，对保护和促进养猪业健康发展具有重要的实践意义，同时亦将取得显著的社会经济效益，拥有广大的市场并具备产业化的前景。
【专利说明】—种表面展示PEDV核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物生物医药工程领域，特别是一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。
【背景技术】
[0002]自2010年10月份以来，仔猪腹泻病的发生与流行在国内主要养猪省份均呈持续上升趋势，也是引起7日龄以内仔猪死亡的重要原因，短短一年多，以广东省为首的南方10个省市仔猪死亡量超过了 100万头，发病率为60%-100%，死亡率高达80%-100%，严重威胁着养猪业的健康发展，造成了巨大的经济损失。猪流行性腹?写病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)是国内外学者较为认同的主要致病因素之一。目前防止猪病毒性腹泻的最为有效的手段是接种疫苗。虽然国内用于流行性腹泻的疫苗主要有:PEDV与TGEV二联疫苗(包括二联灭活苗及二联活疫苗)得到了广泛的推广和应用，在一定范围和程度上减少了病毒性腹泻的发病率，但仍然未能完全控制，尤其在2010年10月至今，该病呈持续性、爆发性增长趋势。从目前国内外对PEDV、TGEV和RV的研究结果及应用效果看，仔猪主要通过初乳获得母源slgA，产生对冠状病毒性腹泻的被动免疫保护，血清中的循环抗体IgG不能提供保护，经非肠道免疫不能产生母源免疫。因此，迫切需要研制出安全、有效、廉价并且可以诱导黏膜免疫的新型PEDV 口服疫苗。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于为了克服现有技术中PEDV疫苗存在的上述缺陷，提供一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。
[0004]为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的:
一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法，以α凝集素作为靶基因将COE蛋白锚定在酵母细胞壁上，具体方法如下:
51.pPICZ a A-COE-AGa重组质粒的制备:将凝集素AGa基因片段和pPICZ a载体通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ a A-AGa ;将COE基因片段和重组质粒pPICZ a A-AGa通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ a A-COE-AG a ;所述凝集素AG a基因片段和COE基因片段的序列如SEQ IDNO:广2所示；
52.采用电转化法将pPICZa A-COE 一 AG a重组质粒导入毕赤酵母X33中，获得重组酵母 PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG a。
[0005]优选地，S2所述电转化法为:取80 μ L毕赤酵母感受态细胞，与5~10 μ g线性化的重组质粒pPICZ a A-COE-AG a混合，冰浴15min，在电压1500V，电容量25 μ F，电阻200 Ω条件下电击，电击后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇，30°C下孵育I~2小时，平板筛选高拷贝转化子。
[0006]优选地，凝集素AG a基因片段的扩增用引物序列如SEQ ID NO:3~4所示，COE基因片段的扩增用引物序列如SEQ ID NO:5~6所示。
[0007]由以上方法制备得到的重组酵母PicAiaX-33/pPICZ a A-COE-AG α。
[0008]所述重组酵母pastor I s X-33/pPICZ a A-COE-AG α在制备预防猪流行性腹泻口服疫苗中的应用。
[0009]一种预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法，包括如下步骤:
51.将重组酵母PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG α 接种于 YPD 液体中，30°C >250 r/min振荡培养过夜；再接种于BMGY体培养基中，30°C振荡培养24 h，至菌体OD6tltol达到2~6时离心弃去上清，加入BMMY液体培养基，连续诱导培养72 h ；
52.离心去上清，将菌体用用悬浮缓冲液稀释得到细菌含量为IXIOkiCFU/mL的菌悬液，菌悬液再制备成口服疫苗，直接灌喂；所述悬浮缓冲液组成为:0.2 mol/L NaHCO3, 5%水解酪蛋白，0.5%葡萄糖悬浮。
[0010]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明采用酵母α凝集素(a-agglutinin)表面展示系统来表达PEDV的抗原核心基因COE基因，并使COE蛋白锚定在酵母的细胞壁上，提供一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。本发明同时使用其他类型的酵母锚定蛋白来使COE蛋白锚定在酵母细胞壁上，但是结果发现使用α凝集素作为PEDV抗原核心基因COE的锚定蛋白，可以较牢固地将COE锚定在细胞表面，不会轻易地从细胞表面脱落，而且α凝集素可以与COE蛋白序列的C端有效融合而不影响COE蛋白的结构和功能。而使用其他的锚定蛋白，效果都不好，如a凝集素。a凝集素包括由AGAl编码的核心亚基和由AGA2编码的小结合亚基组成，亚基之间通过二硫桥相连，将COE蛋白的N端或C端展示在酵母表面，容易从酵母细胞壁上脱落，泄露到培养基中。
[0011]作为一种真核表达系统，酵母表面展示系统具有以下优点:(I)、展示的蛋白具有天然构象；(2)1个细胞中可以展示来自于I种或多种致病细菌的抗原蛋白质；(3)安全，表达的外源蛋白无需经过纯化，可以连同菌体一起服用。目前国内外还未见将酵母展示技术用于展示猪流行性腹泻病毒的核心抗原COE蛋白。
[0012]本发明与市场已有疫苗相比，在肠黏膜、粪便、泪液中产生SlgA数量及抗体维持时间上有优势；酵母属于真核表达系统，表达出来的重组蛋白更接近于天然蛋白，有利于重组COE蛋白活性的保持；更加安全、廉价，适合于在畜牧生产中进行应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1.重组载体pPICZ a A-COE-AG α双酶切鉴定鉴定结果；Μ.DL2000 DNAMarker ； 1.pPICZ a A-COE-AG a EcoR I ,Kpn I 双酶切鉴定。
[0014]图2.重组毕赤酵母PicAiaX-33/pPICZ a A-COE-AG a PCR鉴定结果；M.DL2000 Marker; 1.重组毕赤酵母AGa PCR鉴定；2.AGa阳性对照；3.重组毕赤酵母COE PCR鉴定；4.COE阳性对照。
[0015]图3.重组 PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG a 的诱导表达结果；M.蛋白 marker 1.Pichia pas tor is X-33 空白对照；2.Pichia pas tor is X-33/pPICZ a A 空白对照；3.2%甲醇诱导重组酵母表达96h ；4.3%甲醇诱导重组酵母表达96h。
[0016]图4.毕赤酵母细胞壁蛋白免疫印迹；1.PicAia pas tor is X-33细胞壁蛋白免疫印迹(空白对照)；2.paWoris X-33/pPICZ a A细胞壁蛋白免疫印迹(空白对照)；
3.3%甲醇诱导重组酵母细胞壁蛋白免疫印迹。
[0017]图5.重组 PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG α 的显微镜免疫荧光检测。【具体实施方式】
[0018]下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本【技术领域】常规试剂和设备。
[0019]实施例1
S1.α凝集素表面展示型重组质粒pPICZ a A- COE-AG α的构建Sll.α凝集素基因AGa和猪流行性腹泻病毒COE基因上游引物、下游引物的设计过程:参照GenBank中注册的α凝集素基因cDNA基因和PEDV COE基因的序列设计而成，上游引物设计在该基因起始端，同时根据表达载体pPICZ a A上的酶切位点，AGa基因上游引物设计时添加了治7/7 I酶切位点及在式? I酶切位点前加有3个保护性碱基CGG ;下游引物设计在基因末端，并加上油3 I酶切位点，在油3 I酶切位点位点前加有3个保护性碱基TGC ；C0E基因上游引物设计时添加了及^7? I酶切位点及在及^7? I酶切位点前加有3个保护性碱基CCG ;下游引物设计在基因末端，并加上式? I酶切位点，在治μ I酶切位点位点前加有3个保护性碱基CGG。所设置的AG α基因和COE基因上游引物、下游引物分别为，AGa上游引物:
5? CGGGGTACCTATCAGGGTCGGAACCTC -3? {Κρη I 酶切位点)
AGa下游引物:
5’ - GCACGTAGTCTAGATCATTAGAATAGCAGGTACGACAA-3’ {Xba I 酶切位点)
COE上游引物:
5’ - CCGGAATTCGTTACTTTGCCATCCTTCAACGATC-3’ (.EcoR I 酶切位点)
COE下游引物:
5’ - CGGGGTACCAACATCAGTAACACCTTGAAGTGGC-3’ (Kpn I 酶切位点)。
[0020]S12.AGa基因片段的PCR扩增过程:以提取酿酒酵母Inscl基因组为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、AG α上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为:10XPCRBuffer (包含 0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris.HC1，0.001% 明胶)5 μ L，4父(1见1^(包含(^了？，dTTP, dCTP, dGTP 各 2.5mmol/L)4 μ L，浓度均为 20 μ mol/L 的 AG α上、下游引物各I μ L，模板为酿酒酵母Inscl基因组I μ L，ddH20 (双蒸水)37.5 μ L，浓度为5ymol/L的ExTaq DNA聚合酶(λ 5 μ L，反应过程依次为:a、94°C处理5min ;b、依次94°C处理30s、58°C处理30s、72°C处理30s ;反应过程进行30个循环；c、72°C延伸IOmin ;即获得AGa基因的PCR产物，AGa基因的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见大小约990bp的扩增条带，与预期的结果一致。
[0021]S13.COE基因片段的PCR扩增过程:以提取重组质粒pCMV_C0E为模板，该质粒由华南农业大学动物科学院家禽研究室魏钟艳获得保存，加入ExTaq DNA聚合酶、COE上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为:10XPCR Buffer (包含0.5mmol/L MgCl2,50mmol/L KCl，10mmol/L Tris.Η(:1，0.001% 明胶)5 μ L，4Χ dNTPs(包含 dATP, dTTP, dCTP,dGTP各2.5mmol/L)4 μ L，浓度均为20 μ mol/L的COE上、下游引物各I μ L，模板为 I μ L，ddH20 (双蒸水)37.5 μ L，浓度为5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反应过程依次为:
a、94°C处理5min ;b、依次94°C处理30s、60°C处理30s、72°C处理30s ;反应过程进行30个循环；c、72°C延伸IOmin ;即获得COE基因的PCR产物，COE基因的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见大小约420bp的扩增条带，与预期的结果一致。
[0022]S14.重组质粒pPICZ a A-AG α的构建:将过程S2的AG α基因的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE (TE包含有lOmmol/L Tris -HCl,lmmoI/L EDTA)溶解，TE溶解物用油al、治wl进行双酶切处理，胶回收大小约990bp的条带；以同样的方法对pPICZ a A质粒进行双酶切处理，胶回收大小约3.6kb的DNA片段，分别取5μ L双酶切后胶回收的AGa基因片段和3μ L双酶切后胶回收的pPICZ a A质粒，加入I μ L 的 10ΧΤ4 DNA 连接 Buffer (10XT4 DNA 连接 Buffer 包含有 0.5mol/L Tris.HCl，
0.lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT,5mmol/L ΑΤΡ,Ο.25mg/mL BSA), I μ L T4 DNA 连接酶，在16°C下连接处理18小时，将连接产物转化疋co/i Dh5a感受态细胞，在含有25 μ g/mLZeocin的低盐LB琼脂培养板中，37°C培养过夜，即完成重组质粒pPICZ a A-AGa的构建。Zeocin、pPICZ a A 质粒为 Invitrogen 公司的产品。
[0023]S15.重组质粒pPICZ a A-COE-AG α的构建:将过程S3的COE基因的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE (TE包含有lOmmol/LTris.HCl, lmmol/L EDTA)溶解，TE溶解物用EcoKUKpnl进行双酶切处理，胶回收大小约420bp的条带；以同样的方法对S14构建的pPICZ a A-AGa质粒进行双酶切处理，胶回收大小约4.6kb的DNA片段，分别取5 μ L双酶切后胶回收的COE基因片段和3 μ L双酶切后胶回收的 pPICZ a A-AGa 质粒，加入 IyL 的 10XT4 DNA 连接 Buf fer (10XT4 DNA 连接 Buffer 包含有 0.5mol/L Tris.HCl，0.lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT,5mmol/L ATP，0.25mg/mL BSA), I μ L T4 DNA连接酶，在16°C下连接处理18小时，将连接产物转化万.Dh5a感受态细胞，在含有25 μ g/mL Zeocin的低盐LB琼脂培养板中，37°C培养过夜，即完成重组质粒pPICZ a A-COE-AG α的构建。
[0024]S2.含COE基因的表面展示型毕赤酵母重组转化子的筛选
S21.重组质粒的提取和线性化:挑取转化入重组质粒pPICZ a A-COE-AG α的疋Dh5a阳性菌接种于25 mL含25 μ g/mL Zeocin的低盐液体LB培养基中，37°C，220 rpm振摇培养24 h。将菌液于4°C，5 OOOrpm离心10 min，沉淀细菌。然后用质粒DNA抽提试剂盒抽提质粒。用I酶将抽提的重组质粒pPICZ a A-COE-AG α线性化。
[0025]S22.毕赤酵母电转化感受态细胞的制备:接种毕赤酵母宿主菌X33单菌落至5mLYPD (含1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)培养基中，30°C过夜培养。然后接种0.1~
0.5mL过夜培养菌液到500mL新鲜YPD培养液，30°C培养，使OD600nm达到1.2~1.3。4°C 3000r/m离心5min,弃上清；依次以500mL、250mL冰浴灭菌水及20mL冰冷lmol/L山梨糖醇重悬菌体洗漆，4°C 3 000r/m离心5min,离心3次；最后将细胞重悬于ImL冰浴灭菌的Imol/L山梨糖醇，即为感受态的酵母细胞。
[0026] S23.毕赤酵母的电击转化:取80 μ L准备好的毕赤酵母感受态细胞，与5~10 μ g线性化的重组质粒pPICZ a A-COE-AG α混合，转移到冰浴的的0.2cm电转杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因导入仪进行电击转化，电脉冲参数为电压1500V，电容量25 μ F，电阻200 Ω。电击后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇到电转化小杯中，将小杯内悬液转移到一个灭菌的15mL的试管中，将试管在30°C下孵育I~2小时，取10、25、50、100与200uL分别铺到含有100 μ g/mL Zeocin YPDS (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，IM山梨糖醇，20g琼脂粉)平板上以筛选高拷贝转化子，30°C孵化平板疒3d至出现乳白色的酵母转化菌落即为含COE基因的表面展示型毕赤酵母重组转化子。
[0027]S24.毕赤酵母转化子的PCR鉴定:抽提转化的酵母基因组DNA，以其为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、COE和AG α基因上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为:IOXPCR Buffer(包含0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris.HCl，0.001% 明胶)5 μ L，4 X dNTPs (包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各 2.5mmol/L) 4 μ L，浓度均为 20 μ mol/L的COE和AG α上、下游引物各I μ L，模板为抽提转化的酵母基因组DNA I μ L，ddH20 (双蒸水)37.5 μ L，浓度为5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反应过程依次为:a、94°C处理3min ;b、依次94°C处理30s、56°C处理30s、72°C处理30s ;反应过程进行30个循环；c、72°C延伸IOmin ;PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约420bp和990bp的扩增条带，即表明所抽提的酵母为阳 性酵母转化子。
[0028]S3.含COE基因的表面展示型毕赤酵母重组转化子体外诱导表达过程:挑取经鉴定的阳性转化子接种于3 mL YPD液体中，30°C、250 r/min振摇培养过夜；再接种于50 mLBMGY (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，lmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%YNB (无酵母氮源)，4X10-5 %生物素，1%甘油)体培养基中，30°C振荡培养24 h，至菌体OD6tltol达到2~6时离心弃去上清，加入25 mL BMMY液体培养基(1%酵母抽提物，2%蛋白胨，lmol/L磷酸钾缓冲液(ρΗ6.0)，1.34%ΥΝΒ(无酵母氮源)，4Χ 10-5 %生物素，0.5%甲醇)，连续诱导培养72 h。培养至72h收集样品，离心，去上清进行提取重组菌细胞壁总蛋白，经SDS-PAGE电泳，结果显示诱导培养后的菌体蛋白与未诱导的对照组相比，有一条大小约55kD的蛋白表达条带。经western blotting免疫印迹和突光显微镜分析,表明目的基因已经得到表达在毕赤酵母细胞壁表面上，并且具有一定的免疫活性。
[0029]本发明所使用的限制性内切酶治7/7 !,EcoR l.Pme 1、T4DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶等均购自广州宝泰克生物科技有限公司。菌株X_33、Zeocin抗生素、pPICZ a A质粒为Invitrogen公司的产品。
[0030]实施例2
一种预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法，包括如下步骤:
S1.挑取经鉴定的阳性转化子接种于3 mL YPD液体中，30°C、250 r/min振摇培养过夜；再接种于50 mL BMGY (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，lmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，
1.34%YNB (无酵母氮源)，4X10_5 %生物素，1%甘油)体培养基中，30°C振荡培养24 h，至菌体OD6tltlnm达到2~6时离心弃去上清，加入25 mL BMMY液体培养基(1%酵母抽提物，2%蛋白胨，lmol/L磷酸钾缓冲液(ρΗ6.0)，1.34%ΥΝΒ (无酵母氮源)，4Χ 10_5 %生物素，0.5%甲醇)，连续诱导培养72 h。
[0031]S2.培养至72h收集样品，离心，去上清，将重组酵母菌用悬浮缓冲液(0.2 mol/LNaHCO3, 5%水解酪蛋白，0.5%葡萄糖悬浮)稀释得到细菌含量为I X IO10 CFU/mL重组酵母菌悬液，菌悬液再制备成口服疫苗，直接灌喂。
[0032]重组酵母菌悬液的使用方法:为初步研究重组菌是否能够诱导黏膜免疫，采用60只7周龄的BALB/c小鼠随机分为3组饲养，每组20只，第I组为PBS对照，第2组免疫重组酵母菌悬液(即口服疫苗)，第3组免疫PEDV+TGEV 二联弱毒苗。采用灌胃或腹腔注射的方式免疫，分别于第1、14和28天进行口服免疫，每次连续免疫三天，剂量为0.2mL/只。于免疫前及初次免疫后第7、14、28、35、42、50、60天每组随机选择2只小鼠，采集血清、肠黏膜、泪液、粪便样品，用PEDV全病毒做抗原，ELISA检测样品中分泌型IgA (slgA)水平。
[0033]ELISA方法检测结果表明:免疫重组菌后肠道、粪便、泪液中均能产生slgA，实验组(重组酵母菌悬液)中肠黏膜在免疫后第14天即能检测到较高的slgA水平，达到抗体高峰，显著高于对照组(PBS组)(P < 0.05)。且在免疫后第50天和第60天出现了第二次抗体水平峰值，显著高于对照组(PBS组)(P <0.05)。初步证实该重组菌悬液可以诱导小鼠产生黏膜抗体，为开发新型口服疫苗预防PED提供理论基础。
[0034]对比例I
本发明同时使用其他类型的酵母锚定蛋白来使COE蛋白锚定在酵母细胞壁上，但是结果发现使用α凝集素作为PEDV抗原核心基因COE的锚定蛋白，可以较牢固地将COE锚定在细胞表面，不会轻易地从细胞表面脱落，而且α凝集素可以与COE蛋白序列的C端有效融合而不影响COE蛋白的结构和功能。而使用其他的锚定蛋白，效果都不好，如a凝集素。a凝集素包括由AGAl编码的核心亚基和由AGA2编码的小结合亚基组成，亚基之间通过二硫桥相连，将COE蛋白的N端或C端展示在酵母表面，容易从酵母细胞壁上脱落，泄露到培养基中。
【权利要求】
1.一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法，其特征在于，以α凝集素作为靶基因将COE蛋白锚定在酵母细胞壁上，具体方法如下: .51.pPICZ a A-COE-AGa重组质粒的制备:将凝集素AGa基因片段和pPICZ a载体通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ a A-AGa ;将COE基因片段和重组质粒pPICZ a A-AGa通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ a A-COE-AG a ;所述凝集素AG a基因片段和COE基因片段的序列如SEQ IDNO:广2所示； .52.采用电转化法将pPICZa A-COE 一 AG a重组质粒导入毕赤酵母X33中，获得重组酵母 PicAia X-33/pPICZ a A-COE-AG a。
2.根据权利要求1所述重组毕赤酵母菌的制备方法，其特征在于，S2所述电转化法为:取80 μ L毕赤酵母感受态细胞，与5~10 μ g线性化的重组质粒pPICZ a A-COE-AG a混合，冰浴15min，在电压1500V，电容量25 μ F，电阻200 Ω条件下电击，电击后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇，30°C下孵育1~2小时，平板筛选高拷贝转化子。
3.根据权利要求1所述重组毕赤酵母菌的制备方法，其特征在于，凝集素AGa基因片段的扩增用引物 序列如SEQ ID NO:3~4所示，COE基因片段的扩增用引物序列如SEQ ID NO:.5~6所示。
4.权利要求1至3任一项所述方法制备得到的重组酵母/7ZcAiapas tor is X-33/pPICZa A-COE-AG a。
5.权利要求4所述重组酵母Z7ZcAiapastoris X-33/pPICZ a A-COE-AG a在制备预防猪流行性腹泻口服疫苗中的应用。
6.一种预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: . 51.将重组酵母PicAia pastoris X-33/pPICZ a A-COE-AG a 接种于 YPD 液体中，.300C >250 r/min振荡培养过夜；再接种于BMGY体培养基中，30°C振荡培养24 h，至菌体.OD6tltol达到2~6时离心弃去上清，加入BMMY液体培养基，连续诱导培养72 h ； .52.离心去上清，将菌体用用悬浮缓冲液稀释得到细菌含量为IXIOkiCFU/mL的菌悬液，菌悬液再制备成口服疫苗，直接灌喂；所述悬浮缓冲液组成为:0.2 mol/L NaHCO3, 5%水解酪蛋白，0.5%葡萄糖悬浮。
【文档编号】C12R1/84GK103952432SQ201410192205
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】马静云, 袁尧, 胡文锋, 李智丽, 曾喜多, 孙宝丽, 毕英佐 申请人:华南农业大学